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        電壓擾動(dòng)對(duì)EAD代謝通量中微生物與關(guān)鍵酶活性的影響

        2022-11-13 07:38:10劉海波王楠劉洪周陳鐵柱李建昌
        化工學(xué)報(bào) 2022年10期
        關(guān)鍵詞:途徑

        劉海波,王楠,劉洪周,陳鐵柱,李建昌

        (云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,云南 昆明 650500)

        引 言

        微生物電解池(microbial electrolysis cell,MEC)是利用微生物催化的陽(yáng)極降解有機(jī)廢棄物或廢水,并產(chǎn)生電子和質(zhì)子,在電解電壓作用下,電子經(jīng)外電路遷移至陰極,而質(zhì)子在電遷移、對(duì)流和擴(kuò)散作用下經(jīng)本體溶液遷移至陰極,質(zhì)子在陰極被還原而產(chǎn)生氫氣,為生產(chǎn)氫氣提供一種可持續(xù)的方式[1-2]。目前,MEC 耦合厭氧消化(anaerobic digestion,AD)可促進(jìn)甲烷轉(zhuǎn)化率、提高沼氣品質(zhì),在厭氧消化領(lǐng)域中是新的發(fā)現(xiàn)[3-4],因該技術(shù)是在AD 中耦合MEC,所以將MEC-AD 暫稱之為“電化學(xué)厭氧消化”(electro-chemical anaerobic digestion,EAD)。EAD不僅可以減少CO2的排放,而且可提高頑固性化合物、復(fù)雜廢水的降解率和產(chǎn)甲烷的轉(zhuǎn)化率[5-9]。然而,EAD 系統(tǒng)中的微生物群落結(jié)構(gòu)及活性對(duì)電解電壓的變化較為敏感,Yang 等[10]研究不同陽(yáng)極電位(0、0.2、0.4、0.6 V)對(duì)EAD 陽(yáng)極膜微生物的影響中發(fā)現(xiàn),當(dāng)陽(yáng)極電位為0.4 V 時(shí),陽(yáng)極生物膜有較高的電活性和胞外電子傳遞效率。因此,對(duì)于復(fù)雜的非線性的EAD 系統(tǒng)而言,為EAD 提供適合的電解電壓是提高系統(tǒng)運(yùn)行性能的關(guān)鍵因素[11],但電解電壓如何影響微生物的生理代謝,進(jìn)而影響相關(guān)酶的活性尚不清楚。

        厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的本質(zhì)是產(chǎn)甲烷微生物利用胞內(nèi)的酶或者輔酶將簡(jiǎn)單的甲基化合物和二氧化碳轉(zhuǎn)化成甲烷的過(guò)程。氧化型輔酶Ⅰ[系統(tǒng)名稱為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)]是生物代謝所必需的輔酶,對(duì)微生物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)至關(guān)重要,在微生物生長(zhǎng)代謝中,NAD 參與氧化還原反應(yīng),將電子從一個(gè)反應(yīng)攜帶到另一個(gè)反應(yīng)[12]。CoI 作為氧化還原酶催化的氧化還原反應(yīng)在新陳代謝的所有部分都至關(guān)重要,但這些反應(yīng)的一個(gè)特別重要的功能是使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)能夠釋放儲(chǔ)存在相對(duì)較弱的氧雙鍵中的能量[13],為細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖提供能量基礎(chǔ)。磷酸轉(zhuǎn)乙?;福≒TA)在發(fā)酵厭氧菌中無(wú)處不在,在乙酸代謝中起著不可或缺的作用。它可以催化乙?;鶑囊阴A姿岬紺oA 的可逆轉(zhuǎn)移,形成乙酰輔酶A 和磷酸鹽[14]。乙酸激酶(AK)通過(guò)在ATP 和二價(jià)陽(yáng)離子存在下磷酸化乙酸來(lái)促進(jìn)乙酰輔酶A 的產(chǎn)生。AK 與PTA 一起催化乙酸鹽和乙酰輔酶A 相互轉(zhuǎn)化,通過(guò)AK 所產(chǎn)生的乙酸在碳循環(huán)中被細(xì)菌作為碳和能量的來(lái)源。然而,乙酸幾乎是所有發(fā)酵微生物的產(chǎn)物,反過(guò)來(lái)又可作為乙酸營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)底物。

        因此,在EAD 反應(yīng)體系中酶是主導(dǎo)代謝的關(guān)鍵。環(huán)境因子如電解電壓和pH 等是影響微生物代謝活性的變量,而代謝通量分析作為目前研究生物代謝網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的重要方式之一[15-16],無(wú)疑為EAD 的微生物代謝提供了強(qiáng)有力的分析手段。目前,代謝通量分析(MFA)因分析方法[15]、數(shù)據(jù)處理和評(píng)估方面所涉及的技術(shù)已日趨完善而在代謝工程中廣泛應(yīng)用[15,17]。例如,Gonzalez-Garcia 等[18]利用混合培養(yǎng)的接種物將葡萄糖分解產(chǎn)生H2,建立了比較完整的代謝通量網(wǎng)絡(luò),并計(jì)算出代謝網(wǎng)絡(luò)的通量。Li 等[19]在微生物發(fā)酵過(guò)程中豐富了Shewanella oneidensis的代謝通量水平,從而提高了電化學(xué)反應(yīng)過(guò)程中的NADH∕NAD+的總水平,明顯加快了胞外電子傳遞(extracellular electron transfer,EET)速率。Rafieenia等[20]利用蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖和核糖6 種不同碳源建立了丁酸梭菌代謝網(wǎng)絡(luò)模型,研究了丁酸梭菌發(fā)酵制氫的過(guò)程,并且計(jì)算出了NADH通量是影響H2產(chǎn)生的重要輔助因子。因此,代謝通量分析為量化環(huán)境變量擾動(dòng)下的代謝通量提供了清晰的思路。

        為此,本研究利用代謝通量分析法對(duì)EAD 體系的代謝過(guò)程進(jìn)行量化,直觀地展示電解電壓擾動(dòng)后各代謝途徑的通量變化,并結(jié)合微生物群落結(jié)構(gòu)和關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)處的酶活水平揭示電壓擾動(dòng)對(duì)EAD 代謝通量中微生物與關(guān)鍵酶活性的影響。

        1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)裝置

        EAD 裝置由電化學(xué)單元、EAD 發(fā)酵單元、集氣單元組成,如圖1 所示。發(fā)酵罐有效容積為400 ml,由橡膠塞密封,橡膠塞設(shè)有取氣口、排氣口、取樣口及電極插口。陽(yáng)極為石墨電極(30 mm× 30 mm×2 mm),陰極為鉑電極(30 mm×30 mm×0.2 mm),參比電極為飽和Ag∕AgCl電極。設(shè)置電極距離為3.0 cm,并將電極片浸沒(méi)于發(fā)酵液中,電極通過(guò)銅線引出與寬屏無(wú)紙記錄儀(SIN-R7000A,中國(guó))相連。

        圖1 EAD實(shí)驗(yàn)裝置a—電解電流及電壓記錄單元;b—EAD反應(yīng)單元;c—排水集氣單元;1—pH測(cè)定、投料及取樣口;2—取氣口;3—發(fā)酵罐;4—攪拌子;5—恒溫磁力攪拌器;6—寬屏無(wú)紙記錄儀;7—石墨電極;8—鉑電極;9—玻璃三通;10—密封蓋;11—集氣瓶;12—量筒Fig.1 EAD experimental setup a—electrolytic current and voltage recording unit;b—EAD reaction unit;c—drainage gas gathering unit;1—pH determination,feeding and sampling port;2—intake port;3—fermentation tank;4—stirner;5—thermostatic magnetic stirrer;6—broadscreen paperless recorder;7—graphite electrode;8—platinum electrode;9—glass tee;10—sealing cover;11—collector;12—gauge tube

        1.2 接種物

        接種物來(lái)自云南師范大學(xué)昆明實(shí)驗(yàn)室經(jīng)豬糞厭氧發(fā)酵后的厭氧污泥,其pH 為8.07,TS 為17.11%,VS為10.08%。

        1.3 緩沖營(yíng)養(yǎng)液

        緩沖營(yíng)養(yǎng)液的成分及配比:NaH2PO4·2H2O(5.54 g·L-1),Na2HPO4·12H2O(23.088 g·L-1),KCl(0.26 g·L-1)和NH4Cl(0.62 g·L-1)。

        1.4 微量元素液

        微量元素液的成分及配比:Na2WO4·2H2O(0.025 g·L-1),NaCl(1 g·L-1),F(xiàn)eCl2·7H2O(0.072 g·L-1),CuSO4·5H2O(0.01 g·L-1),NiCl2·6H2O(0.024 g·L-1),C6H9NO6(1.5 g·L-1),MgSO4(3 g·L-1),AlK(SO4)2·12H2O(0.01 g·L-1),ZnCl2(0.13 g·L-1),CaCl2·2H2O(0.1 g·L-1),H3BO3(0.01 g·L-1),MnCl2·4H2O(0.6 g·L-1),CoCl2·6H2O(0.1 g·L-1),Na2MoO4(0.025 g·L-1)和復(fù)合維生素(1 ?!-1)。

        1.5 實(shí)驗(yàn)方法

        EAD 實(shí)驗(yàn)組三組平行運(yùn)行。啟動(dòng)時(shí),反應(yīng)器中接種120.0 g厭氧污泥,100.0 ml緩沖營(yíng)養(yǎng)液,10.0 ml微量元素液,底物加入量為1.0 g 葡萄糖,隨后用蒸餾水將反應(yīng)器的總質(zhì)量定至360.0 g。待發(fā)酵罐密封后,通入氮?dú)? min,施加恒定電壓為1.0 V,并置于30℃恒溫磁力攪拌器中。此后,當(dāng)pH 大于7時(shí)進(jìn)行補(bǔ)料,補(bǔ)料量為1.0 g葡萄糖。在此條件下培養(yǎng)至擬穩(wěn)態(tài)。

        擾動(dòng)階段:培養(yǎng)階段結(jié)束后,測(cè)定發(fā)酵液中底物和代謝產(chǎn)物的濃度。同時(shí),記下該時(shí)間點(diǎn)為擾動(dòng)的初始點(diǎn)(設(shè)為S點(diǎn)),隨后添加1.0 g葡萄糖,施加電壓擾動(dòng)(0.6、1.0、1.4 V),通過(guò)監(jiān)測(cè)體系中底物的消耗量和代謝產(chǎn)物的生成量,進(jìn)行代謝通量分析。電壓擾動(dòng)僅是為了獲得變化的通量數(shù)據(jù),不作為電解電壓對(duì)EAD的影響的依據(jù)。

        1.6 檢測(cè)分析

        采用排水法收集記錄日產(chǎn)氣量。在(105±5)℃下干燥并在(550±10)℃下馬弗爐燃燒1 h后,通過(guò)稱量法測(cè)量污泥的TS 和VS。用pH 分析儀(HAOSHI H-1008A,中國(guó))每24 h 記錄一次pH。通過(guò)5500 r∕min 離心7 min 獲得樣品消化物的上清液,通過(guò)氣相色譜儀(FULI, GC9790Ⅱ,中國(guó))對(duì)VFA 進(jìn)行檢測(cè),色譜柱為KB- FFAP(30 m×0. 32 mm×0. 25 μm),氣壓設(shè)置為總壓0.3 MPa,柱前壓0. 08 MPa,柱后壓0.06 MPa,氫氣壓0.1MPa,空氣壓0.1 MPa。進(jìn)樣口溫度200℃,柱箱溫度130℃,F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度250℃。通過(guò)氣相色譜儀(FULI,GC9790Ⅱ,中國(guó))對(duì)H2、CH4和CO2含量進(jìn)行分析,進(jìn)樣器溫度為200℃,TCD 檢測(cè)器的溫度是200℃,柱溫是110℃,每次實(shí)驗(yàn)取氣體樣品200 μl,運(yùn)行時(shí)間10 min。葡萄糖含量:采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定。

        1.7 微生物多樣性測(cè)定

        測(cè)序前將樣品儲(chǔ)存于-80℃的超低溫冰箱中。采用CTAB∕SDS 法提取樣品總基因組DNA,用1%瓊脂凝膠測(cè)定DNA 濃度和純度,然后使用去離子水稀釋至濃度為l μg∕μl。首先用特異引物擴(kuò)增出不同區(qū)域的16S rRNA基因,其中所有的PCR反應(yīng)均使用15 μl 的Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix(新英格蘭)、0.2 μg 的正反向引物和約10 ng 的模板DNA。反應(yīng)步驟為:在高溫98℃下變性1 min,再在98℃變性10 s循環(huán)30次,之后50℃退火30 s,最后在適宜溫度72℃下延伸30 s 并保持5 min。將相同體積的IX載液(含SYB green)與PCR 產(chǎn)物混合,在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。PCR 產(chǎn)物按等密度比例混合。然后用Qiagen Gel Extraction Kit(Qiagen, 德國(guó))對(duì)混合PCR 產(chǎn)物進(jìn)行純化。最后使用TruSeq?DNA PCR-Free 樣品制備試劑盒(Illumina,美國(guó))生成測(cè)序文庫(kù),在Qubit@2.0 熒光儀(Thermo Scientific)和安捷倫生物分析儀2100 系統(tǒng)上進(jìn)行評(píng)估。最后在Illumina NovaSeq 平臺(tái)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序,生成250 bp的配對(duì)端reads。

        1.8 酶活性測(cè)定

        采用改良的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法,以特定抗體為底物,根據(jù)比色定量酶活性[21]。ELISA 的原理是使抗體和酶復(fù)合物相結(jié)合,然后根據(jù)顯色反應(yīng)的強(qiáng)度進(jìn)行定性或定量分析。將抗原或抗體與酶連接形成酶標(biāo)記的抗原或抗體,既保留免疫活性又保留酶活性[22]。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,以下成分被用作底物:純化的NADH 酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶(PTA)、乙酸激酶(AK)、輔酶F420(CoF420)(上海濟(jì)寧生物技術(shù)有限公司,中國(guó))。使用ELISA方法分析上述底物的微生物酶活性[22]。將與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的待測(cè)試酶對(duì)應(yīng)的抗體合并以形成抗體-抗原-酶標(biāo)記的抗體復(fù)合物,經(jīng)過(guò)徹底洗滌后并添加3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物顯色。在HRP 酶的催化下,TMB 變成藍(lán)色,在酸的作用下變成最終的黃色。顏色的深淺與樣品中的酶含量呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度(OD 值),并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中酶的活性濃度。

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

        2.1 代謝通量分析

        通量平衡分析(MFA)是微生物過(guò)程建模和分析代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的最佳通量的一種方法,它可以用于研究環(huán)境變化對(duì)產(chǎn)物生產(chǎn)和細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。本研究采用代謝通量分析軟件(Cell Net Analyzer 2019.2)輔助,建立了EAD產(chǎn)甲烷代謝模型并計(jì)算出了相關(guān)代謝通量,如圖2 所示。表1 總結(jié)了該代謝模型中相關(guān)的代謝反應(yīng)式。

        表1 EAD產(chǎn)甲烷代謝途徑的反應(yīng)式Table 1 Reaction formula of EAD methanogenesis metabolic pathway

        丙酮酸是EAD 產(chǎn)甲烷代謝途徑中重要的代謝節(jié)點(diǎn),與多種中間產(chǎn)物相聯(lián)系,包括甲酸、乳酸、乙醇和丙酸等多種胞外代謝產(chǎn)物,要想提高EAD 效益,需加快葡萄糖代謝產(chǎn)生丙酮酸的過(guò)程(R1)。EAD產(chǎn)甲烷代謝途徑中,NADH是一種輔助因子,有多個(gè)反應(yīng)涉及到NADH 的生產(chǎn)與消耗。通過(guò)增加NADH 的量可以進(jìn)一步提高氫氣的產(chǎn)率[23]。在本代謝途徑中,R6 是產(chǎn)生NADH 的主要反應(yīng),提高其產(chǎn)量可以有效促進(jìn)氫氣的產(chǎn)生(R7);R4 是丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A 的重要反應(yīng),同樣也是產(chǎn)生終產(chǎn)物CO2的途徑之一。H2的合成主要由糖酵解過(guò)程中合成的丙酮酸的厭氧代謝驅(qū)動(dòng),其來(lái)源主要有NADH和FdH(R7 和R8)。此外,氫氣產(chǎn)率和乙酸的產(chǎn)率有關(guān),但在EAD 產(chǎn)甲烷途徑中,氫氣也可以由陰極通過(guò)電子傳遞途徑產(chǎn)生(R37)。甲烷來(lái)源主要有氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷(R26)和噬乙酸型產(chǎn)甲烷(R29)。在實(shí)際過(guò)程中,甲烷的產(chǎn)率也與丁酸和丙酸的混合物有關(guān)[24],同樣需要對(duì)此進(jìn)行代謝通量的分析。由圖2代謝網(wǎng)絡(luò)可知,乙酸的產(chǎn)生途徑主要有R12、R18、R19、R20 和R21,其通量大小受多個(gè)中間產(chǎn)物的影響。乳酸是EAD 中影響較大的中間產(chǎn)物,因乳酸的生成需消耗一定量的NADH,且乳酸不易分解,會(huì)造成氫氣的產(chǎn)生受限,也會(huì)引起反應(yīng)體系pH 的失衡。厭氧消化是一個(gè)復(fù)雜的微生物代謝過(guò)程,在某些情況下也可能會(huì)產(chǎn)生己酸(R32)、丙醇(R28)和丁醇(R34)等有機(jī)物。

        圖2 EAD產(chǎn)甲烷過(guò)程的代謝途徑Fig.2 Metabolic pathways of EAD methanogenesis

        2.2 電解電壓擾動(dòng)對(duì)EAD產(chǎn)甲烷代謝通量的影響

        圖3 顯示了根據(jù)表2 數(shù)據(jù)做出的電壓擾動(dòng)對(duì)EAD 產(chǎn)甲烷代謝通量,該結(jié)果以H2、CO2和CH4為最終產(chǎn)物進(jìn)行討論。電壓擾動(dòng)后,各中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物均發(fā)生顯著變化。在0.6 V 擾動(dòng)下,NADH 通量明顯優(yōu)于1.4 V 電壓擾動(dòng),且此條件下最終產(chǎn)物甲烷通量達(dá)到0.5222 g,顯著高于1.0 V和1.4 V 下的0.2974 g 和0.3951 g,然而,產(chǎn)H2途徑的通量卻有所降低,說(shuō)明電壓過(guò)低抑制了產(chǎn)氫,但卻增強(qiáng)了產(chǎn)甲烷途徑。0.6 V 和1.4 V 擾動(dòng)下,通過(guò)H2還原CO2產(chǎn)生的甲烷(R26)分別占35%和40%,對(duì)照組為37%,表明電壓擾動(dòng)使得EAD 產(chǎn)甲烷代謝途徑發(fā)生了改變。值得注意的是,EAD 產(chǎn)甲烷系統(tǒng)明顯產(chǎn)生了甲酸,但根據(jù)代謝通量,CH4和H2無(wú)一來(lái)源于甲酸,說(shuō)明EAD 系統(tǒng)中可能沒(méi)有噬甲酸產(chǎn)甲烷菌存在。最終產(chǎn)物H2大多由EAD 中的陰極產(chǎn)生,但在最終產(chǎn)物中,氫氣通量明顯下降,說(shuō)明H2還原為CH4(R26)的途徑較為活躍。此外,在發(fā)酵液中未檢測(cè)到己酸、丙醇和己酸鹽。乙酸可以從R12、R18、R19、R20 和R21 中得到,其通量大小受多個(gè)中間產(chǎn)物的影響,但在電壓擾動(dòng)(0.6 V 和1.4 V)下,其通量明顯增大,其中0.6 V 擾動(dòng)后增幅最大,說(shuō)明反應(yīng)器中的產(chǎn)酸微生物在此時(shí)相對(duì)較活躍。乳酸和乙醇的產(chǎn)生不利于H2的生產(chǎn)[25],圖中1.4 V 擾動(dòng)下的乳酸通量較高,這也可能是導(dǎo)致H2通量低的原因。

        圖3 電壓擾動(dòng)的EAD產(chǎn)甲烷代謝通量Fig.3 Voltage-perturbed EAD methanogenesis flux

        表2 電壓擾動(dòng)相關(guān)代謝物含量Table 2 Contents of metabolites related to voltage disturbance

        2.3 微生物群落豐富度和多樣性分析

        Alpha Diversity 用于分析樣本內(nèi)微生物群落的豐富度和多樣性,并直觀表示測(cè)序深度和數(shù)據(jù)量情況,主 要 指 標(biāo) 有Observed species、Shannon、ACE、Chao1、Goods coverage 和Simpon 指 數(shù)。 其 中Observed species(OTUs)表示直觀檢測(cè)到的樣本中微生物物種數(shù),Shannon 指數(shù)表征樣本中微生物總數(shù)及其占比,可以表示微生物物種的多樣性和分布均勻性,ACE 表示群落中的OTU 數(shù)目,Chao1估計(jì)樣本中的物種總數(shù),Goods coverage 代表本次測(cè)序的深度指數(shù),其大小表示測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性,Simpson 反映樣本微生物群落的多樣性。

        表3 為陽(yáng)極表面微生物的多樣性指數(shù)結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn),環(huán)境因子的擾動(dòng)對(duì)EAD 陽(yáng)極膜微生物群落的多樣性和豐富度影響較大,Goods coverage 數(shù)值均大于0.99,表示此次測(cè)序結(jié)果可靠度較高。 OTUs、Chao1 和ACE 的結(jié)果顯示,在低壓0.6 V、高壓1.4 V條件擾動(dòng)下,陽(yáng)極膜微生物物種種類得到了很大的增加,其中0.6 V 擾動(dòng)下的微生物物種豐富度最高。Shannon 和Simpson 指數(shù)反映樣本中微生物多樣性,從表3 發(fā)現(xiàn),在電壓擾動(dòng)條件下的微生物多樣性明顯有所提升,結(jié)合代謝通量發(fā)現(xiàn),這些條件下的產(chǎn)甲烷性能也較優(yōu)。

        表3 陽(yáng)極膜微生物Alpha Diversity指數(shù)分析Table 3 Analysis of Alpha Diversity index of anodic film microorganisms

        2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)變化分析

        根據(jù)測(cè)序結(jié)果,篩選出各實(shí)驗(yàn)組中相對(duì)豐度較大的優(yōu)勢(shì)菌門,做出門水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖4 所示。環(huán)境因子擾動(dòng)下共有9 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門,F(xiàn)irmicutes(厚壁菌門)、Desulfobacterota(脫硫桿菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Actinobacteria(放線菌門)在EAD 產(chǎn)甲烷體系中的陽(yáng)極生物膜上占主導(dǎo)地位;其中,Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 包含了豐富的電活性細(xì)菌,可以提高細(xì)菌與電極之間的直接電子傳遞[21],從圖4 中可以發(fā)現(xiàn),這三種電活性菌門占比達(dá)到25%以上,說(shuō)明陽(yáng)極膜上可能存在大量的電活性菌。

        圖4 環(huán)境因子擾動(dòng)下的陽(yáng)極膜上微生物門水平群落分布Fig.4 Community distribution of microbial phyla on the anode membrane under disturbance of environmental factors

        在電壓擾動(dòng)下,陽(yáng)極膜上的Desulfobacterota 的相對(duì)豐度從未擾動(dòng)(1.0 V)下的27.4%增加到擾動(dòng)后的40.9%(0.6 V)和36.2%(1.4 V),Actinabacteria在擾動(dòng)后含量明顯減少,而Firmicutes、Bacteroidetes和Proteobacteria 在短暫電壓沖擊下含量并無(wú)明顯變化。

        以1%為閾值,對(duì)相對(duì)豐度較大的菌屬進(jìn)行分配作圖,得到EAD 產(chǎn)甲烷體系中屬水平下的微生物群落結(jié)構(gòu)如圖5所示。EAD 產(chǎn)甲烷體系中陽(yáng)極膜上的Trichloromonas(三氯單胞菌屬)、Clostridium(梭菌屬)、Proteiniphilum(噬蛋白菌)、Syntrophnmonas(互營(yíng)單胞菌屬)和Hydrogenophaga(噬氫菌)是發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)菌群。從圖5 中可以發(fā)現(xiàn),Trichloromonas在陽(yáng)極表面微生物群落中占據(jù)主導(dǎo)地位,Trichloromonas屬于本實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)極膜上占主導(dǎo)地位的Desulfobacterota,可以利用厭氧消化中的中間產(chǎn)物,對(duì)厭氧消化具有重要作用。在電壓擾動(dòng)下,Trichloromonas相對(duì)豐度有所增加,從未擾動(dòng)的26.5%(1.0 V)升至擾動(dòng)后的40.2%(0.6 V)和35.7(1.4 V),Clostridium、Syntrophomonas均在電壓未擾動(dòng)時(shí)最高。電壓變化使得Hydrogenophaga的相對(duì)豐度從0.9%提高到3.1%(0.6 V)和3.5%(1.4 V),而Proteiniphium的相對(duì)豐度隨著電壓的升高逐漸降低。雖然,Trichloromonas在陽(yáng)極膜上含量豐富,但關(guān)于其特性研究較少,需要對(duì)此進(jìn)行進(jìn)一步研究。

        圖5 環(huán)境因子擾動(dòng)下陽(yáng)極膜上屬水平的微生物群落分布Fig.5 The distribution of microbial community at the genus level on the anode membrane under disturbance of environmental factors

        2.5 酶活水平變化

        圖6所示為葡萄糖代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶活性的變化。圖6(a)反映CoI 的酶活性,由圖可以看出,在0.6 V 擾動(dòng)時(shí),CoI 酶活性最高,達(dá)到370 U∕L,在1.0 V 時(shí),酶活性為138 U∕L,在1.4 V 時(shí),酶活性也達(dá)到了245 U∕L。這是由于當(dāng)進(jìn)行電壓擾動(dòng)時(shí)微生物體內(nèi)的NADH∕NAD+變化直接影響細(xì)胞體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的狀態(tài),使微生物進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝[26],同微生物在門和屬上含量有較大變化相吻合。再結(jié)合EAD產(chǎn)甲烷代謝通量也可以看出,在0.6 V 時(shí)NADH∕NAD+代謝通量最大,且甲烷的代謝通量也達(dá)到最大。圖6(b)反映PTA 的活性,由圖可以看出,在1.0 V 時(shí),酶活性為99 IU∕L,在1.4 V 時(shí),酶活性為97 U∕L,在0.6 V 時(shí),PTA 酶活性最高,達(dá)到115 U∕L。在乙酸代謝途徑中首要的是乙酸的活化,它首先由PTA進(jìn)行催化,在ATP 參與下經(jīng)AK 催化,乙酸被磷酸化為乙酰磷酸,然后乙酰磷酸再由PTA 催化生成乙酰輔酶A,進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)行乙酸代謝[27-28]。圖6(c)反映AK 活性,當(dāng)電壓為0.6 V 時(shí),AK 酶活性為151 U∕L,電壓為1.4 V 時(shí),AK 酶活性為120 U∕L,均比對(duì)照組1.0 V酶活性為106 U∕L高。乙酸代謝中PTA和AK 的酶活調(diào)節(jié)現(xiàn)象相似,有研究者發(fā)現(xiàn)[29]當(dāng)谷氨酸棒桿菌生長(zhǎng)在以乙酸(取代葡萄糖)為碳源的培養(yǎng)基上時(shí),PTA 和AK 酶活性明顯提高,該現(xiàn)象是微生物碳代謝中葡萄糖效應(yīng)的具體體現(xiàn),它暗示著這些酶在基因表達(dá)環(huán)節(jié)上可能存在葡萄糖基質(zhì)上的負(fù)調(diào)控效應(yīng)或乙酸基質(zhì)上的正調(diào)控效應(yīng)[30]。在0.6 V 時(shí),PTA 和AK 活性均達(dá)到最大值,而AK 酶活性大于PTA,這是由于在乙酸代謝途徑中,AK 催化產(chǎn)生大量ATP,使整個(gè)代謝過(guò)程能順利進(jìn)行。圖6(d)反映CoF420的活性,在各種產(chǎn)甲烷的廣古細(xì)菌中普遍含有CoF420[31]。在H2還原CO2代謝途徑中,—CHO 被轉(zhuǎn)移給另一個(gè)C1載體四氫甲烷喋呤(H4MPT),再依次被還原為次甲基( CH)、亞甲基( CH)和甲基(—CH3),而催化這些反應(yīng)需要CoF420作為電子載體[32]。從圖中可以看出,當(dāng)電壓擾動(dòng)為0.6 V時(shí),CoF420酶活性增加,達(dá)到43 U∕L,比1.0 V 時(shí)40 U∕L 和1.4 V 時(shí)36 U∕L 酶活性高,酶活性增加,導(dǎo)致催化反應(yīng)加快,這與代謝通量在0.6 V 時(shí)產(chǎn)甲烷通量最大實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。

        圖6 EAD代謝途徑中酶活性水平的變化Fig.6 Changes in enzyme activity levels in EAD metabolic pathways

        3 結(jié) 論

        在0.6 V 擾動(dòng)下,NADH 產(chǎn)甲烷通量明顯優(yōu)于1.4 V 電壓擾動(dòng),此條件下最終產(chǎn)物甲烷通量達(dá)到0.5222,明 顯 高 于1.0 V 和1.4 V 下 的0.2974 和0.3951,表明電壓擾動(dòng)使得EAD 產(chǎn)甲烷代謝途徑偏向氫營(yíng)養(yǎng)型產(chǎn)甲烷。電壓擾動(dòng)導(dǎo)致微生物群落發(fā)生變化,在電壓擾動(dòng)下共有9 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門,其中,Proteobacteria、Firmicutes 和Actinobacteria 包含了豐富的電活性細(xì)菌,這三種電活性菌門占比達(dá)到25%以上,陽(yáng)極膜上的Desulfobacterota 的相對(duì)豐度從未擾動(dòng)(1.0 V)下的27.4%增加到擾動(dòng)后的40.9%(0.6 V)和36.2%(1.4 V)。CoI、PTA、AK 與CoF420均在0.6 V 擾動(dòng)下酶活性最大,在0.6 V 電壓擾動(dòng)下,產(chǎn)乙酸通量最小,而PTA 與AK 酶活性卻最大,這是由于乙酸逆反應(yīng)生成乙酰輔酶A,而乙酰輔酶A 作為其他多個(gè)生化反應(yīng)的底物,參與其他代謝途徑。本文結(jié)果可為環(huán)境因子擾動(dòng)下的代謝通量、微生物和酶活分析提供參考。

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