程剛 李東鵬 張華鵬 劉華 孫峰 梁海 李龍海

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球消化系統(tǒng)最常見的癌癥之一，發(fā)病率和死亡率居前列［1］。2015年中國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查報(bào)告顯示，CRC 患者和死亡人數(shù)分別為37.63 萬人和19.1 萬人，其次是胃癌、肝癌和食道癌［2］。目前，CRC 的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，主流觀點(diǎn)認(rèn)為與基因或表觀遺傳不穩(wěn)定、飲食習(xí)慣、接觸化學(xué)致癌物質(zhì)、腫瘤血管生成等因素有關(guān)［3］。CXCL7 是一種中性粒細(xì)胞激活趨化因子，主要來源于外周血小板，其通常被認(rèn)為與調(diào)節(jié)糖酵解、有絲分裂和前列腺素合成等有關(guān)。近年來國(guó)外研究報(bào)道了CXCL7 與CRC 患者預(yù)后相關(guān)，可作為CRC 的診斷生物標(biāo)志物［4-5］，然而關(guān)于CXCL7 在CRC 的發(fā)生與發(fā)展中的作用機(jī)制卻鮮有研究。本研究通過一系列實(shí)驗(yàn)來評(píng)估分泌性趨化因子對(duì)CRC 腫瘤微環(huán)境的影響，探究趨化因子CXCL7 對(duì)CRC 細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響與血管生成的關(guān)系，旨在闡明CXCL7 促進(jìn)CRC發(fā)展的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與試劑

人CRC 細(xì)胞系SW620（美國(guó)ATCC 公司）；NCM460 正常細(xì)胞株（美國(guó)ATCC 公司）；慢病毒載體LV5（EF-1aF/GFP&Puro）（蘇州吉瑪基因科技有限公司）；胎牛血清（批號(hào)1658396，Hyclone 公司）；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（批號(hào)HUVEC001，澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司）；Transwell 小室（康寧公司）；Matrigel 膠（美國(guó)BD 公司）；PBS（批號(hào)20140918，北京索萊寶科技有限公司）；細(xì)胞周期測(cè)定試劑盒（美國(guó)BD 公司）；胰蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）；凋亡測(cè)定試劑盒（Beyotime 公司）；ECL 試劑盒（美國(guó)Millipore 公司）；ELISA 試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（VICTOR X5，美國(guó)Perkinelmer 公司）；BX53MRF-S 顯微鏡（日本Olympus 公司）；垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)MIR-162-PC/MIR-262-PC，日本松下公司）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的CRC 細(xì)胞在培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并添加10%胎牛血清、100 μg/mL 的鏈霉素100 μL。所有細(xì)胞均置于飽和濕度、37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 CXCL7 穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建

通過qPCR 及ELISA 法檢測(cè)CRC 細(xì)胞株的表達(dá)情況，挑選出高低表達(dá)細(xì)胞株，對(duì)高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行敲降（Knock down），低表達(dá)細(xì)胞株行過表達(dá)（Over expression）處理?？寺∥稽c(diǎn)：NotI BamHI，借助慢病毒載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞株構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)以及敲降細(xì)胞株。

1.2.3 CXCL7 對(duì)CRC 細(xì)胞增殖能力的影響

使用CCK-8、EdU 染色和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定CXCL7 對(duì)CRC 細(xì)胞增殖能力的影響。

1.2.4 CXCL7 對(duì)CRC 細(xì)胞周期和凋亡作用

收集CXCL7 過表達(dá)及敲降的穩(wěn)轉(zhuǎn)株，PBS 洗滌，75%乙醇固定后，PBS 繼續(xù)漂洗1～2 次，使用細(xì)胞周期測(cè)定試劑盒，流式細(xì)胞儀測(cè)定各管細(xì)胞周期分布情況。同樣使用不含ETDA 的胰蛋白酶消化處理細(xì)胞，經(jīng)固定與漂洗后，使用凋亡測(cè)定試劑盒，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 Transwell 腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

Transwell 小室上層加入CXCL7+NC 組細(xì)胞，下層加入血清培養(yǎng)液，中間加入膠。4%多聚甲醛固定10 min，1%結(jié)晶紫染色30 mim，鏡下觀察并拍照，100 倍光鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，平均值作為計(jì)算結(jié)果并進(jìn)行比較。

1.2.6 趨化因子CXCL7 對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)

96 孔板放置于-20℃預(yù)冷，每孔以50 μL Matrigel 膠包被，置于37℃中孵育30 min，使膠凝固；胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用人LoVo 細(xì)胞培養(yǎng)上清液重懸后計(jì)數(shù)，細(xì)胞接種于Matrigel 膠包被的96 孔板，每孔接種100 μL 中細(xì)胞數(shù)4 000 個(gè)。培養(yǎng)板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后加入Calcein-AM/PBS 溶液，37℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2 次，熒光顯微鏡下觀察并拍照計(jì)數(shù)管腔形成數(shù)目。

1.2.7 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGF-R）表達(dá)水平測(cè)定

ELISA 試劑盒測(cè)量培養(yǎng)上清VEGF 水平，Western blot 檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGF-R）表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值比較

48、72 h 各組吸光度比較：CXCL7 干擾組＞NC 組＞空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值比較（±s）Table 1 Comparison of cell proliferation rates in each group at each time point（±s）

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)吸光度值比較（±s）Table 1 Comparison of cell proliferation rates in each group at each time point（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與NC 組比較，bP＜0.05。

72 h 1.41±0.12ab 1.13±0.11a 1.01±0.13 17.475＜0.001組別CXCL7 干擾組NC 組空白對(duì)照組F 值P 值n6 6 6 0 h 0.25±0.02 0.24±0.01 0.25±0.01 1.000 0.391 24 h 0.34±0.02 0.32±0.02 0.31±0.03 2.471 0.118 48 h 0.82±0.10ab 0.69±0.08a 0.62±0.09 7.567 0.005

2.2 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

遷移細(xì)胞數(shù)比較：CXCL7 干擾組（1021.14±106.55）個(gè)＞空白對(duì)照組（348.36±48.64）個(gè)＞NC 組（331.98±46.81）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1%結(jié)晶紫染色，×100）Figure 1 Transwell cell migration test results in each group（1% crystal violet stain，×100）

2.3 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

侵襲進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)比較：CXCL7 干擾組（103.21±15.33）個(gè)＞空白對(duì)照組（28.54±8.17 個(gè)＞NC組（24.65±8.36）個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)

處理CRC 細(xì)胞6 h 后，結(jié)果顯示空白對(duì)照組和NC 組僅有少量小管形成，而CXCL7 干擾組卻形成了大量網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的小管。管腔形成數(shù)目：CXCL7 干擾組＞NC 組＞空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、圖2。

表2 各組管腔形成數(shù)目比較（±s）Table 2 Comparison of the number of formed lumen in each group（±s）

表2 各組管腔形成數(shù)目比較（±s）Table 2 Comparison of the number of formed lumen in each group（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；與NC 組比較，bP＜0.05。

組別CXCL7 干擾組NC 組空白對(duì)照組F 值P 值n6 6 6管腔數(shù)（個(gè)）28.14±3.22ab 15.89±2.16a 4.47±1.10 155.272＜0.001

圖2 各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 2 Experimental results of umbilical vein endothelial cells angiogenesis in each group

2.5 各組VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達(dá)率比較

VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達(dá)率：CXCL7 干擾組＞NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達(dá)率比較（±s）Table 3 Comparison of VEGF levels and VEGF-R positive expression rates in each group（±s）

表3 各組VEGF 水平及VEGF-R 陽性表達(dá)率比較（±s）Table 3 Comparison of VEGF levels and VEGF-R positive expression rates in each group（±s）

組別CXCL7 干擾組NC 組t/χ2值P 值VEGF（pg/mL）576.25±84.63 357.47±28.34 15.504＜0.001 VEGF-R 陽性表達(dá)率（%）90.0（36/40）67.5（27/40）6.050 0.014

3 討論

近年來國(guó)內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，一些趨化因子在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及血管形成過程中發(fā)揮重要作用［6-7］。趨化因子是一種8～12 kDa的分泌蛋白，可以調(diào)節(jié)白細(xì)胞的遷移，并參與炎癥或傷口組織的修復(fù)等生理和病理過程。根據(jù)N 末端附近保守半胱氨酸的位置，這些小蛋白可分為CXC-、CX3C-、CC- 和XCL 亞組趨化因子［8-9］。CXCL7 屬于ELR+CXC 趨化因子，其功能與其受體CXCR2 結(jié)合，并通過將中性粒細(xì)胞聚集到血管損傷部位，影響機(jī)體免疫反應(yīng)［10］。目前，CXCL7 已被證明是乳腺癌、肺癌等多種癌癥中重要的腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)劑，也是癌癥診斷中的潛在生物標(biāo)志物［11］。但關(guān)于CXCL7 在CRC 發(fā)生與發(fā)展中的作用機(jī)制研究較為少見。本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上，運(yùn)用分子生物學(xué)手段及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)系統(tǒng)研究CXCL7 對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的影響，以及對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲的影響，闡明CXCL7 促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展的分子機(jī)制。本研究有望在趨化因子調(diào)節(jié)水平為CRC 的診斷及防治提供新的視角和理論依據(jù)，并為CRC 的靶向治療和預(yù)后提供重要指導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，CXCL7 干擾組吸光度明顯高于NC 組與空白對(duì)照組，細(xì)胞增殖作用明顯增強(qiáng)，Transwell 實(shí)驗(yàn)中CXCL7 干擾組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均多于NC 組與空白對(duì)照組，說明CXCL7 具有協(xié)助細(xì)胞增殖、遷移與侵襲的作用。血管生成是一個(gè)重要的生理過程，在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中也起著關(guān)鍵作用。血管生成為腫瘤的發(fā)展提供了營(yíng)養(yǎng)支持，并促進(jìn)腫瘤的持續(xù)生長(zhǎng)。近年來相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，血管生成在CRC 復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中起重要作用，許多蛋白質(zhì)和信號(hào)分子與CRC 細(xì)胞中的血管生成有關(guān)，包括VEGF 和趨化因子。VEGF 在CRC 腫瘤中高表達(dá)并與不良預(yù)后相關(guān)。既往研究專注于CRC 患者血清中的CXCL7，及其在CRC 預(yù)后中的潛在應(yīng)用，然而，CXCL7 和血管生成之間的關(guān)系鮮為研究。近年來，一些研究揭示了趨化因子在調(diào)節(jié)血管生成中的作用，如CCL19 通過下調(diào)CRC 細(xì)胞中VEGF-A的表達(dá)來抑制血管生成的能力［13］。因此，可將此類研究作為研究CXCL7 在CRC 患者血管生成中作用的基礎(chǔ)進(jìn)行參考。本研究結(jié)果說明趨化因子CXCL7 可增強(qiáng)小管形成能力，促進(jìn)腫瘤血管形成。此外，通過選擇VEGF 作為血管生成的標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)CXCL7可增強(qiáng)CRC 細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)。Du 等［14］報(bào)道，CXCL7通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號(hào)通路與腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、遷移和血管生成有關(guān)。AKT 信號(hào)通路存在于人的所有細(xì)胞中，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、遷移等多種代謝過程［15］。CXCL7 還可以通過與腫瘤血管生成相關(guān)的Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路發(fā)揮其作用。CXCL7 可加速腫瘤轉(zhuǎn)移通過調(diào)節(jié)VEGF-R 在CRC 中的表達(dá)。因此，CXCL7 可能是通過激活A(yù)KT 等信號(hào)通路參與CRC 的發(fā)生與發(fā)展。綜上所述，趨化因子CXCL7 可調(diào)控腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤血管形成，進(jìn)而協(xié)助結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲。本研究下一階段的研究任務(wù)主要是通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探究CXCL7 對(duì)裸鼠CRC 細(xì)胞成瘤能力的影響。