張建海 王巍 王前 許佳倫 高娜

宮頸癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率較高，據(jù)2019年全國癌癥報告，宮頸癌發(fā)病約占6.25%，病死率約占3.96%，相較于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等均更高，分別位于第6 位與第8 位；并且宮頸癌發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化趨勢，嚴重威脅著女性健康。宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）為宮頸癌前病變，高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（highgrade squamous intraepithelial lesion，HISL）發(fā)生可加速宮頸癌癌前病變進程，使宮頸癌發(fā)病風險明顯增加［1-2］。故而，通過早期診斷宮頸CIN 病變，有效阻斷宮頸病變，并提高宮頸癌篩查效果具有重要臨床意義。宮頸細胞學篩查常用于宮頸病變診斷，但是該方法假陰性率相對較高［3-4］。腫瘤微環(huán)境改變與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移聯(lián)系緊密，免疫炎性微環(huán)境在宮頸癌發(fā)生中承擔著重要作用［5］。模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）為宿主固有免疫系統(tǒng)關(guān)鍵組成，胞漿PRRs 主要為NOD 樣受體（NOD-like Receptors，NLRs）。NLRC3屬于NLR 家族，可參與調(diào)控NF-κB 信號通路，進而對腫瘤發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。諸多研究［6-7］表明，NLRC3 與炎癥反應(yīng)存在關(guān)聯(lián)，可對炎癥信號通路進行負性調(diào)控，其功能失調(diào)與多種自身免疫性疾病及結(jié)腸癌、肺癌等腫瘤相關(guān)。近些年有研究［8］表明，NLRC3 可參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。但目前，NLRC3 調(diào)控宮頸病變發(fā)生發(fā)展的機制尚未明晰。本研究分析NLRC3 表達與宮頸CIN病情的關(guān)系，探究其預(yù)測CIN 發(fā)生及診斷HISL 的效能，旨在為宮頸癌前病變篩查及診療提供支撐。報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取北京市大興區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2021年3月至2022年2月宮頸CIN 患者96 例為觀察組，均經(jīng)細胞學以及病理檢查明確診斷。年齡平均（30.26±3.52）歲，體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）平均（22.36±2.11）kg/m2，有生產(chǎn)史63 例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）CIN 分級標準［9］進行劃分，CIN1（35 例）：輕度非典型增生，細胞異型程度較輕，排列整齊性較差，但仍有極性，異常增殖細胞范圍僅局限于上皮層1/3；CIN2（42 例）：中度非典型增生，異型程度明顯，排列紊亂，異常增殖細胞范圍延伸至上皮層下2/3；CIN3（19 例）：重度非典型增生，異型程度顯著，極性喪失，異常增殖細胞擴展范圍近乎全層。CIN1歸為低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL），CIN2、CIN3 歸為高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）。見圖1。

圖1 宮頸上皮內(nèi)瘤變組織學染色（HE，×20）Figure 1 Histological staining of cervical intraepithelial neoplasia（HE，×20）

納入標準：①經(jīng)細胞學、病理檢查明確診斷為宮頸CIN［10］；②年齡18 歲以上；③納入本研究前未用藥治療。排除標準：①宮頸手術(shù)既往史；②合并惡性腫瘤；③伴內(nèi)分泌、感染性疾病。于同期選取行宮頸檢查正常者37 名為對照組。年齡平均（29.51±3.71）歲，BMI 平均（22.43±1.89）kg/m2，有生產(chǎn)史21 例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。入試者均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理協(xié)會審核批準。

1.2 方法

在入組時，兩組對象均采集外周靜脈血2 mL兩份。應(yīng)用日本TAKARA 人全血RNA 試劑盒提取全血RNA，采用微量核酸儀測定RNA 純度與濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-80℃冰箱待測。cDNA作模板進行qPCR 擴增，基于Genebank，檢索并確定NLRC3 基因及目標擴增序列，應(yīng)用Prism5.0 軟件設(shè)計特異性引物，PCR 引物序列：NLRC3 F 為5′-CCCATACATGGATTCTCCACAA-3′，R 為5′-CCACTTCCAGATCCTACATCAAG-3′；GADPH F為5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，R 為5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。RT-PCR 反應(yīng)條件：在94℃環(huán)境下預(yù)變性60 s，95℃條件下變性5 s，接著，在60℃條件下復性30 s，而后，72℃條件下延伸1 min，循環(huán)共有35 個。觀察溶解曲線，結(jié)果計算采用2-ΔΔct 法，測定NLRC3mRNA 相對表達量。

采用Western blot 實驗測定NLRC3 蛋白相對表達量。加入RIPA 裂解液與苯基甲烷磺酰氟（1%PMSF）均質(zhì)裂解液，勻漿離心，離心轉(zhuǎn)速3 000 r/min，半徑13.5 cm，離心15 min，取上清液提取蛋白。應(yīng)用BCA 方法測定蛋白濃度，沸水浴15 min 使蛋白變性，適量蛋白樣品與10%SDS-PAGD 凝膠混合，垂直電泳后完全分離，切下含NLRC3 與內(nèi)參GAPDH 的膠段，移至PVDF 膜，置于5%脫脂奶粉溶液中浸泡，室溫下封閉60 min。加入20 mL 一抗稀釋液（1∶1 000）與20 mL GAPDH 一抗稀釋液（1∶45 000），置于4℃環(huán)境下孵育過夜，洗膜完全后，加入二抗稀釋液（1∶3 000），室溫下孵育60 min；洗膜完全后，利用電化學發(fā)光液采用化學發(fā)光發(fā)測定NLRC3 蛋白相對表達水平。一抗稀釋液購自Abcam 公司，GAPDH 購自武漢三鷹公司，二抗稀釋液購自武漢塞維爾公司。

1.3 統(tǒng)計學方法

應(yīng)用SPSS 22.0 分析數(shù)據(jù)資料。符合正態(tài)分布的計量資料以（）表示，兩組間比較行t 檢驗，多組間比較采用單因素ANOVA 方差分析；計數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗；采用Spearman 相關(guān)分析NLRC3 表達與宮頸CIN 患者病情程度的相關(guān)性；繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白表達預(yù)測CIN 發(fā)生及診斷HISL 的價值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相對表達量比較

觀察組NLRC3 mRNA 相對表達量、NLRC3 蛋白相對表達量均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組NLRC3 mRNA、NLRC3蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of the relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein between the two groups（±s）

表1 兩組NLRC3 mRNA、NLRC3蛋白相對表達量比較（±s）Table 1 Comparison of the relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein between the two groups（±s）

組別觀察組對照組t 值P 值n 96 37 NLRC3 mRNA 0.046±0.024 0.098±0.027 10.236 0.000 NLRC3 蛋白2.35±0.99 3.79±0.96 7.557 0.000

2.2 不同CIN 分級NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相對表達量比較

不同CIN 分級NLRC3mRNA 相對表達量、NLRC3 蛋白相對表達量比較CIN1＞CIN2＞CIN3，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同CIN 分級NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相對表達量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein in different CIN grades（±s）

表2 不同CIN 分級NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白相對表達量比較（±s）Table 2 Comparison of relative expression levels of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein in different CIN grades（±s）

注：與CIN1 比較，aP＜0.05，與CIN2 比較，bP＜0.05。

CIN 分級CIN1 CIN2 CIN3 F 值P 值n 35 42 19 NLRC3 mRNA 0.071±0.017 0.037±0.013a 0.019±0.005ab 105.799 0.000 NLRC3 蛋白3.37±0.51 2.16±0.38a 0.91±0.25ab 226.163 0.000

2.3 NLRC3 表達與CIN 病情程度的相關(guān)性

Spearman 相關(guān)性分析顯示，NLRC3mRNA 相對表達量與CIN 分級呈顯著負相關(guān)（r=-0.863，P=0.000）、NLRC3 蛋白相對表達量與CIN 分級呈顯著負相關(guān)（r=-0.894，P=0.000）。

2.4 NLRC3 表達預(yù)測CIN 發(fā)生及診斷HISL 的價值

ROC 曲線分析NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白的AUC 分別為0.916、0.832，均有較高預(yù)測價值。見表3、圖2。

圖2 NLRC3 mRNA、NLRC3蛋白預(yù)測CIN發(fā)生的ROC曲線Figure 2 ROC curve of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicting the occurrence of CIN

表3 NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白預(yù)測CIN 發(fā)生的ROC 分析結(jié)果Table 3 ROC analysis results of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicting the occurrence of CIN

建立ROC 曲線分析NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白診斷HISL 的價值：NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白的AUC 分別為0.684、0.762，均有一定預(yù)測價值。見表4、圖3。

圖3 NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白預(yù)測HISL 的ROC 曲線Figure 3 NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicted ROC curves of HISL

表4 NLRC3 mRNA、NLRC3 蛋白預(yù)測HISL 的ROC分析結(jié)果Table 4 ROC analysis results of NLRC3 mRNA and NLRC3 protein predicting HISL

3 討論

宮頸柱狀上皮在各類不同高危因素誘導下發(fā)生早期病變，可使宮頸癌前病變發(fā)生風險明顯上升。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）16/18 高危亞型感染，可促使癌基因異常激活，宮頸柱狀上皮細胞分化障礙風險顯著增加，更容易誘發(fā)宮頸原位癌［11］。對宮頸病變進行早期篩查，可為臨床實施宮頸部分切除或錐形切除等方案提供指導與參考，從而有效阻斷宮頸CIN 逐漸發(fā)展至宮頸癌的演變過程。臨床上常采用宮頸細胞學進行常規(guī)篩查，但是該篩查方式存在一定主觀差異，并且對于部分宮頸病變位置較深者，部分研究報道篩查靈敏度較低，低于70%，而漏診率較高［12］。單純HPV 病毒分型應(yīng)用于宮頸病變篩查效果確切，然而在宮頸高級別上皮瘤變診斷上陽性符合率較低，部分可因藥物使用而導致HPV 假陰性［13］。

PRRs 可激活相關(guān)炎癥通路，促使機體啟動防御機制。NLRs 為其主要成員之一，共有C 末端、中央NOD 與N 末端三個特征結(jié)構(gòu)域，在炎癥反應(yīng)以及信號傳導級聯(lián)反應(yīng)中承擔著重要作用，可通過抗炎性與促炎性調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。NLRC3 位于第16 號染色體，為胞內(nèi)模式識別受體，具有高度保守顯著特征。NLRC3 中央、C 末端結(jié)構(gòu)域具有富含亮氨酸的重復序列，且有由6-α 螺旋束構(gòu)成的CARD 域。目前，愈多研究［14-15］表明炎癥反應(yīng)與腫瘤發(fā)生發(fā)展聯(lián)系密切，異常炎癥反應(yīng)或為腫瘤新生的重要標志或腫瘤主要特征。腫瘤形成早期，炎癥微環(huán)境能夠促使多種信號通路激活，從而驅(qū)動癌前病變進展與惡變損傷；漸而至晚期，癌細胞獲得保衛(wèi)機制，可從免疫監(jiān)測下逃脫并避免清除。有研究［16］表明，NLRC3 參與了炎癥反應(yīng)過程，可負性調(diào)控炎癥信號通路。NLRC3 可與ASC、caspase-5 等炎性因子在直接作用相互結(jié)合，對經(jīng)典以及非經(jīng)典NF-κB 信號通路進行調(diào)控，可影響腫瘤發(fā)生發(fā)展過程［17］。有研究［18］發(fā)現(xiàn)，NLRC3 在結(jié)腸癌中表達水平較正常組織明顯降低，NLRC3是PI3K-AKT-mTOR 信號通路的抑制性感受器，可對該通路活化產(chǎn)生抑制作用，降低結(jié)腸癌發(fā)生風險。本研究結(jié)果與上述研究具有相似性。NLRC3或參與宮頸CIN 發(fā)生發(fā)展過程，NLRC3 低表達示CIN 病理分級差，NLRC3 可能成為預(yù)測CIN 發(fā)生以及診斷HISL 的指標。本研究進一步采用ROC曲線分析NLRC3 表達的價值發(fā)現(xiàn)，NLRC3mRNA、NLRC3 蛋白在預(yù)測CIN 發(fā)生及診斷HISL上均有較高價值，靈敏度較高，但特異度一般。可與臨床宮頸細胞學檢查、HPV 病毒分型等方式聯(lián)合應(yīng)用，以提高宮頸CIN 早期篩查效果。

綜上，NLRC3 在宮頸CIN 病變中表達水平明顯降低，不同CIN 分級NLRC3 表達水平存在差異，NLRC3 表達隨著CIN 分級升高而逐漸下降，二者呈顯著負相關(guān)關(guān)系。并且，NLRC3 表達在預(yù)測CIN 發(fā)生及輔助診斷HISL 上具有較高價值，臨床或可聯(lián)合常規(guī)篩查方式，以提高宮頸CIN 早期篩查效果，從而為臨床診療提供支持，降低宮頸癌發(fā)生率。本研究也存有樣本量偏小局限，且未對NLRC3 免疫組化檢測結(jié)果展開研究，今后有待進一步豐富、深入研究內(nèi)容。