劉海波，王楠，劉洪周，陳鐵柱，李建昌

（云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500）

引 言

微生物電解池（microbial electrolysis cell，MEC）是利用微生物催化的陽(yáng)極降解有機(jī)廢棄物或廢水，并產(chǎn)生電子和質(zhì)子，在電解電壓作用下，電子經(jīng)外電路遷移至陰極，而質(zhì)子在電遷移、對(duì)流和擴(kuò)散作用下經(jīng)本體溶液遷移至陰極，質(zhì)子在陰極被還原而產(chǎn)生氫氣，為生產(chǎn)氫氣提供一種可持續(xù)的方式[1-2]。目前，MEC 耦合厭氧消化（anaerobic digestion，AD）可促進(jìn)甲烷轉(zhuǎn)化率、提高沼氣品質(zhì)，在厭氧消化領(lǐng)域中是新的發(fā)現(xiàn)[3-4]，因該技術(shù)是在AD 中耦合MEC，所以將MEC-AD 暫稱之為“電化學(xué)厭氧消化”（electro-chemical anaerobic digestion，EAD）。EAD不僅可以減少CO2的排放，而且可提高頑固性化合物、復(fù)雜廢水的降解率和產(chǎn)甲烷的轉(zhuǎn)化率[5-9]。然而，EAD 系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)及活性對(duì)電解電壓的變化較為敏感，Yang 等[10]研究不同陽(yáng)極電位（0、0.2、0.4、0.6 V）對(duì)EAD 陽(yáng)極膜微生物的影響中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)陽(yáng)極電位為0.4 V 時(shí)，陽(yáng)極生物膜有較高的電活性和胞外電子傳遞效率。因此，對(duì)于復(fù)雜的非線性的EAD 系統(tǒng)而言，為EAD 提供適合的電解電壓是提高系統(tǒng)運(yùn)行性能的關(guān)鍵因素[11]，但電解電壓如何影響微生物的生理代謝，進(jìn)而影響相關(guān)酶的活性尚不清楚。

厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的本質(zhì)是產(chǎn)甲烷微生物利用胞內(nèi)的酶或者輔酶將簡(jiǎn)單的甲基化合物和二氧化碳轉(zhuǎn)化成甲烷的過(guò)程。氧化型輔酶Ⅰ[系統(tǒng)名稱為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)]是生物代謝所必需的輔酶，對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)至關(guān)重要，在微生物生長(zhǎng)代謝中，NAD 參與氧化還原反應(yīng)，將電子從一個(gè)反應(yīng)攜帶到另一個(gè)反應(yīng)[12]。CoI 作為氧化還原酶催化的氧化還原反應(yīng)在新陳代謝的所有部分都至關(guān)重要，但這些反應(yīng)的一個(gè)特別重要的功能是使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)能夠釋放儲(chǔ)存在相對(duì)較弱的氧雙鍵中的能量[13]，為細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖提供能量基礎(chǔ)。磷酸轉(zhuǎn)乙?；福≒TA）在發(fā)酵厭氧菌中無(wú)處不在，在乙酸代謝中起著不可或缺的作用。它可以催化乙?；鶑囊阴Ａ姿岬紺oA 的可逆轉(zhuǎn)移，形成乙酰輔酶A 和磷酸鹽[14]。乙酸激酶（AK）通過(guò)在ATP 和二價(jià)陽(yáng)離子存在下磷酸化乙酸來(lái)促進(jìn)乙酰輔酶A 的產(chǎn)生。AK 與PTA 一起催化乙酸鹽和乙酰輔酶A 相互轉(zhuǎn)化，通過(guò)AK 所產(chǎn)生的乙酸在碳循環(huán)中被細(xì)菌作為碳和能量的來(lái)源。然而，乙酸幾乎是所有發(fā)酵微生物的產(chǎn)物，反過(guò)來(lái)又可作為乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)底物。

因此，在EAD 反應(yīng)體系中酶是主導(dǎo)代謝的關(guān)鍵。環(huán)境因子如電解電壓和pH 等是影響微生物代謝活性的變量，而代謝通量分析作為目前研究生物代謝網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的重要方式之一[15-16]，無(wú)疑為EAD 的微生物代謝提供了強(qiáng)有力的分析手段。目前，代謝通量分析（MFA）因分析方法[15]、數(shù)據(jù)處理和評(píng)估方面所涉及的技術(shù)已日趨完善而在代謝工程中廣泛應(yīng)用[15,17]。例如，Gonzalez-Garcia 等[18]利用混合培養(yǎng)的接種物將葡萄糖分解產(chǎn)生H2，建立了比較完整的代謝通量網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算出代謝網(wǎng)絡(luò)的通量。Li 等[19]在微生物發(fā)酵過(guò)程中豐富了Shewanella oneidensis的代謝通量水平，從而提高了電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的NADH∕NAD+的總水平，明顯加快了胞外電子傳遞（extracellular electron transfer，EET）速率。Rafieenia等[20]利用蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖和核糖6 種不同碳源建立了丁酸梭菌代謝網(wǎng)絡(luò)模型，研究了丁酸梭菌發(fā)酵制氫的過(guò)程，并且計(jì)算出了NADH通量是影響H2產(chǎn)生的重要輔助因子。因此，代謝通量分析為量化環(huán)境變量擾動(dòng)下的代謝通量提供了清晰的思路。

為此，本研究利用代謝通量分析法對(duì)EAD 體系的代謝過(guò)程進(jìn)行量化，直觀地展示電解電壓擾動(dòng)后各代謝途徑的通量變化，并結(jié)合微生物群落結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)處的酶活水平揭示電壓擾動(dòng)對(duì)EAD 代謝通量中微生物與關(guān)鍵酶活性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

EAD 裝置由電化學(xué)單元、EAD 發(fā)酵單元、集氣單元組成，如圖1 所示。發(fā)酵罐有效容積為400 ml，由橡膠塞密封，橡膠塞設(shè)有取氣口、排氣口、取樣口及電極插口。陽(yáng)極為石墨電極（30 mm× 30 mm×2 mm），陰極為鉑電極（30 mm×30 mm×0.2 mm），參比電極為飽和Ag∕AgCl電極。設(shè)置電極距離為3.0 cm，并將電極片浸沒(méi)于發(fā)酵液中，電極通過(guò)銅線引出與寬屏無(wú)紙記錄儀（SIN-R7000A，中國(guó)）相連。

圖1 EAD實(shí)驗(yàn)裝置a—電解電流及電壓記錄單元;b—EAD反應(yīng)單元;c—排水集氣單元;1—pH測(cè)定、投料及取樣口;2—取氣口;3—發(fā)酵罐;4—攪拌子;5—恒溫磁力攪拌器;6—寬屏無(wú)紙記錄儀;7—石墨電極;8—鉑電極;9—玻璃三通;10—密封蓋;11—集氣瓶;12—量筒Fig.1 EAD experimental setup a—electrolytic current and voltage recording unit;b—EAD reaction unit;c—drainage gas gathering unit;1—pH determination,feeding and sampling port;2—intake port;3—fermentation tank;4—stirner;5—thermostatic magnetic stirrer;6—broadscreen paperless recorder;7—graphite electrode;8—platinum electrode;9—glass tee;10—sealing cover;11—collector;12—gauge tube

1.2 接種物

接種物來(lái)自云南師范大學(xué)昆明實(shí)驗(yàn)室經(jīng)豬糞厭氧發(fā)酵后的厭氧污泥，其pH 為8.07，TS 為17.11%，VS為10.08%。

1.3 緩沖營(yíng)養(yǎng)液

緩沖營(yíng)養(yǎng)液的成分及配比：NaH2PO4·2H2O（5.54 g·L-1），Na2HPO4·12H2O（23.088 g·L-1），KCl（0.26 g·L-1）和NH4Cl（0.62 g·L-1）。

1.4 微量元素液

微量元素液的成分及配比：Na2WO4·2H2O（0.025 g·L-1），NaCl（1 g·L-1），F(xiàn)eCl2·7H2O（0.072 g·L-1），CuSO4·5H2O（0.01 g·L-1），NiCl2·6H2O（0.024 g·L-1），C6H9NO6（1.5 g·L-1），MgSO4（3 g·L-1），AlK(SO4)2·12H2O（0.01 g·L-1），ZnCl2（0.13 g·L-1），CaCl2·2H2O（0.1 g·L-1），H3BO3（0.01 g·L-1），MnCl2·4H2O（0.6 g·L-1），CoCl2·6H2O（0.1 g·L-1），Na2MoO4（0.025 g·L-1）和復(fù)合維生素（1 ?！-1）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

EAD 實(shí)驗(yàn)組三組平行運(yùn)行。啟動(dòng)時(shí)，反應(yīng)器中接種120.0 g厭氧污泥，100.0 ml緩沖營(yíng)養(yǎng)液，10.0 ml微量元素液，底物加入量為1.0 g 葡萄糖，隨后用蒸餾水將反應(yīng)器的總質(zhì)量定至360.0 g。待發(fā)酵罐密封后，通入氮?dú)? min，施加恒定電壓為1.0 V，并置于30℃恒溫磁力攪拌器中。此后，當(dāng)pH 大于7時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料量為1.0 g葡萄糖。在此條件下培養(yǎng)至擬穩(wěn)態(tài)。

擾動(dòng)階段：培養(yǎng)階段結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵液中底物和代謝產(chǎn)物的濃度。同時(shí)，記下該時(shí)間點(diǎn)為擾動(dòng)的初始點(diǎn)（設(shè)為S點(diǎn)），隨后添加1.0 g葡萄糖，施加電壓擾動(dòng)（0.6、1.0、1.4 V），通過(guò)監(jiān)測(cè)體系中底物的消耗量和代謝產(chǎn)物的生成量，進(jìn)行代謝通量分析。電壓擾動(dòng)僅是為了獲得變化的通量數(shù)據(jù)，不作為電解電壓對(duì)EAD的影響的依據(jù)。

1.6 檢測(cè)分析

采用排水法收集記錄日產(chǎn)氣量。在（105±5）℃下干燥并在（550±10）℃下馬弗爐燃燒1 h后，通過(guò)稱量法測(cè)量污泥的TS 和VS。用pH 分析儀（HAOSHI H-1008A，中國(guó)）每24 h 記錄一次pH。通過(guò)5500 r∕min 離心7 min 獲得樣品消化物的上清液，通過(guò)氣相色譜儀（FULI, GC9790Ⅱ，中國(guó)）對(duì)VFA 進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為KB- FFAP(30 m×0. 32 mm×0. 25 μm)，氣壓設(shè)置為總壓0.3 MPa，柱前壓0. 08 MPa，柱后壓0.06 MPa，氫氣壓0.1MPa，空氣壓0.1 MPa。進(jìn)樣口溫度200℃，柱箱溫度130℃，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度250℃。通過(guò)氣相色譜儀（FULI,GC9790Ⅱ，中國(guó)）對(duì)H2、CH4和CO2含量進(jìn)行分析，進(jìn)樣器溫度為200℃，TCD 檢測(cè)器的溫度是200℃，柱溫是110℃，每次實(shí)驗(yàn)取氣體樣品200 μl，運(yùn)行時(shí)間10 min。葡萄糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定。

1.7 微生物多樣性測(cè)定

測(cè)序前將樣品儲(chǔ)存于-80℃的超低溫冰箱中。采用CTAB∕SDS 法提取樣品總基因組DNA,用1%瓊脂凝膠測(cè)定DNA 濃度和純度，然后使用去離子水稀釋至濃度為l μg∕μl。首先用特異引物擴(kuò)增出不同區(qū)域的16S rRNA基因，其中所有的PCR反應(yīng)均使用15 μl 的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(新英格蘭)、0.2 μg 的正反向引物和約10 ng 的模板DNA。反應(yīng)步驟為：在高溫98℃下變性1 min，再在98℃變性10 s循環(huán)30次，之后50℃退火30 s，最后在適宜溫度72℃下延伸30 s 并保持5 min。將相同體積的IX載液(含SYB green)與PCR 產(chǎn)物混合，在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物按等密度比例混合。然后用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, 德國(guó))對(duì)混合PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。最后使用TruSeq?DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒(Illumina,美國(guó))生成測(cè)序文庫(kù)，在Qubit@2.0 熒光儀(Thermo Scientific)和安捷倫生物分析儀2100 系統(tǒng)上進(jìn)行評(píng)估。最后在Illumina NovaSeq 平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，生成250 bp的配對(duì)端reads。

1.8 酶活性測(cè)定

采用改良的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）方法，以特定抗體為底物，根據(jù)比色定量酶活性[21]。ELISA 的原理是使抗體和酶復(fù)合物相結(jié)合，然后根據(jù)顯色反應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)行定性或定量分析。將抗原或抗體與酶連接形成酶標(biāo)記的抗原或抗體，既保留免疫活性又保留酶活性[22]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，以下成分被用作底物：純化的NADH 酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶(PTA)、乙酸激酶(AK)、輔酶F420（CoF420）（上海濟(jì)寧生物技術(shù)有限公司，中國(guó)）。使用ELISA方法分析上述底物的微生物酶活性[22]。將與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的待測(cè)試酶對(duì)應(yīng)的抗體合并以形成抗體-抗原-酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)徹底洗滌后并添加3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）底物顯色。在HRP 酶的催化下，TMB 變成藍(lán)色，在酸的作用下變成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的酶含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度（OD 值），并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中酶的活性濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 代謝通量分析

通量平衡分析（MFA）是微生物過(guò)程建模和分析代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的最佳通量的一種方法，它可以用于研究環(huán)境變化對(duì)產(chǎn)物生產(chǎn)和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。本研究采用代謝通量分析軟件（Cell Net Analyzer 2019.2）輔助，建立了EAD產(chǎn)甲烷代謝模型并計(jì)算出了相關(guān)代謝通量，如圖2 所示。表1 總結(jié)了該代謝模型中相關(guān)的代謝反應(yīng)式。

表1 EAD產(chǎn)甲烷代謝途徑的反應(yīng)式Table 1 Reaction formula of EAD methanogenesis metabolic pathway

丙酮酸是EAD 產(chǎn)甲烷代謝途徑中重要的代謝節(jié)點(diǎn)，與多種中間產(chǎn)物相聯(lián)系，包括甲酸、乳酸、乙醇和丙酸等多種胞外代謝產(chǎn)物，要想提高EAD 效益，需加快葡萄糖代謝產(chǎn)生丙酮酸的過(guò)程（R1）。EAD產(chǎn)甲烷代謝途徑中，NADH是一種輔助因子，有多個(gè)反應(yīng)涉及到NADH 的生產(chǎn)與消耗。通過(guò)增加NADH 的量可以進(jìn)一步提高氫氣的產(chǎn)率[23]。在本代謝途徑中，R6 是產(chǎn)生NADH 的主要反應(yīng)，提高其產(chǎn)量可以有效促進(jìn)氫氣的產(chǎn)生（R7）；R4 是丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A 的重要反應(yīng)，同樣也是產(chǎn)生終產(chǎn)物CO2的途徑之一。H2的合成主要由糖酵解過(guò)程中合成的丙酮酸的厭氧代謝驅(qū)動(dòng)，其來(lái)源主要有NADH和FdH（R7 和R8）。此外，氫氣產(chǎn)率和乙酸的產(chǎn)率有關(guān)，但在EAD 產(chǎn)甲烷途徑中，氫氣也可以由陰極通過(guò)電子傳遞途徑產(chǎn)生（R37）。甲烷來(lái)源主要有氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷（R26）和噬乙酸型產(chǎn)甲烷(R29)。在實(shí)際過(guò)程中，甲烷的產(chǎn)率也與丁酸和丙酸的混合物有關(guān)[24]，同樣需要對(duì)此進(jìn)行代謝通量的分析。由圖2代謝網(wǎng)絡(luò)可知，乙酸的產(chǎn)生途徑主要有R12、R18、R19、R20 和R21，其通量大小受多個(gè)中間產(chǎn)物的影響。乳酸是EAD 中影響較大的中間產(chǎn)物，因乳酸的生成需消耗一定量的NADH，且乳酸不易分解，會(huì)造成氫氣的產(chǎn)生受限，也會(huì)引起反應(yīng)體系pH 的失衡。厭氧消化是一個(gè)復(fù)雜的微生物代謝過(guò)程，在某些情況下也可能會(huì)產(chǎn)生己酸（R32）、丙醇（R28）和丁醇（R34）等有機(jī)物。

圖2 EAD產(chǎn)甲烷過(guò)程的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of EAD methanogenesis

2.2 電解電壓擾動(dòng)對(duì)EAD產(chǎn)甲烷代謝通量的影響

圖3 顯示了根據(jù)表2 數(shù)據(jù)做出的電壓擾動(dòng)對(duì)EAD 產(chǎn)甲烷代謝通量，該結(jié)果以H2、CO2和CH4為最終產(chǎn)物進(jìn)行討論。電壓擾動(dòng)后，各中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物均發(fā)生顯著變化。在0.6 V 擾動(dòng)下，NADH 通量明顯優(yōu)于1.4 V 電壓擾動(dòng)，且此條件下最終產(chǎn)物甲烷通量達(dá)到0.5222 g，顯著高于1.0 V和1.4 V 下的0.2974 g 和0.3951 g，然而，產(chǎn)H2途徑的通量卻有所降低，說(shuō)明電壓過(guò)低抑制了產(chǎn)氫，但卻增強(qiáng)了產(chǎn)甲烷途徑。0.6 V 和1.4 V 擾動(dòng)下，通過(guò)H2還原CO2產(chǎn)生的甲烷（R26）分別占35%和40%，對(duì)照組為37%，表明電壓擾動(dòng)使得EAD 產(chǎn)甲烷代謝途徑發(fā)生了改變。值得注意的是，EAD 產(chǎn)甲烷系統(tǒng)明顯產(chǎn)生了甲酸，但根據(jù)代謝通量，CH4和H2無(wú)一來(lái)源于甲酸，說(shuō)明EAD 系統(tǒng)中可能沒(méi)有噬甲酸產(chǎn)甲烷菌存在。最終產(chǎn)物H2大多由EAD 中的陰極產(chǎn)生，但在最終產(chǎn)物中，氫氣通量明顯下降，說(shuō)明H2還原為CH4（R26）的途徑較為活躍。此外，在發(fā)酵液中未檢測(cè)到己酸、丙醇和己酸鹽。乙酸可以從R12、R18、R19、R20 和R21 中得到，其通量大小受多個(gè)中間產(chǎn)物的影響，但在電壓擾動(dòng)（0.6 V 和1.4 V）下，其通量明顯增大，其中0.6 V 擾動(dòng)后增幅最大，說(shuō)明反應(yīng)器中的產(chǎn)酸微生物在此時(shí)相對(duì)較活躍。乳酸和乙醇的產(chǎn)生不利于H2的生產(chǎn)[25]，圖中1.4 V 擾動(dòng)下的乳酸通量較高，這也可能是導(dǎo)致H2通量低的原因。

圖3 電壓擾動(dòng)的EAD產(chǎn)甲烷代謝通量Fig.3 Voltage-perturbed EAD methanogenesis flux

表2 電壓擾動(dòng)相關(guān)代謝物含量Table 2 Contents of metabolites related to voltage disturbance

2.3 微生物群落豐富度和多樣性分析

Alpha Diversity 用于分析樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性，并直觀表示測(cè)序深度和數(shù)據(jù)量情況，主 要 指 標(biāo) 有Observed species、Shannon、ACE、Chao1、Goods coverage 和Simpon 指 數(shù)。 其 中Observed species（OTUs）表示直觀檢測(cè)到的樣本中微生物物種數(shù)，Shannon 指數(shù)表征樣本中微生物總數(shù)及其占比，可以表示微生物物種的多樣性和分布均勻性，ACE 表示群落中的OTU 數(shù)目，Chao1估計(jì)樣本中的物種總數(shù)，Goods coverage 代表本次測(cè)序的深度指數(shù)，其大小表示測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，Simpson 反映樣本微生物群落的多樣性。

表3 為陽(yáng)極表面微生物的多樣性指數(shù)結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，環(huán)境因子的擾動(dòng)對(duì)EAD 陽(yáng)極膜微生物群落的多樣性和豐富度影響較大，Goods coverage 數(shù)值均大于0.99，表示此次測(cè)序結(jié)果可靠度較高。 OTUs、Chao1 和ACE 的結(jié)果顯示，在低壓0.6 V、高壓1.4 V條件擾動(dòng)下，陽(yáng)極膜微生物物種種類得到了很大的增加，其中0.6 V 擾動(dòng)下的微生物物種豐富度最高。Shannon 和Simpson 指數(shù)反映樣本中微生物多樣性，從表3 發(fā)現(xiàn)，在電壓擾動(dòng)條件下的微生物多樣性明顯有所提升，結(jié)合代謝通量發(fā)現(xiàn)，這些條件下的產(chǎn)甲烷性能也較優(yōu)。

表3 陽(yáng)極膜微生物Alpha Diversity指數(shù)分析Table 3 Analysis of Alpha Diversity index of anodic film microorganisms

2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

根據(jù)測(cè)序結(jié)果，篩選出各實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)豐度較大的優(yōu)勢(shì)菌門，做出門水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4 所示。環(huán)境因子擾動(dòng)下共有9 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，F(xiàn)irmicutes（厚壁菌門）、Desulfobacterota（脫硫桿菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）和Actinobacteria(放線菌門)在EAD 產(chǎn)甲烷體系中的陽(yáng)極生物膜上占主導(dǎo)地位；其中，Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 包含了豐富的電活性細(xì)菌，可以提高細(xì)菌與電極之間的直接電子傳遞[21]，從圖4 中可以發(fā)現(xiàn)，這三種電活性菌門占比達(dá)到25%以上，說(shuō)明陽(yáng)極膜上可能存在大量的電活性菌。

圖4 環(huán)境因子擾動(dòng)下的陽(yáng)極膜上微生物門水平群落分布Fig.4 Community distribution of microbial phyla on the anode membrane under disturbance of environmental factors

在電壓擾動(dòng)下，陽(yáng)極膜上的Desulfobacterota 的相對(duì)豐度從未擾動(dòng)（1.0 V）下的27.4%增加到擾動(dòng)后的40.9%（0.6 V）和36.2%（1.4 V），Actinabacteria在擾動(dòng)后含量明顯減少，而Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria 在短暫電壓沖擊下含量并無(wú)明顯變化。

以1%為閾值，對(duì)相對(duì)豐度較大的菌屬進(jìn)行分配作圖，得到EAD 產(chǎn)甲烷體系中屬水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖5所示。EAD 產(chǎn)甲烷體系中陽(yáng)極膜上的Trichloromonas(三氯單胞菌屬)、Clostridium（梭菌屬）、Proteiniphilum（噬蛋白菌）、Syntrophnmonas（互營(yíng)單胞菌屬）和Hydrogenophaga（噬氫菌）是發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌群。從圖5 中可以發(fā)現(xiàn)，Trichloromonas在陽(yáng)極表面微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位，Trichloromonas屬于本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)極膜上占主導(dǎo)地位的Desulfobacterota，可以利用厭氧消化中的中間產(chǎn)物，對(duì)厭氧消化具有重要作用。在電壓擾動(dòng)下，Trichloromonas相對(duì)豐度有所增加，從未擾動(dòng)的26.5%(1.0 V)升至擾動(dòng)后的40.2%（0.6 V）和35.7（1.4 V），Clostridium、Syntrophomonas均在電壓未擾動(dòng)時(shí)最高。電壓變化使得Hydrogenophaga的相對(duì)豐度從0.9%提高到3.1%（0.6 V）和3.5%（1.4 V），而Proteiniphium的相對(duì)豐度隨著電壓的升高逐漸降低。雖然，Trichloromonas在陽(yáng)極膜上含量豐富，但關(guān)于其特性研究較少，需要對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖5 環(huán)境因子擾動(dòng)下陽(yáng)極膜上屬水平的微生物群落分布Fig.5 The distribution of microbial community at the genus level on the anode membrane under disturbance of environmental factors

2.5 酶活水平變化

圖6所示為葡萄糖代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶活性的變化。圖6（a）反映CoI 的酶活性，由圖可以看出，在0.6 V 擾動(dòng)時(shí)，CoI 酶活性最高，達(dá)到370 U∕L，在1.0 V 時(shí)，酶活性為138 U∕L，在1.4 V 時(shí)，酶活性也達(dá)到了245 U∕L。這是由于當(dāng)進(jìn)行電壓擾動(dòng)時(shí)微生物體內(nèi)的NADH∕NAD+變化直接影響細(xì)胞體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的狀態(tài)，使微生物進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝[26]，同微生物在門和屬上含量有較大變化相吻合。再結(jié)合EAD產(chǎn)甲烷代謝通量也可以看出，在0.6 V 時(shí)NADH∕NAD+代謝通量最大，且甲烷的代謝通量也達(dá)到最大。圖6（b）反映PTA 的活性，由圖可以看出，在1.0 V 時(shí)，酶活性為99 IU∕L，在1.4 V 時(shí)，酶活性為97 U∕L，在0.6 V 時(shí)，PTA 酶活性最高，達(dá)到115 U∕L。在乙酸代謝途徑中首要的是乙酸的活化，它首先由PTA進(jìn)行催化，在ATP 參與下經(jīng)AK 催化，乙酸被磷酸化為乙酰磷酸，然后乙酰磷酸再由PTA 催化生成乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行乙酸代謝[27-28]。圖6（c）反映AK 活性，當(dāng)電壓為0.6 V 時(shí)，AK 酶活性為151 U∕L，電壓為1.4 V 時(shí)，AK 酶活性為120 U∕L，均比對(duì)照組1.0 V酶活性為106 U∕L高。乙酸代謝中PTA和AK 的酶活調(diào)節(jié)現(xiàn)象相似，有研究者發(fā)現(xiàn)[29]當(dāng)谷氨酸棒桿菌生長(zhǎng)在以乙酸(取代葡萄糖)為碳源的培養(yǎng)基上時(shí)，PTA 和AK 酶活性明顯提高，該現(xiàn)象是微生物碳代謝中葡萄糖效應(yīng)的具體體現(xiàn)，它暗示著這些酶在基因表達(dá)環(huán)節(jié)上可能存在葡萄糖基質(zhì)上的負(fù)調(diào)控效應(yīng)或乙酸基質(zhì)上的正調(diào)控效應(yīng)[30]。在0.6 V 時(shí)，PTA 和AK 活性均達(dá)到最大值，而AK 酶活性大于PTA，這是由于在乙酸代謝途徑中，AK 催化產(chǎn)生大量ATP，使整個(gè)代謝過(guò)程能順利進(jìn)行。圖6（d）反映CoF420的活性，在各種產(chǎn)甲烷的廣古細(xì)菌中普遍含有CoF420[31]。在H2還原CO2代謝途徑中，—CHO 被轉(zhuǎn)移給另一個(gè)C1載體四氫甲烷喋呤(H4MPT)，再依次被還原為次甲基( CH)、亞甲基( CH)和甲基(—CH3)，而催化這些反應(yīng)需要CoF420作為電子載體[32]。從圖中可以看出，當(dāng)電壓擾動(dòng)為0.6 V時(shí)，CoF420酶活性增加，達(dá)到43 U∕L，比1.0 V 時(shí)40 U∕L 和1.4 V 時(shí)36 U∕L 酶活性高，酶活性增加，導(dǎo)致催化反應(yīng)加快，這與代謝通量在0.6 V 時(shí)產(chǎn)甲烷通量最大實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

圖6 EAD代謝途徑中酶活性水平的變化Fig.6 Changes in enzyme activity levels in EAD metabolic pathways

3 結(jié) 論

在0.6 V 擾動(dòng)下，NADH 產(chǎn)甲烷通量明顯優(yōu)于1.4 V 電壓擾動(dòng)，此條件下最終產(chǎn)物甲烷通量達(dá)到0.5222，明 顯 高 于1.0 V 和1.4 V 下 的0.2974 和0.3951，表明電壓擾動(dòng)使得EAD 產(chǎn)甲烷代謝途徑偏向氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷。電壓擾動(dòng)導(dǎo)致微生物群落發(fā)生變化，在電壓擾動(dòng)下共有9 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門，其中，Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 包含了豐富的電活性細(xì)菌，這三種電活性菌門占比達(dá)到25%以上，陽(yáng)極膜上的Desulfobacterota 的相對(duì)豐度從未擾動(dòng)（1.0 V）下的27.4%增加到擾動(dòng)后的40.9%（0.6 V）和36.2%（1.4 V）。CoI、PTA、AK 與CoF420均在0.6 V 擾動(dòng)下酶活性最大，在0.6 V 電壓擾動(dòng)下，產(chǎn)乙酸通量最小，而PTA 與AK 酶活性卻最大，這是由于乙酸逆反應(yīng)生成乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A 作為其他多個(gè)生化反應(yīng)的底物，參與其他代謝途徑。本文結(jié)果可為環(huán)境因子擾動(dòng)下的代謝通量、微生物和酶活分析提供參考。