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        植物源農(nóng)藥銀杏酚酸提取工藝研究

        2022-11-11 03:49:16張翠翠于蓓蓓閆雪生林慧彬
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年20期
        關(guān)鍵詞:工藝

        張翠翠,于蓓蓓,閆雪生,王 芳,林慧彬*

        (1.山東省中醫(yī)藥研究院,山東濟(jì)南 250014;2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,山東濟(jì)南 250013)

        銀杏(GinkgobilobaL.)俗稱白果,為銀杏科銀杏屬落葉喬木,是裸子植物中最古老的孑遺植物,被譽(yù)為“活化石”,是我國(guó)特有的藥用植物,其藥用成分主要包括黃酮類、內(nèi)酯類、有機(jī)酚酸類等,目前銀杏黃酮和內(nèi)酯在臨床上主要用于延緩衰老、改善血液循環(huán)、治療心腦血管疾病、提高機(jī)體免疫力等方面[1-2]。長(zhǎng)期以來(lái),人們只重視銀杏的醫(yī)療價(jià)值,含有對(duì)人體有強(qiáng)致敏和致突變作用[3-4]銀杏酚酸的外種皮經(jīng)常被作為有毒有害物質(zhì)而脫除。隨著研究的不斷深入,研究人員發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸性化合物具有殺菌抑菌[5]、抗炎抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、防治病蟲害[8]的藥理作用,尤其是在農(nóng)業(yè)害蟲防治方面具有廣闊應(yīng)用前景[9]。鄭許松等[10]研究了銀杏葉粗提物對(duì)桃蚜種群的影響,結(jié)果表明,銀杏葉提取物對(duì)桃蚜有較強(qiáng)的拒食作用、胃毒毒殺作用和生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用。Jacboson[11]研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉和根的提取物對(duì)亞洲玉米螟有致死和拒食活性。鄧業(yè)成等[12]測(cè)定了銀杏葉及外種皮提取物對(duì)褐飛虱、桃蚜和菜粉蝶幼蟲的觸殺毒力,結(jié)果表明,它們對(duì)褐飛虱和桃蚜有很高的觸殺活性,對(duì)菜粉蝶有一定的觸殺活性。張素軍等[13]研究銀杏酚酸對(duì)甜瓜白粉病的防治作用,結(jié)果表明,10%銀杏酚酸懸浮劑對(duì)甜瓜白粉病具有良好防效,防效優(yōu)于80%多菌靈可濕性粉劑,且對(duì)甜瓜生長(zhǎng)安全,是防治甜瓜白粉病較理想的生物藥劑之一。因此,將其提取出來(lái)作為一種具有藥效作用的物質(zhì)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲防治是十分必要的。目前,銀杏酚酸提取工藝有浸提法、超臨界CO2萃取法、回流提取法和超聲萃取法等方法[14-16],該研究將對(duì)銀杏外種皮中銀杏酚酸的提取方法進(jìn)行優(yōu)化,最終以二氯甲烷作為提取溶劑進(jìn)行加熱回流提取,提取效率較高,可行性較好,以期為銀杏外種皮中銀杏酚酸的提取提供一個(gè)較好的方法,更好地開發(fā)銀杏的價(jià)值。

        1 材料與方法

        1.1 試驗(yàn)材料

        1.1.1儀器。LC-350A超聲波中藥處理機(jī)(濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);HH-S4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(江蘇金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠);DZF-6050型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);Sartorius BP211D電子天平(上海卓精電子科技有限公司);Waters 600高效液相色譜儀(沃特世科技有限公司)。

        1.1.2試劑。白果新酸(純度≥98%,成都普思生物科技股份有限公司,批號(hào)PS000113);總銀杏酸A(純度≥ 98%,成都普思生物科技股份有限公司,批號(hào)11594-201605);總銀杏酸 B(純度≥ 98%,成都普思生物科技股份有限公司,批號(hào)111594-201605);95%乙醇、石油醚和二氯甲烷為分析純,水為屈臣氏飲用水,甲醇、冰乙酸為色譜純。

        1.1.3試材。銀杏外種皮購(gòu)于山東濟(jì)南,經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院中藥資源室林慧彬研究員鑒定為銀杏科植物銀杏的外種皮。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1樣品的制備。將購(gòu)買來(lái)且經(jīng)過(guò)專家鑒定合格的銀杏外種皮放在烘箱中,將烘箱溫度調(diào)至70 ℃烘干,粉碎過(guò)60目篩,作為后續(xù)取樣的樣品。

        1.2.2銀杏外種皮中銀杏酚酸的含量方法的建立。

        1.2.2.1對(duì)照品溶液的配制。精密稱取對(duì)照品2 mg置10 mL容量瓶中,用甲醇定容,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得銀杏酚酸對(duì)照品溶液。

        1.2.2.2供試品溶液的配制。精密稱取銀杏粉0.2 g置100 mL 圓底燒瓶,加二氯甲烷50 mL,稱定加入銀杏粉和二氯甲烷的圓底燒瓶重量,70 ℃加熱回流提取3 h,稱重并補(bǔ)足失重,過(guò)濾取續(xù)濾液3 mL,用甲醇定容至10 mL容量瓶中,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾即得銀杏酚酸供試品溶液。

        1.2.2.3色譜條件。 lichrospher C18(5 μm,4.6 mm×250 mm)高效液相色譜柱;流動(dòng)相為甲醇-3%乙酸水(92∶8),流動(dòng)相流速為1 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm,柱溫為30 ℃。銀杏酚酸混合物、白果新酸對(duì)照品及樣品色譜圖見圖1。

        圖 1 對(duì)照品及樣品色譜圖

        1.2.2.4線性關(guān)系考察。精密稱取2 mg白果新酸置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,精密吸取0.1、0.3、0.5、1.0、1.5 mL分別置于2 mL容量瓶中,用甲醇定容,分別用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾,即得不同濃度的對(duì)照品溶液,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、白果新酸對(duì)照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸,得回歸方程為Y=86.828X-0.053 8(r=0.999 6),結(jié)果表明白果新酸在0.010 35~0.207 00 mg/mL具有良好的線性關(guān)系。

        1.2.2.5精密度試驗(yàn)。精密吸取對(duì)照品溶液,在310 nm連續(xù)測(cè)定峰面積6次,記錄峰面積。結(jié)果顯示峰面積的RSD為0.6%,表明儀器精密度良好。

        1.2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液,分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣,記錄HPLC色譜圖,結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸含量的RSD為1.22%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        1.2.2.7重復(fù)性試驗(yàn)。取銀杏粉末6份,每份約0.2 g,精密稱定重量,按照“1.2.2.2”方法制備供試品溶液,并按“1.2.2.3”色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果發(fā)現(xiàn)銀杏酚酸含量的RSD為1.94%,表明試驗(yàn)重復(fù)性良好。

        1.2.2.8加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的銀杏粉末6份,每份約0.1 g,加入白果新酸對(duì)照品,按照“1.2.2.2”方法制備供試品溶液,并按“1.2.2.3”色譜條件進(jìn)樣,使用高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定[17],并計(jì)算回收率。從表1可以看出,平均回收率為97.83%,RSD為1.96%,表明該測(cè)定方法回收率良好。

        表 1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

        1.2.3單因素試驗(yàn)。按“1.2.2.2”方法對(duì)提取工藝中各因素進(jìn)行考察:①以提取時(shí)間1、2、3、4、5 h分別提??;②以提取溫度40、50、60、70、80 ℃分別提取;③以料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12(g∶mL)分別提?。虎芤蕴崛〈螖?shù)1、2、3、4、5次分別提取。

        1.2.4正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。由文獻(xiàn)研究[18-21]和單因素試驗(yàn)結(jié)果可知各因素對(duì)銀杏外種皮銀杏酚酸提取的影響,采用L9(34)正交設(shè)計(jì)表,以銀杏酚酸提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)提取溫度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)進(jìn)行考察。

        1.3 數(shù)據(jù)處理利用正交試驗(yàn)助手及Excel等數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 單因素試驗(yàn)從圖2可以看出,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),提取效率有降低趨勢(shì),所以結(jié)合實(shí)際情況,選擇提取時(shí)間1~3 h作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。提取溫度為60 ℃時(shí)提取效率最高,選擇提取溫度40~80 ℃作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。料液比在1∶8之前提取效率略有降低趨勢(shì),1∶8之后提取效率大幅提升,所以結(jié)合實(shí)際情況,選擇料液比1∶6~1∶10作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。提取次數(shù)3次時(shí)提取效率最高,所以結(jié)合實(shí)際情況,選擇提取次數(shù)1~3次作為后續(xù)正交試驗(yàn)的因素水平。

        圖2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

        2.2 正交試驗(yàn)從正交試驗(yàn)結(jié)果的極差分析(表2)可知,二氯甲烷提取銀杏外種皮中銀杏酚酸的主次影響因素為B>D>C>A,即提取溫度>提取次數(shù)>料液比>提取時(shí)間。方差分析表明,提取溫度對(duì)銀杏酚酸提取量有顯著影響,而提取時(shí)間對(duì)提取量幾乎沒(méi)影響,提取次數(shù)和料液比有影響。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)成本,該試驗(yàn)可以得出最佳的提取工藝條件為A1B2C3D2,即提取時(shí)間為1 h,提取溫度為60 ℃,料液比為1∶10,提取次數(shù)為2次。

        表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

        2.3 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)經(jīng)過(guò)3次工藝驗(yàn)證,銀杏酚酸含量的RSD為0.8%,表明在試驗(yàn)范圍內(nèi)正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性好。

        3 結(jié)論與討論

        該試驗(yàn)選用加熱回流法提取銀杏外種皮中銀杏酚酸,利用HPLC測(cè)定其含量。通過(guò)單因素篩選主要影響因素,正交試驗(yàn)對(duì)提取的最佳工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。確定銀杏酚酸最佳提取工藝:提取溶劑為二氯甲烷,提取溫度為60 ℃,料液比為1∶10,提取時(shí)間為1 h,提取次數(shù)為2次。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證,該工藝穩(wěn)定可行、重現(xiàn)性好、成本低,銀杏酚酸提取量較高,為銀杏外種皮中銀杏酚酸的提取提供方法學(xué)依據(jù)。

        銀杏因其自身經(jīng)過(guò)自然選擇進(jìn)化而來(lái)的高效防衛(wèi)系統(tǒng),很少受到昆蟲和其他有害生物的侵害,而這種防衛(wèi)作用與植物各器官或部位所具有的次生化學(xué)物質(zhì)有著密切關(guān)系,經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)這一切均源于銀杏的酚酸類成分。長(zhǎng)期以來(lái)人們只重視銀杏的醫(yī)療價(jià)值,含有大量有毒酚酸類成分的銀杏外種皮在加工過(guò)程中經(jīng)常被當(dāng)作廢物遺棄,既污染環(huán)境又浪費(fèi)資源。將銀杏外種皮中酚酸類成分提取出來(lái),使其變廢為寶,為植物源農(nóng)藥的開發(fā)奠定了良好基礎(chǔ),為銀杏的綜合開發(fā)利用提供參考。

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