高柱，陳璐，毛積鵬，盧玉鵬，張小麗，樊志鵬，王小玲

（1 江西省科學(xué)院生物資源研究所，南昌330096）（2 井岡山生物技術(shù)研究院）

我國擁有豐富的稀土礦產(chǎn)資源，稀土元素齊全，成礦條件優(yōu)越，儲(chǔ)量居世界首位，是名副其實(shí)的稀土資源大國[1-2]。稀土農(nóng)用是我國重要的創(chuàng)新之舉，也是我國具有特色的研究成果之一，其施用方法簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)效益顯著，在糧食[3]、水果[4]、蔬菜[5]等作物上得到了較為廣泛的應(yīng)用。稀土元素具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和生理活性，可與質(zhì)膜上的生物大分子如蛋白、磷脂等結(jié)合形成比較穩(wěn)定的復(fù)合物，從而影響植物體內(nèi)生理生化代謝過程[6]。

稀土元素在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用可歸納為以下3 個(gè)方面。一是促進(jìn)植物生長發(fā)育。施用適當(dāng)濃度的稀土元素可以打破種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)、促進(jìn)植物芽和根系的生長；水稻[7]、小麥[8]、丹參[9]種子播種前經(jīng)硝酸稀土浸泡處理后，顯著提高了種子發(fā)芽率及發(fā)芽指數(shù)，同時(shí)促進(jìn)了小麥苗期旺盛生長、丹參幼苗干物質(zhì)積累與莖葉生長。二是減輕脅迫傷害，提高植物抗性。一方面，稀土離子能夠提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和細(xì)胞膜的保護(hù)功能，維持細(xì)胞膜的通透性和穩(wěn)定性，增強(qiáng)作物對(duì)逆境或脅迫的抵抗能力[10]；另一方面稀土離子可以調(diào)節(jié)植物自身抗氧化酶活性，清除過多活性氧與自由基，緩解不良環(huán)境造成的損傷[11-12]。硝酸稀土處理藜麥幼苗后提高了抗氧化酶活性，調(diào)節(jié)了滲透物質(zhì)含量，緩解了鹽脅迫的損傷[13]。三是提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)。施用適當(dāng)濃度的稀土元素可以提高植物對(duì)養(yǎng)分的吸收、轉(zhuǎn)化和利用效率，還可促進(jìn)植物自身葉綠素形成、增強(qiáng)光合效率，為提高產(chǎn)量與改善品質(zhì)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。適宜濃度的硝酸稀土處理甜瓜[14]、草莓[15]后，明顯提高了單果重和維生素C 含量，甜瓜果實(shí)可溶性固形物、可溶性糖含量也得到了提高。

鑭與其他稀土元素相比，具有化學(xué)性質(zhì)活潑、水合半徑離子小、生物活性高等特性，被認(rèn)為是作物的生理活性物質(zhì)，在調(diào)節(jié)植物生理活動(dòng)中起到重要作用[16]。植物在逆境脅迫條件下，增強(qiáng)酶促防御系統(tǒng)中保護(hù)酶的活性，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸氧化酶（APX）等抗氧化酶，可清除植物體內(nèi)的活性氧及自由基，緩解脅迫傷害[2]。稀土元素鑭不僅可以調(diào)節(jié)植物生長，還能促進(jìn)逆境條件下保護(hù)酶活性的增加、降低細(xì)胞膜過氧化作用下丙二醛的產(chǎn)生，增強(qiáng)植物抵御逆境能力[12]。鑭的合理使用對(duì)植物生長發(fā)育和品質(zhì)改善具有明顯促進(jìn)作用，研究表明，稀土元素鑭對(duì)植物生理調(diào)控表現(xiàn)出“低濃度硝酸鑭促進(jìn)、高濃度硝酸鑭抑制”效應(yīng)，高濃度硝酸鑭處理時(shí)鑭的重金屬特性會(huì)抑制植物體內(nèi)特定酶或結(jié)合蛋白的活性，甚至產(chǎn)生毒害作用[17]。

由于稀土元素鑭在植物中的作用機(jī)理較為復(fù)雜，不同植物對(duì)稀土元素鑭濃度的耐受性不盡相同，因此，不同植物及其組織、器官的最佳使用濃度還需要不斷探索。本研究以2 年生紐荷爾臍橙嫁接苗為試驗(yàn)材料，采用不同濃度的硝酸鑭溶液噴施葉片，通過測(cè)定噴施后24 h內(nèi)不同時(shí)間段臍橙葉片中抗氧化酶（SOD、POD、CAT、GR 和APX）的活性，研究其活性變化規(guī)律，分析不同濃度稀土元素鑭對(duì)臍橙葉片抗氧化酶活性的影響，為稀土元素的合理使用及其對(duì)臍橙生理代謝及品質(zhì)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在江西省科學(xué)院園藝植物高值利用研究室奉新試驗(yàn)基地（海拔64.35 m，北緯28°40′17″，東經(jīng)115°18′31″）進(jìn)行。試驗(yàn)材料為2 年生紐荷爾臍橙嫁接苗，于2020 年2 月移栽至口徑60 cm、底徑31 cm、高35 cm 的花盆中，每盆栽植1 株嫁接苗。供試盆栽土取自基地耕作層，將土壤混勻之后，每盆裝10 kg 土進(jìn)行移栽定植。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)置4 個(gè)處理：50、150、300 mg/L 硝酸鑭處理，以噴施等量清水為對(duì)照（CK）。2020 年7月中旬，選擇晴朗天氣的8：00 噴施，每個(gè)處理噴施5 株幼樹，3 次重復(fù)。于噴施當(dāng)天8：00、10：00、12：00、16：00、20：00 和次日8：00（處理時(shí)間記錄為0、2、4、8、12、24 h）采集植株中上部當(dāng)年生嫩葉。將采集的葉片剪碎混勻，液氮冷凍后-80 ℃保存待測(cè)。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

稱取臍橙葉片樣品1.0 g，液氮研磨，加入9 mL PBS 緩沖液（10 mol/L，pH 值7.2）勻漿抽提10 min。將制備好的10%勻漿液在4 ℃條件下離心20 min（8 000 r/min），取上清液置冰上待測(cè)[18]。葉片中抗氧化酶SOD、POD、CAT、GR、APX 活性均采用上海優(yōu)選生物科技有限公司的ELISA 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定，3 次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 軟件處理數(shù)據(jù)及制圖，采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度硝酸鑭處理對(duì)臍橙葉片SOD 活性的影響

SOD 廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，能將超氧化物陰離子自由基O2-迅速歧化為過氧化氫和分子氧，是在清除活性氧過程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶[19]。如圖1 所示，CK 的臍橙葉片SOD 活性在24 h 內(nèi)呈升高的趨勢(shì)，而3 個(gè)硝酸鑭處理的葉片SOD 活性均呈先升高后降低的趨勢(shì)，且峰值均出現(xiàn)在處理后4 h，此時(shí)，50、150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片SOD 活性分別為13.85、14.23 U/g，均顯著高于CK，300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片SOD 活性與CK 無顯著差異。在處理后12 h，3 個(gè)硝酸鑭處理的葉片SOD 活性均低于CK，其中300 mg/L 硝酸鑭處理差異達(dá)顯著水平。說明50、150 mg/L 硝酸鑭處理前期可促進(jìn)葉片SOD 活性的增加，加快活性氧的清除并降低自由基傷害，而300 mg/L 硝酸鑭處理對(duì)葉片SOD 活性的調(diào)節(jié)作用不明顯。

圖1 不同濃度硝酸鑭處理葉片SOD 活性的變化

2.2 不同濃度硝酸鑭處理對(duì)臍橙葉片POD 活性的影響

POD 是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶，具有調(diào)節(jié)自由基和活性氧濃度而防止膜脂過氧化的作用，是一種重要的防御保護(hù)酶[20]。如圖2所示，所有處理的葉片POD 活性在24 h 內(nèi)均呈先升高后降低的趨勢(shì)，3 個(gè)硝酸鑭處理葉片POD 活性峰值與CK 相比均有所提前，150、300 mg/L 硝酸鑭處理的峰值提前8 h，50 mg/L 硝酸鑭處理的峰值提前4 h。處理后2、4 h，3 個(gè)硝酸鑭處理葉片POD活性均顯著高于CK，且以300 mg/L 硝酸鑭處理最高；處理后8、12、24 h，50 mg/L 硝酸鑭處理葉片POD 活性均高于其他處理，且均顯著高于150、300 mg/L 硝酸鑭處理。說明硝酸鑭處理能改變臍橙葉片POD 活性變化規(guī)律，150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片POD 活性下降最快。

圖2 不同濃度硝酸鑭處理葉片POD 活性的變化

2.3 不同濃度硝酸鑭處理對(duì)臍橙葉片CAT 活性的影響

CAT 存在于細(xì)胞的過氧化物體內(nèi)，專一催化底物過氧化氫分解成氧和水[21]，在清除活性氧、維持活性氧代謝平衡方面具有重要作用[22]。從圖3 可以看出，50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性呈升高—降低—升高的趨勢(shì)，150 mg/L 硝酸鑭處理呈先降低后升高的趨勢(shì)，而300 mg/L 硝酸鑭處理呈降低—升高—降低的趨勢(shì)。CK 的葉片CAT 活性最低值（1.28 U/g）出現(xiàn)在處理后8 h，分別是50、150、300 mg/L 硝酸鑭處理的53.56%、61.24%和35.75%。50、150 mg/L 硝酸鑭處理的最低值和300 mg/L 硝酸鑭處理的峰值均出現(xiàn)在處理后12 h。處理后2、4 h，50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著高于其他處理；處理后8、12 h，300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著高于其他處理；處理后24 h，3 個(gè)硝酸鑭處理的葉片CAT 活性均顯著低于CK。表明50 mg/L 硝酸鑭處理前期可促進(jìn)CAT 活性的升高，而300 mg/L 硝酸鑭處理后期可促進(jìn)CAT 活性的升高。

圖3 不同濃度硝酸鑭處理葉片CAT 活性的變化

2.4 不同濃度硝酸鑭處理對(duì)臍橙葉片GR 活性的影響

由圖4 可以看出，3 個(gè)硝酸鑭處理均提高了葉片GR 活性，且隨處理時(shí)間的延長均呈先升高后降低的趨勢(shì)，峰值均出現(xiàn)在處理后4 h，其中150、300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片GR 活性始終顯著高于CK。隨著硝酸鑭處理濃度的升高，葉片GR 活性呈升高趨勢(shì)，最高值出現(xiàn)在300 mg/L 硝酸鑭處理后4 h，達(dá)26.08 U/g，是CK 的2.45倍，此時(shí)，150、300 mg/L硝酸鑭處理的葉片GR 活性均顯著高于50 mg/L 硝酸鑭處理?？梢?，硝酸鑭具有提高葉片GR 活性的作用，且硝酸鑭濃度越高其促進(jìn)作用越顯著。

圖4 不同濃度硝酸鑭處理葉片GR 活性的變化

2.5 不同濃度硝酸鑭處理對(duì)臍橙葉片APX 活性的影響

由圖5 可知，3 個(gè)硝酸鑭處理均降低了葉片APX活性，其中50、150 mg/L 硝酸鑭處理的降低效果更明顯，且主要出現(xiàn)在處理后4～12 h；CK 和300 mg/L硝酸鑭處理均呈先升高后降低的趨勢(shì)，處理后4 h，50、150、300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片APX 活性分別為CK（17.25 U/g）的39.07%、39.13%和56.12%。硝酸鑭處理濃度的升高對(duì)葉片APX 活性的影響表現(xiàn)為前期（處理后2 h）小、后期大，處理后4～24 h，3 個(gè)硝酸鑭處理的葉片APX 活性均顯著低于CK，其中，150 mg/L 硝酸鑭處理對(duì)葉片APX 活性的抑制效果最為明顯。

圖5 不同濃度硝酸鑭處理葉片APX 活性的變化

3 討論與結(jié)論

植物長期進(jìn)化形成一套成熟的抵御逆境脅迫的抗氧化系統(tǒng)[23]，正常條件下，植物通過抗氧化劑與抗氧化酶系統(tǒng)共同維持細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝的動(dòng)態(tài)平衡[24]。植物受到脅迫時(shí)，細(xì)胞穩(wěn)態(tài)遭到破壞，誘導(dǎo)產(chǎn)生超氧陰離子、羥自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫、脂類過氧化物等化學(xué)性質(zhì)活潑的活性氧，當(dāng)體內(nèi)積累大量活性氧時(shí)，抗氧化酶系統(tǒng)啟動(dòng)自我防御功能，通過調(diào)節(jié)抗氧化酶活性清除過多的活性氧，以維持體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡，控制膜過氧化程度，增強(qiáng)脅迫抵御能力[25]。

3.1 硝酸鑭處理濃度對(duì)抗氧化酶活性的影響

SOD、POD、CAT 的協(xié)同作用組成了植物防御系統(tǒng)中的一個(gè)抗氧化鏈條[26]。SOD 在活性氧清除過程中首先發(fā)揮作用，將超氧化物陰離子迅速歧化為過氧化氫和分子氧，而歧化反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化氫會(huì)立即被POD 和CAT 分解為完全無害的水，從而降低自由基對(duì)細(xì)胞造成的功能性傷害[27]。不同濃度硝酸鑭處理在不同時(shí)間段對(duì)臍橙葉片中SOD、POD、CAT 活性的影響差異較大。葉片SOD 活性在處理后4 h 出現(xiàn)峰值，且隨著處理濃度的升高呈先升高后降低的趨勢(shì)，150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片SOD 活性最高。300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片POD 活性峰值出現(xiàn)在處理后4 h，而50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片POD活性峰值出現(xiàn)在處理后8 h，且均顯著高于其他處理。葉片CAT 活性在處理后表現(xiàn)出顯著差異，處理后2 h，50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著高于CK，300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性顯著低于CK，而150 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性與CK 無顯著差異，說明硝酸鑭對(duì)臍橙葉片中抗氧化酶活性同樣顯現(xiàn)了“低濃度硝酸鑭促進(jìn)、高濃度硝酸鑭抑制”的效應(yīng)[17]。硝酸鑭處理能夠提高抗氧化酶活性，加快活性氧與丙二醛的清除，從而降低膜脂的過氧化，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的作用。在本研究中，能夠促進(jìn)葉片SOD 活性增加的適宜硝酸鑭濃度為150 mg/L，而促進(jìn)葉片POD 和CAT 活性增加的適宜硝酸鑭濃度為50 mg/L。

抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)作為植物清除活性氧的通路之一，通過調(diào)控抗氧化非酶物質(zhì)含量和抗氧化酶活性來減輕氧化應(yīng)激損傷，在植物應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)的防御體系中扮演重要角色[20]。GR 和APX 是AsA-GSH 循環(huán)中的主要酶系，維持氧化還原水平、保護(hù)葉綠體和其他細(xì)胞組分免受活性氧的毒害，從而提高植物氧化脅迫的耐受性[28]。本研究中，葉片GR 活性隨硝酸鑭處理濃度的升高而升高，且大多數(shù)時(shí)期顯著高于CK，處理后4 h 出現(xiàn)峰值，其中300 mg/L 硝酸鑭處理的葉片GR 活性最高達(dá)26.08 U/g。提高葉片GR 活性有助于維持或增加細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量，以維系膜蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[29]。本研究表明，不同濃度硝酸鑭處理的葉片APX 活性大多數(shù)時(shí)期顯著低于CK，50、150 mg/L 硝酸鑭處理對(duì)葉片APX 活性的降低效果更明顯。高活性APX會(huì)降低抗壞血酸含量，在AsA-GSH 循環(huán)中APX 以抗壞血酸為電子供體，還原過量的過氧化氫，硝酸鑭處理后降低了臍橙葉片APX 活性，低活性APX更有利于維持細(xì)胞內(nèi)抗壞血酸含量及氧化還原的平衡[30]。硝酸鑭處理可降低臍橙葉片APX 活性、提高葉片GR 活性，該結(jié)論與Shan等[15,31]、李進(jìn)等[29]的研究結(jié)論一致?？箟难?、谷胱甘肽等非酶促抗氧化劑直接與活性氧接觸發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)還可作為活性氧清除的催化劑，加速活性氧清除過程[31]，平衡細(xì)胞內(nèi)AsA/DHA、GSH/GSSG 氧化還原水平，低活性APX 可減少抗壞血酸降解，高活性GR 可促進(jìn)谷胱甘肽合成，能夠減輕不利環(huán)境對(duì)臍橙葉片造成的傷害。因此，能夠提高臍橙葉片GR 活性的適宜硝酸鑭濃度為300 mg/L，而降低APX 活性的適宜硝酸鑭濃度為150 mg/L。

研究表明，稀土元素鑭對(duì)植物生長發(fā)育的影響取決于濃度，過量的鑭將抑制植物生長、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和擾亂生理代謝；低濃度的鑭可以促進(jìn)根系生長、種子萌發(fā)、莖葉生長以及介導(dǎo)次生代謝、調(diào)節(jié)氮同化等，同時(shí)可以緩解植物環(huán)境脅迫下的氧化損傷[32]。本研究結(jié)果顯示，300 mg/L 硝酸鑭處理促進(jìn)了葉片GR 活性升高，抑制了SOD 活性增加；150 mg/L 硝酸鑭處理提高SOD 活性的效果最佳，同時(shí)對(duì)葉片APX 活性的抑制效果最好；50 mg/L 硝酸鑭處理提高了葉片POD 活性，對(duì)葉片APX 活性的抑制效果明顯優(yōu)于300 mg/L 硝酸鑭處理，同時(shí)在處理前期提高了葉片CAT 活性，這可能與抗氧化酶參與的生理代謝調(diào)控途徑不同有關(guān)。

3.2 硝酸鑭處理時(shí)間對(duì)抗氧化酶活性的影響

硝酸鑭處理臍橙葉片的時(shí)間長短對(duì)SOD、POD、CAT、GR 活性的影響差異較大，3 個(gè)硝酸鑭處理的葉片SOD 活性均在處理后4 h 出現(xiàn)峰值；300 mg/L硝酸鑭處理的葉片POD 活性在處理后4 h 出現(xiàn)峰值，而50 mg/L 硝酸鑭處理POD 活性峰值出現(xiàn)在處理后8 h；50 mg/L 硝酸鑭處理的葉片CAT 活性峰值出現(xiàn)在處理后2 h，300 mg/L 硝酸鑭處理的峰值出現(xiàn)在處理后12 h；3 個(gè)硝酸鑭處理的葉片GR 活性峰值出現(xiàn)在處理后4 h。

綜上所述，硝酸鑭處理能夠促進(jìn)臍橙葉片抗氧化能力的提高，通過抗氧化酶和抗氧化劑共同作用，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生與消除的動(dòng)態(tài)平衡，增強(qiáng)臍橙葉片對(duì)環(huán)境脅迫的耐受性。