于婷 胡澤斌 黃杰 孫楠

地中海貧血（以下簡(jiǎn)稱地貧）是指因珠蛋白基因缺陷（包括點(diǎn)突變、缺失等）導(dǎo)致的一種常染色體隱性遺傳?。?-3］，重者以進(jìn)行性溶血性貧血為主要特征。我國(guó)以兩廣地區(qū)、海南等南部沿海地區(qū)發(fā)病率最高［4］。重型地貧目前尚無(wú)經(jīng)濟(jì)有效的治療方法，因此通過(guò)遺傳咨詢與產(chǎn)前篩查技術(shù)是避免重型胎兒出生的最佳措施。截止到2022年7月，已有20 多個(gè)地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒獲得醫(yī)療器械注冊(cè)證，檢測(cè)原理包括跨越斷裂點(diǎn)PCR（Gap-PCR）等。由于檢測(cè)原理及平臺(tái)不同，存在漏檢、假陰性及交叉反應(yīng)等風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，中國(guó)食品藥品檢定研究院（以下簡(jiǎn)稱中檢院）在2017年發(fā)布了地中海貧血核酸檢測(cè)國(guó)家參考品（以下簡(jiǎn)稱國(guó)家參考品），作為統(tǒng)一尺度評(píng)價(jià)各類試劑盒的性能。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，第三代測(cè)序技術(shù)（即單分子測(cè)序）也開始應(yīng)用在地中海貧血基因突變檢測(cè)上，部分已開發(fā)成試劑盒。由于國(guó)家參考品研制時(shí)，只采用了當(dāng)時(shí)已上市試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證，并不包含三代測(cè)序技術(shù)的試劑盒，因此本研究擬開展該套參考品適用范圍的擴(kuò)展研究。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

地中海貧血核酸檢測(cè)國(guó)家參考品，批號(hào)：360014-201701，32 支/套，包含α 缺失和突變、β 缺失和點(diǎn)突變以及正常人樣本，由中檢院研制并提供。

1.2 試劑

地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（單分子測(cè)序法）、核酸提取或純化試劑、測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒（杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司）；Qubit dsDNA HS Assay Kit（美國(guó)ThermoFisher SCIENTIFIC 公司）；No-Amp Accessory Kit、Sequel II Binding Kit 2.1、SMRT Cell 8M（1-Cell Tray）、Sequel II Sequencing Plate 2.0（1 rxn）（美國(guó)Pacific Biosciences 公司）。

1.3 儀器和軟件

Sequel II CNDx 基因測(cè)序儀、地中海貧血基因檢測(cè)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)（杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司）；Qubit 熒光定量?jī)xQubit3.0（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；基因擴(kuò)增儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（單分子測(cè)序法）試劑盒檢測(cè)原理

基于第三代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)的單分子實(shí)時(shí)DNA測(cè)序技術(shù)（Single Molecule Real-Time，SMRT）。針對(duì)人全血樣本，通過(guò)在各突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)引物，直接對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行長(zhǎng)片段擴(kuò)增，在目標(biāo)DNA 長(zhǎng)片段兩端連接接頭，使用消化酶去除非環(huán)狀片段，最終獲得啞鈴狀文庫(kù)。試劑盒配套使用基因測(cè)序儀Sequel II CNDx，構(gòu)建好的啞鈴狀文庫(kù)結(jié)合測(cè)序引物和酶，在SMRTCell 的納米小孔（ZMW）中進(jìn)行單分子測(cè)序。測(cè)序后的基因序列對(duì)比到參考基因序列上，通過(guò)生物信息軟件分析，識(shí)別攜帶基因突變的DNA 序列，獲得相關(guān)基因突變信息。具體過(guò)程見圖1。

圖1 地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（單分子測(cè)序法）試劑盒檢測(cè)原理Figure 1 The detection principle of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing）kit

1.4.2 適用性研究方案

按照α/β-地中海貧血基因分型檢測(cè)試劑盒行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（YY/T 1527-2017）［5］及國(guó)家參考品說(shuō)明書要求，確定研究項(xiàng)目為準(zhǔn)確性、特異性及檢測(cè)限。要求檢測(cè)試劑盒范圍內(nèi)的國(guó)家陽(yáng)性參考品，結(jié)果應(yīng)為相應(yīng)基因型別；檢測(cè)國(guó)家陰性參考品和試劑盒范圍外的國(guó)家陽(yáng)性參考品，結(jié)果應(yīng)為未檢出突變；檢測(cè)限濃度要求不高于10 ng/μL，本研究中采用試劑盒聲稱的檢測(cè)限濃度（3 ng/μL）進(jìn)行考察。

1.4.3 文庫(kù)構(gòu)建、純化及質(zhì)檢

取國(guó)家參考品恢復(fù)至室溫混勻備用，并將試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的國(guó)家參考品稀釋至3 ng/μL 混勻備用，即為檢測(cè)限參考品。按照試劑盒說(shuō)明書的操作方法，對(duì)國(guó)家參考品擴(kuò)增、接頭連接、消化反應(yīng)構(gòu)建DNA 文庫(kù)；完成后，立即使用配套的DNA 純化試劑盒進(jìn)行兩次純化，并對(duì)純化后到的文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)檢。采用Qubit 熒光定量?jī)x檢測(cè)，滿足以下條件方可進(jìn)行上機(jī)測(cè)序：①單個(gè)文庫(kù)濃度≥3 ng/μL；NTC 文庫(kù)濃度≤1 ng/μL；②等質(zhì)量混合后文庫(kù)濃度≥3 ng/μL。

1.4.4 上機(jī)測(cè)序

采用測(cè)序反應(yīng)通用試劑盒，按照說(shuō)明書要求對(duì)質(zhì)檢合格的文庫(kù)處理后上機(jī)。文庫(kù)上機(jī)濃度180～220 pM，推薦200 pM，文庫(kù)片段默認(rèn)2 535 bp。按照配套儀器Sequel II CNDx 基因測(cè)序儀的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程上樣，測(cè)序模式選擇CCS，測(cè)序時(shí)長(zhǎng)15 h。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果判定

采用地中海貧血基因檢測(cè)數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果判定原則為：對(duì)于α 缺失型陽(yáng)性判斷值以5%為閾值，根據(jù)--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI及WT（野生型或非缺失）的比值結(jié)果，判定為缺失型雜合突變、雙雜合突變、純和突變或者野生型；對(duì)于α 和β 點(diǎn)突變陽(yáng)性判斷值，以突變比值≥20%且≤80%，判定為對(duì)應(yīng)雜合點(diǎn)突變；突變比值＞80%，判定為對(duì)應(yīng)純合點(diǎn)突變；突變比值＜20%時(shí)，判定為N，表示未檢出檢測(cè)范圍內(nèi)的突變。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性結(jié)果

檢測(cè)范圍內(nèi)的國(guó)家陽(yáng)性參考品的檢測(cè)結(jié)果均為相應(yīng)突變型別，準(zhǔn)確性滿足要求。見表1。

表1 地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（單分子測(cè)序法）的準(zhǔn)確性結(jié)果Table 1 Accuracy results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.2 特異性結(jié)果

野生型國(guó)家參考品及檢測(cè)范圍外的國(guó)家陽(yáng)性參考品的缺失檢測(cè)結(jié)果均顯示為αα/αα，點(diǎn)突變檢測(cè)結(jié)果均顯示為“N”，特異性滿足要求。見表2。

表2 地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（單分子測(cè)序法）的特異性結(jié)果Table 2 Specific results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

2.3 檢測(cè)限結(jié)果

稀釋至3 ng/μL 的試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的國(guó)家陽(yáng)性參考品檢測(cè)結(jié)果均符合預(yù)期，檢測(cè)限滿足要求。見表3。

表3 地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒（單分子測(cè)序法）的檢測(cè)限結(jié)果Table 3 Detection limit results of thalassemia gene detection kit（single molecule sequencing method）

3 討論

地貧以α 和β 型最為常見［6-7］。缺失型α 地貧95%以上是由于α 珠蛋白基因大片段缺失所致。我國(guó)最常見的是--SEA、-α3.7 和-α4.2 缺失型突變。最常見的非缺失型α 地貧包括αWS（CD122）、αQS（CD125）等［8-9］。我國(guó)β 地貧以突變型為主，主要有IVS-Ⅱ-654、CD41/42 等［10-11］?；驒z測(cè)在地貧的防控中不可或缺。目前檢測(cè)方法主要有Gap-PCR 法、PCR-反向斑點(diǎn)雜交法、二代測(cè)序法等［12］。Gap-PCR 法主要用于缺失型α 地貧診斷［13］，該方法設(shè)備要求低、步驟簡(jiǎn)單，但不能診斷點(diǎn)突變或未知的缺失突變。PCR-反向斑點(diǎn)雜交法主要用于點(diǎn)突變檢測(cè)，可對(duì)未知樣本中多個(gè)突變進(jìn)行篩查，但檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、操作復(fù)雜、影響因素較多。二代測(cè)序技術(shù)具有高通量等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于單核苷酸多態(tài)性和小于50 bp 的插入或缺失變異檢測(cè)比較準(zhǔn)確，但是大的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)卻不是很理想。近幾年推出的單分子測(cè)序技術(shù)［14-15］，優(yōu)勢(shì)在于DNA 無(wú)需PCR 擴(kuò)增，可避免在擴(kuò)增過(guò)程中引入DNA 突變以及對(duì)富含AT 和富含GC 序列的偏好性，實(shí)現(xiàn)對(duì)每一條DNA 的單獨(dú)測(cè)序。它可產(chǎn)生超長(zhǎng)的讀長(zhǎng)結(jié)果，具有高度均一性，可獲得許多當(dāng)前測(cè)序平臺(tái)無(wú)法得到的基因組信息。因此采用單分子測(cè)序技術(shù)有利于提高地中海貧血產(chǎn)前篩查的準(zhǔn)確性。

為評(píng)價(jià)基于不同檢測(cè)原理的地中海貧血核酸檢測(cè)試劑盒的性能，中檢院建立了國(guó)家參考品，包含7 種α-突變以及18 種β-突變。本研究中，采用國(guó)家參考品對(duì)基于PacBio 單分子測(cè)序的地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：無(wú)α 缺失的樣本，--SEA、-α3.7、-α4.2和--THAI比值在0～0.88%范圍內(nèi)，遠(yuǎn)低于閾值（5%），而野生型樣本的WT 比值均在99%以上。α 缺失的樣本，--SEA、-α3.7、-α4.2、--THAI中一種或者兩種的比值在42.19%～99.83%范圍內(nèi)，遠(yuǎn)高于閾值（5%）；α 或β 點(diǎn)雜合突變樣本，突變比值均在20%～80%范圍內(nèi)，α 或β 點(diǎn)純合突變樣本，突變比值均＞80%，無(wú)α 或β 點(diǎn)雜合突變樣本，突變比值均顯示為＜20%。準(zhǔn)確性和特異性均符合預(yù)期結(jié)果，閾值設(shè)置合理。當(dāng)把試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的陽(yáng)性參考品稀釋至檢測(cè)限濃度（3 ng/μL）后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果亦滿足要求。要指出的是，5 例檢測(cè)范圍外的國(guó)家陽(yáng)性參考品，2 例為未設(shè)計(jì)相應(yīng)位點(diǎn)探針，故無(wú)檢測(cè)數(shù)據(jù)輸出，另外3 例雖設(shè)計(jì)了位點(diǎn)亦可檢出，但考慮到后期臨床樣本較難獲得，申報(bào)醫(yī)療器械注冊(cè)證難以獲批，因此在結(jié)果設(shè)置上顯示為野生型，這也是在現(xiàn)有法規(guī)體系下的一種折衷做法。以上結(jié)果表明，基于單分子測(cè)序平臺(tái)的待評(píng)價(jià)試劑盒，國(guó)家參考品檢測(cè)結(jié)果未出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性情況。綜上所述，地中海貧血核酸檢測(cè)國(guó)家參考品，適用于三代測(cè)序的地中海貧血檢測(cè)試劑盒質(zhì)量評(píng)價(jià)要求，有利于促進(jìn)同類試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化工作。