鄭蘇楠，彭維，蘇薇薇，程春雷，王永剛*

(1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心/廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275；2.山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250101)

健骨注射液是由馬鞭草科植物黃毛豆腐柴(PremnafulvaCraib)的干燥莖加工制成，具有活血散瘀、強筋健骨、祛風(fēng)止痛等功效。健骨注射液對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)增生均有一定療效[1-2]。目前健骨注射液的研究主要集中于臨床療效及成分分析方面，尚未有針對其藥理及作用機制的研究。本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)預(yù)測健骨注射液治療骨質(zhì)疏松及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用通路。

1 方法

1.1 健骨注射液化學(xué)成分檢測 本課題組前期研究中，應(yīng)用了超快速高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿飛行時間質(zhì)譜(UFLC-Triple TOF-MS/MS)對健骨注射液的化學(xué)成分進行分析[3-5]。

1.2 化學(xué)成分對應(yīng)靶點收集 通過TCMSP(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫檢索活性成分作用靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)將其蛋白名稱轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因名稱。同時通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)進行健骨注射液活性成分作用靶點篩選，以Probability>0為篩選標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測作用靶點。將上述2個數(shù)據(jù)庫平臺篩選得到的作用靶點進行合并、去重，即為健骨注射液活性成分的作用靶點。

1.3 疾病相關(guān)靶點收集 分別以“rheumatoid arthritis”和“hypertrophic osteoarthropathy”為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和骨質(zhì)增生相關(guān)靶點，Score值越高就表明此靶點與疾病的聯(lián)系越密切，選取Score≥5的靶點作為作用潛在靶點，整理合并得到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)增生對應(yīng)的疾病靶點。

1.4 “藥物-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的健骨注射液活性成分靶點與疾病相關(guān)靶點取交集，并利用在線網(wǎng)站Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)繪制Venn圖。所得靶點交集即為健骨注射液活性成分主要作用靶點。將上述靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0中進行可視化處理，構(gòu)建“健骨注射液-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將上述所得健骨注射液活性成分主要作用靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇Multiple proteins之后將物種設(shè)置為Homo sapiens，選取中置信度medium confidence(0.400)，其余設(shè)置默認(rèn)，得到蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 信號通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)對作用靶點進行GO(Gene Ontology)富集分析，并通過KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析探尋健骨注射液治療骨質(zhì)增生及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎生物功能以及主要信號通路分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.7 分子對接 使用“Network Analyzer”插件計算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩?，選取健骨注射液核心成分和PPI網(wǎng)絡(luò)中Score排名前五的核心靶點進行分子對接。通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載核心成分的2D結(jié)構(gòu)，利用ChemBioOffice Ultra 13.0.2-Chem3D軟件將其轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)并進行優(yōu)化，使能量最小化。在RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.pdbus.org/)下載核心靶點對應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 2.5.2軟件進行去水去殘基等處理。在AutoDockTools-1.5.7軟件中設(shè)置對接網(wǎng)格點及尺寸，使對接盒子(grid box)包裹整個蛋白。使用Vina軟件進行半柔性分子對接，結(jié)合能絕對值越高，代表受體和配體親和力越高。

2 結(jié)果

2.1 活性成分檢測結(jié)果 用 UFLC-Triple TOF-MS/MS 技術(shù)，對健骨注射液進行在線分離、鑒定了31種成分，去除同分異構(gòu)體篩選后得到15種化學(xué)成分用于進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究(見表1)。

表1 健骨注射液活性成分

2.2 活性成分及疾病相關(guān)靶點收集 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫搜索共得健骨注射液活性成分相關(guān)靶點261個。將成分和靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0中進行可視化處理，構(gòu)建“健骨注射液-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)(見圖1)。其中黃色節(jié)點代表健骨注射液活性成分，藍(lán)色節(jié)點代表成分對應(yīng)相關(guān)靶點。對該網(wǎng)絡(luò)進行分析可知，該網(wǎng)絡(luò)圖中共有276個節(jié)點和524條邊。

圖1 “健骨注射液-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

通過Genecards數(shù)據(jù)庫檢索得到骨質(zhì)增生及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)靶點共520個，與健骨注射液成分對應(yīng)靶點取交集，如圖2所示，得到健骨注射液治療骨質(zhì)增生及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要作用靶點53個(見表2)。

圖2 健骨注射液與疾病的共同基因靶點數(shù)

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.3.1 “健骨注射液-成分-主要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò) 將上述健骨注射液主要靶點及疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0中進行可視化處理，構(gòu)建“健骨注射液-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。其中黃色節(jié)點代表健骨注射液活性成分，藍(lán)色節(jié)點代表成分對應(yīng)相關(guān)靶點。對該網(wǎng)絡(luò)進行分析可知，該網(wǎng)絡(luò)圖中共有64個節(jié)點和165條邊。其中同一活性成分可能對應(yīng)不同靶點，不同活性成分也可能對應(yīng)同一靶點，這表明健骨注射液是通過多成分多靶點作用于疾病。其中度值(degree)排名前四的節(jié)點所對應(yīng)的化學(xué)成分分別為芹菜素、木犀草素、柚皮素、香草酸，這4種成分作用靶點數(shù)量較多，表明它們可能是健骨注射液中主要藥理活性成分。因此選取這4種成分作為健骨注射液核心成分，后續(xù)進行分子對接操作。

圖3 “健骨注射液-成分-主要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.2 PPI網(wǎng)絡(luò) 將53個交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進行分析，得到PPI蛋白互作圖(如圖4)。該網(wǎng)絡(luò)中包含53個節(jié)點，592條邊，平均連接度為22.3，平均局部聚類系數(shù)為0.776。其中度值排名前五的節(jié)點為TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53，表明這些節(jié)點在PPI網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，節(jié)點聯(lián)系較為緊密。上述5個基因靶點可能為健骨注射液治療骨質(zhì)疏松和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的核心靶點，健骨注射液發(fā)揮藥效的機制可能與這5個基因的表達(dá)相關(guān)。因此選取這5個靶點作為核心靶點進行后續(xù)分子對接操作。

圖4 健骨注射液主要作用靶點的蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3.3 GO和KEGG富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行富集分析，共得到328條GO富集條目，其中屬于生物學(xué)過程(biological process，BP)的264條，屬于細(xì)胞組成成分(cellular component，CC)的23條，屬于分子功能(molecular function，MF)41條。靶點基因主要參與凋亡過程的負(fù)調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、膠原分解代謝過程、炎癥反應(yīng)、一氧化氮生物合成過程正調(diào)控等生物學(xué)進程，對應(yīng)細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、質(zhì)膜外側(cè)、蛋白質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)等細(xì)胞組分以及同種蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白酶結(jié)合等分子功能。GO分析結(jié)果按P值從小到大排序，排名前十的條目見表3，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，R語言可視化結(jié)果如圖5所示。

表3 GO分析結(jié)果

圖5 GO分析結(jié)果

此外，上述靶點共富集得到88條KEGG通路，相關(guān)通路有癌癥通路、美洲錐蟲病、TNF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等。富集通路按P值從小到大排序，排名前二十的條目如表4所示。將上述結(jié)果導(dǎo)入R語言進行可視化，結(jié)果如圖6所示。

表4 KEGG通路富集結(jié)果

圖6 KEGG分析結(jié)果

2.4 分子對接 利用Vina軟件將芹菜素、木犀草素、柚皮素和香草酸分別與TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53這5個核心基因靶點對應(yīng)的蛋白質(zhì)建立分子對接模型，預(yù)測20種對接模式，保留結(jié)合能絕對值最大的模式(見表5)。將對接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL 2.5.2進行可視化(見表6)，圖中黃色虛線表示小分子配體與蛋白受體之間通過氫鍵相互作用。當(dāng)結(jié)合能小于-4.25 kcal·mol-1時，化合物與靶點有一定結(jié)合活性；結(jié)合能小于-5 kcal·mol-1時，化合物與靶點有較好的結(jié)合活性；結(jié)合能小于-7 kcal·mol-1時，化合物與靶點具有強烈的結(jié)合活性[6-7]。

表5 分子對接最低結(jié)合能(kcal·mol-1)

表6 分子對接結(jié)果

3 討論

在健骨注射液治療骨質(zhì)增生和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，核心靶點有TNF、IL-6、PTGS2、IL-10、TP53等。其中白細(xì)胞介素6(IL-6)是一種多功能炎性細(xì)胞因子[8]，由炎性細(xì)胞因子介入導(dǎo)致的炎性反應(yīng)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎過程中具有重要作用[9]。有研究表明，IL-6在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中大量存在，通過多種效應(yīng)途徑參與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制，可誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，加快類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者軟骨破壞[10-11]。有研究表明TNF-α刺激滑膜細(xì)胞與成纖維細(xì)胞，大量分泌產(chǎn)生IL-6影響疾病經(jīng)進程。此外，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與TNF信號通路中IL-6、TNF和PTGS2的異常表達(dá)有關(guān)[12]。

通過KEGG信號通路氣泡圖顏色和大小可以得出，健骨注射液作用的主要通路包括癌癥通路、美洲錐蟲病、TNF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等。炎癥因子與癌癥密切相關(guān)，可以作用于腫瘤的發(fā)生、惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移等疾病進程。NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作為炎癥的一個整體啟動子，在炎癥和腫瘤之間起到重要作用[13]。研究表明，在骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中發(fā)現(xiàn)了腫瘤信號通路的高調(diào)控，腫瘤通路可能為骨性關(guān)節(jié)炎治療和診斷的潛在靶點基因[14]。T細(xì)胞受體在T細(xì)胞的功能和免疫突觸的形成中起著關(guān)鍵作用。T淋巴細(xì)胞的活化是免疫系統(tǒng)有效反應(yīng)的關(guān)鍵，T細(xì)胞受體的活化受多種共刺激受體的調(diào)節(jié)[15]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)增生及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與美洲錐蟲病存在直接聯(lián)系。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，構(gòu)建出“健骨注射液-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)模型，對健骨注射液治療骨質(zhì)增生和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的機制進行了初步預(yù)測，分析了健骨注射液治療疾病相關(guān)靶點及信號通路，發(fā)現(xiàn)健骨注射液通過多成分多靶點對疾病反應(yīng)進行調(diào)控。但本研究尚未對預(yù)測的作用機制進行驗證，將在后續(xù)研究中繼續(xù)驗證。