孟媛媛 趙亭亭 呂紅娟

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部鱗癌中發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，OSCC 發(fā)病率近年有逐漸上升趨勢(shì)［1］。臨床中對(duì)于OSCC 患者的治療方式包括外科手術(shù)、放/化療以及其他輔助治療，且獲得了較好的臨床療效，但患者五年生存率仍在50%以下［2］。如何提高改善患者預(yù)后，尋找預(yù)后評(píng)估相關(guān)指標(biāo)成為臨床研究熱點(diǎn)。組蛋白賴氨酸去甲基化酶4A（Histone lysine demethylase 4，TEAD4）屬于TEA結(jié)構(gòu)域DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子家族（TEA domain transcription factor，TEAD）中的核心成員，在人體疾病以及各種生物學(xué)反應(yīng)中具有重要的作用［3］。蛋白酪氨酸磷酸酶-2（Protein tyrosine Phosphatase-2，SHP-2）在組織、細(xì)胞中均廣泛表達(dá)，與胚胎發(fā)育、細(xì)胞遷徙、繁殖、分化等均有密切的聯(lián)系，有研究顯示，SHP-2 的異常表達(dá)與多種癌癥發(fā)生具有密切聯(lián)系［4］。促血管生成素-2（Angiopoietin-2，Ang-2）是促腫瘤血管生成的相關(guān)因子，對(duì)病理性血管生成及發(fā)育有調(diào)節(jié)作用，可影響腫瘤的惡性發(fā)展［5］。本研究將通過分析TEAD4、SHP-2 及Ang-2在OSCC 患者中的表達(dá)情況，了解三者與患者病理參與及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年12月至2020年12月于河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院行外科手術(shù)治療或活檢的的OSCC 患者121 例，其中男72 例，女49 例，平均年齡為（59.59±4.16）歲，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）［6］中分期標(biāo)準(zhǔn)分為：Ⅰ～Ⅱ期55 例，Ⅲ～Ⅳ期66 例；68 例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；組織分化：低分化74 例，中-高分化47 例；腫瘤直徑≥3 cm 57 例，＜3 cm 64 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)臨床病理診斷確診為OSCC，符合《口腔鱗狀細(xì)胞癌時(shí)辰化療中國專家共識(shí)》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］；②在檢查前均未進(jìn)行放療或化療；③患者知情且同意；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在血液系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)疾病者；②合并存在心、肝、腎等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者；③合并其他腫瘤者；④存在嚴(yán)重并發(fā)癥者。以患者術(shù)中病理送檢組織作為OSCC 組，癌旁組織（距離癌組織＞5 cm）為對(duì)照組。本研究經(jīng)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

收集患者臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤直徑、病理特征等，病理特征包括：臨床分期（Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期）、組織分化（低分化、中高分化）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。并對(duì)患者進(jìn)行為期12 個(gè)月隨訪，以電話、短信、回院復(fù)查等方式了解患者預(yù)后情況，隨訪時(shí)間：2021年1月1日至2022年1月1日，根據(jù)患者預(yù)后情況進(jìn)行分組：預(yù)后良好（無復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡），預(yù)后不良（死亡、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等）。

1.2.2 TEAD4、SHP-2 及Ang-2 檢測(cè)

TEAD4、SHP-2 及Ang-2 均使用免疫組化法進(jìn)行檢測(cè)。獲取病理標(biāo)本，使用4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，行4 mm 厚連續(xù)切片，用于后續(xù)檢查。TEAD4 以兔抗人KDM4A 多克隆抗體Abnova（上海煊翎生物科技有限公司）為一抗；SHP-2 使用兔抗人SHP-2 多克隆抗體（英國Abcam 公司）；Ang-2 以兔抗人Ang-2 單克隆抗體標(biāo)記Ang-2 蛋白（武漢博士德公司）。每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)陽性對(duì)照和用PBS 緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，陽性對(duì)照為已知染色陽性切片。

結(jié)果判定［6］：由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富病理科醫(yī)生在雙盲情況下對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷，TEAD4 表達(dá)陽性為細(xì)胞膜或胞漿內(nèi)有棕色顆粒為陽性，SHP-2 陽性為細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒，Ang-2 以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。在高倍鏡下（×400）隨機(jī)選擇5 個(gè)視野對(duì)切片進(jìn)行觀察，一個(gè)視野200 個(gè)細(xì)胞，一共計(jì)數(shù)1 000 個(gè)細(xì)胞。采用4 級(jí)半定量法評(píng)分。著色程度：基本不著色為0 分、淡黃色為1 分、黃色為2 分、棕黃色為3 分；陽性細(xì)胞百分比：選取有代表性的10 個(gè)高倍鏡視野，隨機(jī)計(jì)數(shù)100 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，＜5%得0 分、5%～25%得1 分、25%～50%得2 分、50%～75%得3 分、＞75%得4 分；每張切片的最后得分為著色程度與陽性細(xì)胞百分比乘積，≥3 分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；并采用多元Logistic回歸分析TEAD4、SHP-2 及Ang-2 與OSCC 患者預(yù)后關(guān)系，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中TEAD4、SHP-2 及Ang-2 表達(dá)情況比較

OSCC 癌組織中TEAD4、SHP-2 及Ang-2 陽性表達(dá)均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖1。

表1 不同組織中TEAD4、SHP-2 及Ang-2 表達(dá)情況比較［n（%）］Table 1 Comparison of TEAD4，SHP-2 and Ang-2 expression in different tissues［n（%）］

圖1 TEAD4、SHP-2 及Ang-2 免疫組化圖（SP，×400）Figure 1 Immunohistochemistry of tead4，SHP-2 and Ang-2（SP，×400）

2.2 TEAD4、SHP-2 及Ang-2 與OSCC 患者病理特征的關(guān)系

TEAD4 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期患者中陽性表達(dá)占比高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期患者，SHP-2 在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織分化為低分化患者中陽性表達(dá)占比高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織分化為中高分化患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Ang-2 陽性表達(dá)明顯高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 CEA、AFP、CYFRA21-1 與NSCLC 患者病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 2 The relationship between CEA，AFP，CYFRA21-1 and pathological characteristics of NSCLC patients［n（%）］

2.3 TEAD4、SHP-2 及Ang-2 與OSCC 患者預(yù)后關(guān)系

121 例患者預(yù)后良好87 例，預(yù)后不良34 例，預(yù)后不良組臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織分化為低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者組織中TEAD4、SHP-2、Ang-2陽性表達(dá)明顯高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 TEAD4、SHP-2 及Ang-2 與OSCC 患者預(yù)后關(guān)系［n（%）］Table 3 Relationship between TEAD4，SHP-2 and Ang-2 and prognosis of OSCC patients［n（%）］

2.4 影響OSCC 患者預(yù)后相關(guān)因素分析

待分析因素的意義及賦值見表4，經(jīng)多元Logistic回歸分析可知，臨床分期、組織分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TEAD4、SHP-2、Ang-2 是影響OSCC 患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表5。

表4 待分析因素的意義及賦值Table 4 Significance and assignment of factors to be analyzed

表5 影響OSCC 患者預(yù)后多因素Table 5 Multiple factors affecting the prognosis of OSCC patients

3 討論

以往研究顯示，Hippo 信號(hào)通路可參與惡性腫瘤的發(fā)生，TEAD4 則是其中重要的轉(zhuǎn)錄因子，可與Hippo 通路中的核心成員Yes 相關(guān)蛋白（Yes-associatedprotein，YAP）/ 轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ 結(jié)合基序（transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ）形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)［8］。而基因的異常表達(dá)也常被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的一個(gè)重要因素。有研究顯示，在前列腺癌中TEAD4 表達(dá)異常，在對(duì)患者使用特異性小分子阻斷劑抑制TEAD4 表達(dá)后，患者的癌細(xì)胞增殖也受到明顯抑制，癌細(xì)胞凋亡明顯增加［9］。本研究結(jié)果顯示，TEAD4 在OSCC 患者癌變組織中表達(dá)陽性率明顯升高，這表明TEAD4 或許可影響OSCC 發(fā)生發(fā)展。而TEAD4 表達(dá)與患者臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，說明TEAD4 可能促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增加腫瘤的侵襲能力，與以往研究結(jié)果相符［10］。

SHP-2 屬于蛋白酪氨酸激酶與蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase，PTPs）中的一員，參與細(xì)胞的分化、增殖。以往研究顯示，SHP-2 與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性［11］。有研究顯示，在乳腺癌、胃癌、宮頸癌組織中SHP-2 為高表達(dá)，且SHP-2 突變與白血病之間密切相關(guān)［12］。何芳等［13］研究則發(fā)現(xiàn)，SHP-2 具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、黏附及運(yùn)動(dòng)的作用，側(cè)面說明SHP-2 在惡性腫瘤發(fā)展中扮演重要角色。本研究結(jié)果顯示，SHP-2 在OSCC 癌組織中為高表達(dá)，且與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織分化程度均存在密切的聯(lián)系，說明SHP-2 可能參與OSCC 的增殖與轉(zhuǎn)移，SHP-2 或許可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的相關(guān)指標(biāo)。

有研究顯示，OSCC 患者的惡性進(jìn)展和其腫瘤血管生成之間存在密切聯(lián)系，但有關(guān)OSCC 患者血管生成的調(diào)控機(jī)制尚未明確［14］。Ang-2 屬于促血管生成素中的一員，是近年來發(fā)現(xiàn)與血管生成、成熟的相關(guān)因子之一。在正常人組織中，Ang-2 主要表達(dá)于女性胎盤、卵巢組織的血管重建中，在機(jī)體正常組織中并無表達(dá)或?yàn)闃O低表達(dá)。在多數(shù)惡性腫瘤中，如胃癌、腦膠質(zhì)瘤、肝癌等患者中Ang-2陽性表達(dá)率升高，且其表達(dá)異常發(fā)生于癌變的早期，與腫瘤侵襲程度、預(yù)后均有密切的聯(lián)系［15-16］。本研究結(jié)果顯示，Ang-2 在OSCC 癌變組織中表達(dá)上調(diào)，在正常組織中表達(dá)較低，與以往研究結(jié)果一致［17］，分析原因可能與腫瘤發(fā)展過程中新生血管生成，進(jìn)而引起Ang-2 的表達(dá)增加有關(guān)。而Ang-2與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，說明隨著腫瘤惡性程度增加，Ang-2 表達(dá)上調(diào)，Ang-2 可能通過參與OSCC 患者的血管生成，進(jìn)而在腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著作用。

通過分析患者預(yù)后情況可知，TEAD4、SHP-2、Ang-2 在預(yù)后不良患者中均為高表達(dá)，且三者與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、組織分級(jí)均屬于影響OSCC患者預(yù)后的相關(guān)因素，與以往研究結(jié)果相符［18］，說明TEAD4、SHP-2、Ang-2 表達(dá)情況對(duì)患者預(yù)后情況評(píng)估有一定參考價(jià)值，臨床對(duì)存在相關(guān)危險(xiǎn)因素者需引床重視，及時(shí)采取干預(yù)措施，對(duì)TEAD4、SHP-2、Ang-2 高表達(dá)者在手術(shù)治療后可合理輔助其他手段來提高患者預(yù)后。

綜上所述，TEAD4、SHP-2 及Ang-2 在OSCC癌組織中均異常高表達(dá)，與患者病理特征及預(yù)后均存在相關(guān)性，三者或許可成為OSCC 診斷及預(yù)后的相關(guān)腫瘤標(biāo)記物，對(duì)臨床診療方案制定也有一定參考價(jià)值。