趙亭亭 劉振麗 李立恒 張璇 李超 馬賽★

口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病率較高，占頭頸部惡性腫瘤的40%，90%以上的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者為口腔粘膜原發(fā)性惡性腫瘤［1-2］。由于目前臨床對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及病程中相關(guān)分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚欠深入研究，臨床漏診、誤診率較高。提高口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷率，是保障治療效果、延長患者生存期的重要手段。保羅樣激酶1（Polo-Like Kinase1，PLK1）主要存在于真核細(xì)胞中，其活性增加可促進(jìn)細(xì)胞增殖，與胃癌、結(jié)腸癌、口腔癌等惡性腫瘤關(guān)系密切［3］。凋亡同胱氨酸蛋白-3（Cysteinyl Aspartate-specific Proteninases-3，Caspase-3）是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，有研究顯示，Caspase-3 在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者中陽性表達(dá)率較高，其在癌細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位［4］。細(xì)胞增殖核抗原（nuclear-associated antigen，Ki-67）是增殖細(xì)胞中存在的標(biāo)志性抗原，Ki-67 水平可反映細(xì)胞增殖活性，在多種惡性腫瘤中均存在Ki-67 過度表達(dá)［5］。本研究旨在分析口腔鱗狀細(xì)胞癌患者PLK1、caspase-3、Ki-67 變化及臨床意義，并探討三者與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的關(guān)系，以期為評(píng)估口腔鱗狀細(xì)胞癌病情進(jìn)展及預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均穿刺活檢證實(shí)為口腔鱗狀細(xì)胞癌［6］；②影像資料、臨床資料及隨訪資料完整；③納入研究前未進(jìn)行過放、化療治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并肝、腎等重要器官嚴(yán)重疾病或惡性腫瘤者；②阿爾茲海默癥者、精神障礙者。最終納入104 例患者，選取上述患者口腔黏膜鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本做為癌組織組，選取遠(yuǎn)離癌組織3 cm 的癌旁組織作為癌旁組織組。其中男68例，女36 例；平均年齡（52.14±3.32）歲。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，受試者或家屬已簽署知情同意書。

1.2 指標(biāo)檢測方法

采用SP 免疫組化染色檢測PLK1、caspase-3、Ki-67 在癌組織及癌旁正常組織中的表達(dá)情況。每例組織蠟塊均切片4 張，厚度約4 μm，標(biāo)本均經(jīng)甲醛溶液固定，石蠟包埋，載玻片泡酸，DAB 顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。于鏡下觀察PLK1、caspase-3 及Ki-67。PLK1、caspase-3 及Ki-67 兔多克隆抗體均由美國Epitomics 公司提供。

1.3 陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)

PLK1、caspase-3 及Ki-67 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞胞質(zhì)或細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，反之則為陰性［7］。陽性細(xì)胞比例評(píng)分：≤5%為0 分，＞5%～25%為1 分，＞25%～50%為2 分，＞50%～75%為3 分，＞75%為4 分；染色強(qiáng)度評(píng)分：未染色為0 分，淡黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。染色指數(shù)=陽性細(xì)胞比例評(píng)分＋染色強(qiáng)度評(píng)分。將以上兩項(xiàng)評(píng)價(jià)結(jié)果相加，總得分＜2 分為陰性，總得分≥2 分為陽性。

1.4 隨訪

對(duì)104 例患者隨訪兩年（以電話隨訪為主，門診為輔），記錄兩組患者2年死亡率，隨訪時(shí)間截止至2021年3年。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料通過n（%）表示，并采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料通過（）表示；采用受試者工作特征曲線（ROC）評(píng)估診斷價(jià)值，計(jì)算曲線下面積（AUC）；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLK1、caspase-3 及Ki-67 在不同組織中的表達(dá)

癌組織組PLK1、caspase-3 及Ki-67 陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 PLK1、caspase-3 及Ki-67 在不同組織中的表達(dá)［n（%）］Table 1 Expression of PLK1，Caspase-3 and Ki-67 in different tissues［n（%）］

圖1 免疫組化染色圖（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemical staining（SP，×400）

2.2 不同預(yù)后的患者PLK1、caspase-3及Ki-67表達(dá)

本研究隨訪率100%，隨訪期間死亡63 例（60.58%），生存41 例（39.42%）。PLK1、caspase-3及Ki-67 陽性表達(dá)的患者死亡率顯著高于PLK1、caspase-3 及Ki-67 陰性表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 不同預(yù)后的患者PLK1、caspase-3 及Ki-67 表達(dá)［n（%）］Table 2 Expression of PLK1，Caspase-3 and Ki-67 in patients with different prognosis［n（%）］

2.3 影響口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析

臨床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中-低分化、單一手術(shù)治、治療依從性佳、PLK1（陽性）、caspase-3（陽性）及Ki-67（陽性）為影響口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表3。

表3 影響口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析Table 3 Univariate and multivariate analysis of prognostic survival in patients with oral squamous cell carcinoma

2.4 聯(lián)合三者對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后死亡的預(yù)測價(jià)值

三項(xiàng)指標(biāo)（PLK1+caspase-3+Ki-67）聯(lián)合檢測靈敏度（0.924）、特異度（0.947）、AUC（0.969）均高于單一指標(biāo)檢測（P＜0.05）。見表4、圖2。

圖2 ROC 曲線圖Figure 2 ROC curve

表4 聯(lián)合三者對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后死亡的預(yù)測價(jià)值Table 4 The predictive value of the combination of the three for the prognosis and death of patients with oral squamous cell carcinoma

3 討論

口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟的過程，在癌細(xì)胞增殖的過程中，由多種蛋白共同參與，為腫瘤組織生長提供營養(yǎng)物質(zhì)及氧氣，增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力［8］。尋找口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的關(guān)鍵蛋白，是防治口腔鱗狀細(xì)胞癌生長及增殖的重點(diǎn)。

PLK1 為PLK 家族中的成員之一，PLK1 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞有絲分裂過程中占有重要地位，研究顯示PLK1 在分裂活躍的組織器官及腫瘤細(xì)胞中活性較高［9-10］。caspase-3 是一種半胱氨酸蛋白酶，在正常組織中caspase-3 以無活性的酶前體存在于細(xì)胞內(nèi)，不具備生物功能，在癌細(xì)胞中caspase-3 酶原可被激活，參與細(xì)胞凋亡，損傷正常細(xì)胞［11］。Ki-67可標(biāo)記增殖性細(xì)胞核，敏感地反映惡性腫瘤的增殖率及侵襲力，對(duì)腫瘤的診斷、預(yù)后評(píng)估有重要指導(dǎo)意義［12］。本研究中，癌組織組PLK1、caspase-3及Ki-67 陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織組，提示，在口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生過程中，PLK1、caspase-3 及Ki-67 可能起著至為關(guān)鍵的作用，可作為診斷、評(píng)估口腔鱗狀細(xì)胞癌病情的潛在有效指標(biāo)。有學(xué)者研究指出，PLK1 在細(xì)胞有絲分裂的不同時(shí)期均起到十分重要的作用，其通過細(xì)胞外基質(zhì)參與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移，與惡性腫瘤疾病患者預(yù)后關(guān)系密切［13］。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，caspase-3 是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，caspase-3 的出現(xiàn)或升高代表著細(xì)胞發(fā)生不同程度的死亡，高活躍度的caspase-3對(duì)ADP-核糖聚合酶、肌動(dòng)蛋白以及固醇調(diào)節(jié)元件蛋白有聚集功能，在相互作用下導(dǎo)致細(xì)胞走向凋亡［14］。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Ki-67 能較為全面地反映細(xì)胞增殖數(shù)量，Ki-67 陽性表達(dá)升高往往提示病情惡性程度增加，Ki-67 的增殖活性是判斷乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤患者預(yù)后的重要因素之一［15］。本研究隨訪率100% ，隨訪期間死亡63 例（60.58%），生存41 例（39.42%）。隨訪結(jié)果顯示臨床分期（Ⅲ～Ⅵ期）、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度中-低分化、PLK1（陽性）、caspase-3（陽性）及Ki-67（陽性）為影響口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果提示，PLK1、caspase-3 及Ki-67 陽性率高，患者病情會(huì)隨之加重，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險(xiǎn)性也會(huì)顯著增加，三項(xiàng)指標(biāo)均與患者病情進(jìn)展相關(guān)。

ROC 曲線結(jié)果顯示，三項(xiàng)指標(biāo)（PLK1+caspase-3+Ki-67）聯(lián)合檢測靈敏度（0.924）、特異度（0.947）、AUC（0.969）均高于單一指標(biāo)檢測。由此可以推測，聯(lián)合PLK1、caspase-3 及Ki-67 檢測能作為預(yù)測口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后死亡的一種有效手段。

綜上所述，PLK1、caspase-3 及Ki-67 參與口腔鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的過程，且與患者預(yù)后密切相關(guān)，臨床可加強(qiáng)聯(lián)合三項(xiàng)指標(biāo)檢測，提高口腔鱗狀細(xì)胞癌早期診斷率，以評(píng)估患者預(yù)后，為針對(duì)PLK1、caspase-3 及Ki-67 開展分子靶向治療提供新方向。