侯曉明，江 怡，劉 燦，楊 洋，張金友

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞與遺傳工程黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038）

乳脂是牛乳中重要營養(yǎng)成分，也是牛乳獨(dú)特風(fēng)味構(gòu)成因素之一。甘油三酯（Triglyceride，TAG）在乳脂中占比最大，約占脂類總量98%[1]。乳脂中TAG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成，新生TAG由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜包裹，形成細(xì)胞內(nèi)乳脂滴。PLIN3是PAT蛋白家族成員，最早在胎盤中被發(fā)現(xiàn)[2]。PLIN3為脂滴結(jié)合蛋白，主要富集在以TAG為核心的細(xì)胞內(nèi)脂滴膜上[3]。PLIN3蛋白水平與細(xì)胞中TAG水平直接相關(guān)，抑制PLIN3表達(dá)可阻止細(xì)胞內(nèi)脂滴發(fā)育，減少TAG向脂滴摻入，從而影響脂類在細(xì)胞內(nèi)積累[4]。Pavlova等對(duì)人乳樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)PLIN3與乳中脂質(zhì)含量存在顯著正相關(guān)，表明PLIN3對(duì)乳脂合成具有促進(jìn)作用[5]。Redwan和Chong等研究發(fā)現(xiàn)，在牛脂滴中，小的乳脂滴膜上存在PLIN3表達(dá)[6-7]。本試驗(yàn)前期研究發(fā)現(xiàn)PLIN3在泌乳期奶牛乳腺組織中高表達(dá)，表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他PLIN家族成員，提示PLIN3可能與泌乳奶牛乳脂合成相關(guān)。PLIN3在泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的具體功能和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。

短鏈脂肪酸是泌乳奶牛乳脂合成的底物，也可作為調(diào)節(jié)物調(diào)控乳脂合成[8]。mTOR是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白關(guān)鍵信號(hào)分子，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶家族。mTOR在細(xì)胞內(nèi)可感知營養(yǎng)信號(hào)，參與乳腺發(fā)育和泌乳調(diào)節(jié)[9]。張花等研究表明短鏈脂肪酸以劑量依賴方式激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成[10]。Cheng等在牛乳腺上皮細(xì)胞中研究發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸可通過誘導(dǎo)mTOR信號(hào)通路分子S6K磷酸化，提高SREBP1表達(dá)，上調(diào)脂肪酸合成相關(guān)酶ACC和FASN的mRNA表達(dá)水平[11]。PLIN3作為泌乳奶牛乳腺組織中高表達(dá)的脂滴相關(guān)蛋白，短鏈脂肪酸是否可誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)，以及短鏈脂肪酸對(duì)PLIN3表達(dá)的誘導(dǎo)作用是否與mTOR信號(hào)通路相關(guān)目前尚不清楚。

為闡明PLIN3在泌乳奶牛乳脂合成中的作用及調(diào)節(jié)方式，本研究以泌乳期奶牛乳腺上皮細(xì)胞為試驗(yàn)材料，通過基因過表達(dá)及Western bolt方法檢測PLIN3對(duì)乳脂合成的影響，利用乙酸和β-羥丁酸誘導(dǎo)乳脂合成，結(jié)合添加信號(hào)通路抑制劑方法研究mTOR信號(hào)通路在短鏈脂肪酸誘導(dǎo)的PLIN3表達(dá)和乳脂合成之間信號(hào)傳遞作用，旨在明確奶牛乳腺泌乳過程中PLIN3調(diào)節(jié)乳脂合成分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：Ⅰ型膠原酶（購自上海Sigma），DMEM/F12（購自美國Life technology），TAG檢測試劑盒（購自北京普利來基因技術(shù)有限公司），BCA濃度檢測試劑盒（購自大連TaKaRa），EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶（購自美國Thermo），Lipofectamine 2000（購自美國Invitrogen），雷帕霉素（購自北京Biotopped），PLIN3抗體、β-ACTIN抗體、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（購自武漢ABclonal），mTOR、P70S6K、4E-BP1、p-mTOR、p-P70S6K、p-4E-BP1、CK18抗體（購自美國Cell Signaling Technology）BODIPY493/503（購自美國Invitrogen）、抗熒光淬滅封片劑（購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

主要儀器：CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（購自美國Thermo），激光共聚焦顯微鏡（購自德國Leica），PCR儀（購自美國Eppendorf），酶標(biāo)儀（購自美國Thermo），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（購自北京賽智生物制品有限公司）。

1.2 牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)、純化及處理

本試驗(yàn)選取泌乳期的中國荷斯坦奶牛乳腺組織，采用膠原酶消化法分離乳腺上皮細(xì)胞。具體步驟如下：將新鮮乳腺實(shí)體組織塊先用75%酒精沖洗，后用含青霉素（100 U·mL-1）和鏈霉素（100 μg·mL-1）的D-Hanks清洗2～3次，于超凈工作臺(tái)中使用干凈無菌剪刀剪至肉糜狀，置于膠原酶中37℃充分消化。使用400目銅網(wǎng)過濾，濾液室溫1 000 r·min-1離心10 min沉淀細(xì)胞，使用無血清DMEM/F12重懸，1 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)2～3次，完全培養(yǎng)基重懸鋪瓶，放入5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待單層細(xì)胞長滿，利用成纖維細(xì)胞與牛乳腺上皮細(xì)胞對(duì)胰酶敏感性不同，純化上皮細(xì)胞。

當(dāng)細(xì)胞生長至融合度80%，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換成含8 mmol·L-1乙酸鈉和1 mmol·L-1BHBA的培養(yǎng)液。處理組細(xì)胞加入0.1 mmol·L-1雷帕霉素，對(duì)照組添加DMSO。48 h后收集細(xì)胞，用于Western blot檢測。

1.3 牛乳腺上皮細(xì)胞鑒定及脂滴觀察

采用免疫熒光方法檢測細(xì)胞中CK18表達(dá)，將純化獲得的牛乳腺上皮細(xì)胞傳代至3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至80%融合度，棄培養(yǎng)液，PBS清洗細(xì)胞兩次，每次5 min。采用4%多聚甲醛室溫固定20 min后，采用10%馬血清37℃封閉1 h。棄封閉液，加入PBST稀釋的CK18抗體（1∶50）4℃孵育過夜。PBS清洗細(xì)胞3次后，加入PBST稀釋的FITC標(biāo)記的二抗（1∶200），37℃孵育1 h，含DAPI的封片劑封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察。

采用BODIPY標(biāo)記細(xì)胞中的脂滴，將純化獲得的牛乳腺上皮細(xì)胞傳代至3.5 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，采用4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS清洗細(xì)胞3次后用1 μg·mL-1BODIPY 37℃避光孵育細(xì)胞20 min。PBS清洗細(xì)胞3次后，含DAPI的封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.4 牛PLIN3表達(dá)載體構(gòu)建

利用組織/細(xì)胞RNA微量提取試劑盒提取泌乳期乳腺上皮細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用PLIN3基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物見表1。將PLIN3基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，同pcDNA3.1載體分別進(jìn)行EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切?；厥彰盖挟a(chǎn)物用T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜培養(yǎng)獲得單菌落，挑菌鑒定及測序后獲得正確質(zhì)粒。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequences of PCR primer

1.5 轉(zhuǎn)染

將細(xì)胞接種至六孔板中，待細(xì)胞生長至70%融合度，采用Lipofectamine 2000試劑轉(zhuǎn)染。對(duì)照組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2.5 μg pcDNA3.1，處理組細(xì)胞中轉(zhuǎn)染2.5 μg pcDNA3.1-PLIN3，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 Western blot檢測mTOR信號(hào)通路分子及PLIN3表達(dá)

采用含10%SDS的蛋白裂解液充分裂解細(xì)胞，將裂解液收集于蛋白樣品管，100℃煮沸10 min使蛋白變性。將蛋白經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，把硝酸纖維素膜放入含5%脫脂乳、0.1%（V/V）Tween-20的Tris緩沖液中封閉2 h。4℃下采用PLIN3、mTOR、p70S6K、4EBP1、p-mTOR、p-p70S6K、p-4E-BP1特異性抗體（所有抗體皆為兔源，1∶1 000稀釋）孵育過夜。TBST清洗3次，將膜與HRP標(biāo)記的山羊抗兔的二抗在37℃下孵育1h。TBST清洗3次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測印跡。

1.7 TAG含量測定

采用裂解液低溫處理細(xì)胞約10 min，短暫離心后收集上清加熱10 min，用于普利萊TAG檢測試劑盒對(duì)不同處理組的細(xì)胞樣品中的TAG進(jìn)行定量測定。相應(yīng)細(xì)胞樣品的蛋白濃度由BCA濃度檢測試劑盒測定，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.8 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

引物由PREMIER 5.0軟件設(shè)計(jì)；Western blot條帶使用Image-Pro Plus 6.0進(jìn)行灰度掃描；試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 6進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用t檢驗(yàn)方法對(duì)兩組不同處理數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

本研究使用的原代細(xì)胞，由消化法分離獲取利用成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對(duì)胰酶敏感性不同的特點(diǎn)，純化獲得牛乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞呈梭形，聚集生長。CK18免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞核呈藍(lán)色，視野中所有細(xì)胞均有CK18表達(dá)，呈綠色，絲狀分布于細(xì)胞核周圍（見圖1A）。采用BODIPY標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)脂滴，可觀察到乳腺上皮細(xì)胞有大量脂滴存在（見圖1B），表明該細(xì)胞具有乳脂合成能力。

圖1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定Fig.1 Identification of cultured mammary epithelial cells of dairy cows

2.2 PLIN3調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂的合成

為研究PLIN3在奶牛乳腺上皮細(xì)胞乳脂合成中作用，本試驗(yàn)構(gòu)建牛pcDNA3.1-PLIN3質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至奶牛乳腺上皮細(xì)胞，并以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）質(zhì)粒的奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為陰性對(duì)照。Western blot結(jié)果顯示pcDNA3.1-PLIN3轉(zhuǎn)染的乳腺上皮細(xì)胞中PLIN3基因表達(dá)高出對(duì)照組約3倍（見圖2A、B）；PLIN3過表達(dá)細(xì)胞中TAG含量顯著高于對(duì)照組（見圖2C；P＜0.05），提示PLIN3可正向調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細(xì)胞TAG合成。

圖2 PLIN3對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成的影響Fig.2 Effects of PLIN3 on milk fat synthesis in mammary epithelial cells of dairy cows

2.3 短鏈脂肪酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中PLIN3表達(dá)的調(diào)節(jié)

采用8 mmol·L-1乙酸鈉和1 mmol·L-1BHBA處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，乙酸鈉和BHBA處理組中PLIN3蛋白表達(dá)極顯著升高（見圖3A、B；P＜0.01）。與對(duì)照組相比，乙酸鈉和BHBA處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TAG含量極顯著增加（見圖3C；P＜0.01）。該結(jié)果顯示乙酸鈉和BHBA上調(diào)脂滴相關(guān)蛋白PLIN3表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞中乳脂合成。

圖3 短鏈脂肪酸對(duì)PLIN3表達(dá)的影響Fig.3 Effects of short-chain fatty acids on PLIN3 expression

2.4 短鏈脂肪酸通過mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)PLIN3表達(dá)

采用8 mmol·L-1乙酸鈉和1 mmol·L-1BHBA處理奶牛乳腺上皮細(xì)胞，檢測mTORC1信號(hào)通路相關(guān)蛋白變化。與對(duì)照組比較，乙酸鈉和BHBA處理組中p-mTOR、p-P70S6K以及p-4E-BP1表達(dá)極顯著增加（見圖4A、B；P＜0.01）。在添加乙酸鈉和BHBA基礎(chǔ)上添加雷帕霉素，抑制mTORC1活性，Western blot結(jié)果顯示mTORC1信號(hào)通路分子p-mTORC1、p-P70S6K以及p-4E-BP1表達(dá)降低，PLIN3表達(dá)以及乳脂合成相關(guān)基因ACC、FASN表達(dá)也相應(yīng)降低（見圖4C），且細(xì)胞中TAG含量顯著下降（見圖4D；P＜0.05）。以上結(jié)果提示短鏈脂肪酸可通過mTORC1信號(hào)通路調(diào)節(jié)PLIN3表達(dá)，調(diào)節(jié)乳脂合成。

圖4 短鏈脂肪酸通過mTORC1信號(hào)通路調(diào)節(jié)PLIN3表達(dá)及乳脂合成Fig.4 Short-chain fatty acids regulate PLIN3 expression and milk fat synthesis through mTORC1 signaling pathway

3 討論

泌乳奶牛乳腺是乳脂合成旺盛器官，乳脂中各種脂類均在乳腺上皮細(xì)胞中合成[11]。本文利用體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞作為平臺(tái)研究泌乳奶牛乳脂合成的調(diào)節(jié)。通過對(duì)分離培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行角蛋白18和脂滴熒光標(biāo)記染色可知，試驗(yàn)獲得細(xì)胞為純化乳腺上皮細(xì)胞，具有乳脂合成能力，表明其適于乳脂合成調(diào)控的相關(guān)研究。

PLIN3為脂滴相關(guān)蛋白，在脂類合成旺盛場所，如肝細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、腸細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中均檢測到PLIN3表達(dá)，提示其與脂類代謝密切相關(guān)[12-14]。在饑餓培養(yǎng)的HEK293T細(xì)胞中，PLIN3活性降低導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂解增強(qiáng)，脂肪酸氧化分解增加[15-16]。在PLIN3基因敲除的小鼠中也可觀察到脂解作用增強(qiáng)，提示PLIN3表達(dá)與脂類合成呈正相關(guān)[17]。Carroll等研究顯示PLIN3在正常生理狀態(tài)下廣泛存在于細(xì)胞質(zhì)中[18]。在脂類合成過程中，PLIN3可通過其N端包含的11-mer螺旋重復(fù)序列與細(xì)胞內(nèi)脂滴相互結(jié)合[19]。在Hela細(xì)胞TAG快速合成時(shí)期，PLIN3從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到脂滴表面，促進(jìn)脂類積累；當(dāng)PLIN3表達(dá)被抑制時(shí)，TAG合成減少[20-21]。徐會(huì)芬研究報(bào)道在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中存在PLIN3表達(dá)，當(dāng)乳脂合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子SREBP1表達(dá)下調(diào)時(shí)，PLIN3表達(dá)降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)脂類合成下降，脂解增強(qiáng)[22]。體外培養(yǎng)試驗(yàn)也表明在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中有PLIN3蛋白表達(dá)，PLIN3過表達(dá)顯著提高細(xì)胞中TAG合成，表明PLIN3表達(dá)對(duì)泌乳奶牛乳脂合成具有促進(jìn)作用。

乙酸與β-羥基丁酸是泌乳反芻動(dòng)物乳腺中乳脂合成前體物質(zhì)。宋書媛和張娜等研究表明在體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，8 mmol·L-1乙酸和1 mmol·L-1β-羥基丁酸顯著提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞中TAG含量，同時(shí)上調(diào)脂類合成相關(guān)基因ACC、ACSS2、FASN、DGAT1、PPARG以及SREBP1的mRNA及蛋白水平表達(dá)[23-24]。本研究結(jié)果顯示，在泌乳奶牛乳腺上皮細(xì)胞中，8 mmol·L-1乙酸和1 mmol·L-1β-羥基丁酸可誘導(dǎo)PLIN3基因表達(dá)上調(diào)，提示短鏈脂肪酸是PLIN3上游營養(yǎng)調(diào)節(jié)物，通過上調(diào)PLIN3表達(dá)促進(jìn)乳脂合成。這一結(jié)果與Fan等在小鼠的研究結(jié)論一致，即PLIN3表達(dá)受游離脂肪酸誘導(dǎo)[25]。在泌乳奶牛乳腺中mTOR信號(hào)通路雖然可將外源營養(yǎng)信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)上調(diào)相應(yīng)基因表達(dá)，促進(jìn)脂類合成，但尚未有報(bào)道表明PLIN3是mTOR信號(hào)通路下游靶蛋白。僅Garcia-Macla等在肝臟細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)mTOR與PLIN3在脂滴表面存在相互作用關(guān)系[26]。本研究結(jié)果顯示乙酸和β-羥基丁酸處理可激活奶牛乳腺上皮細(xì)胞中mTOR信號(hào)通路。當(dāng)采用雷帕霉素抑制乙酸和β-羥基丁酸激活mTOR，其下游信號(hào)分子P70S6K及4E-BP1的磷酸化水平顯著降低，乙酸和β-羥基丁酸對(duì)PLIN3表達(dá)的誘導(dǎo)作用也被抑制。該結(jié)果表明，在短鏈脂肪酸誘導(dǎo)的乳脂合成過程中，mTOR信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)脂滴相關(guān)蛋白PLIN3表達(dá)，促進(jìn)乳脂合成過程。

4 結(jié)論

綜上，PLIN3與奶牛乳腺上皮細(xì)胞中乳脂合成密切相關(guān)。乙酸和β-羥基丁酸通過激活mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)PLIN3表達(dá)，促進(jìn)乳脂合成，該研究結(jié)果可為深入研究泌乳奶牛乳脂合成調(diào)控機(jī)制提供理論支持。