李 映，崔 瑤，葛喜珍

(北京聯(lián)合大學生物化學工程學院，北京 100023)

番茄黃化曲葉病毒(tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)引起的番茄黃化曲葉病毒病(tomato yellow leaf curl disease，TYLCD)是番茄毀滅性病害，被稱之為番茄的癌癥，造成的經(jīng)濟損失高達100%，嚴重威脅番茄產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。番茄感染TYLCV，生長停滯，頂部葉片褪綠發(fā)黃、變小，葉片邊緣上卷，葉片增厚、變硬。早期染病植株嚴重矮縮，不能正常開花結果。生長發(fā)育后期染病植株結果減少，果實小，果實著色不均勻，出現(xiàn)“ 半邊臉”，失去經(jīng)濟價值[1]。在大棚番茄種植過程中，5—10 月是TYLCV的高發(fā)時段。自然條件下，TYLCV主要通過煙粉虱以持久方式傳播[2]。煙粉虱繁殖能力強，傳毒效率高，早期預防煙粉虱是防治TYLCV的前提。

煙粉虱的防治主要采用化學農(nóng)藥的方法，如使用撲虱靈、吡蟲啉等抗蟲藥物，然而該類藥物殘留多，對人和環(huán)境危害較大[3]。相比之下，生物農(nóng)藥在抗蟲方面表現(xiàn)出良好的前景。目前已有多種抗蟲的生物農(nóng)藥用于煙粉虱等害蟲的防治，如綠僵菌、桉油精等。相比之下，生物農(nóng)藥環(huán)境友好，但有效作用時間較短，因此成本偏高[4]。然而對于因煙粉虱造成的TYLCD，化學農(nóng)藥目前沒有任何辦法予以防控和治療，只有植物免疫蛋白可以進行一定程度的預防和治療，即通過蛋白質(zhì)刺激植物產(chǎn)生類似的應激，促進植物對病害的抵抗力[5-6]。因此，建立煙粉虱和TYLCD的預警模型，且在高風險時段進行適當?shù)纳镛r(nóng)藥干預，是預防這2種病蟲害的關鍵。筆者采用大棚氣象條件檢測系統(tǒng)記錄了大棚番茄種植季節(jié)環(huán)境溫度的變化，統(tǒng)計了不同指標的關聯(lián)性，并針對番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)病規(guī)律進行了相關性研究。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況試驗設在河北省隆堯縣千戶營鄉(xiāng)東毛爾寨村，114°92′E，37°40′N，日光溫室大棚，土質(zhì)為壤土，有機種植用地，8年內(nèi)未使用化肥和化學農(nóng)藥，僅使用農(nóng)家肥、沼液和生物農(nóng)藥，土壤肥力中等，地勢平坦，排灌方便。

1.2 試驗藥劑6%寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑(3%氨基寡糖素，3%極細鏈格孢激活蛋白質(zhì))由中國農(nóng)業(yè)科學院植保所研制；醚菌酯250 g/L懸浮液，上虞穎泰精細化工有限公司；200 g/L 吡蟲啉可溶液劑，拜耳股份公司；10%小檗堿可濕性粉劑，楊凌馥稷生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌1 000億孢子/g，山東魯抗生物農(nóng)藥有限責任公司；綠僵菌80億孢子/g可濕性粉劑，重慶聚立信生物工程有限公司；5%桉油精可溶液劑，北京亞戈農(nóng)生物藥業(yè)有限公司。

1.3 試驗設備與檢測溫室大棚環(huán)境監(jiān)測系統(tǒng)由石家莊圣啟科技有限公司提供，空氣溫度測量范圍-20～70 ℃，精度±0.1 ℃；空氣濕度(RH)測量范圍0～100%，精度±2%；采集番茄種植地土壤和空氣資料，主要包括空氣溫度、濕度、光照和CO2濃度，土壤溫度、濕度和土壤電導率，檢驗環(huán)境因素與煙粉虱及番茄黃化曲葉病毒病的相關性。1 hm2掛450片黃板，色板底部高于植株上部葉片20 cm，誘捕煙粉虱成蟲，監(jiān)測其發(fā)生動態(tài)。在前期檢測大棚資料的基礎上(2014—2018)，檢驗煙粉虱與番茄黃化曲葉病毒病的相關性，根據(jù)預警防治。

1.4 預警和回歸方法使用上述設備自主檢測獲得試驗原始數(shù)據(jù)，取樣時間為4月至次年4月，覆蓋番茄種植整個周期。數(shù)據(jù)獲取后使用python進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與回歸分析。將全天空氣溫度、土壤溫度、環(huán)境濕度、光照強度等計算平均值，得每天的數(shù)據(jù)點。使用t檢驗對試驗組和對照組的各項參數(shù)進行獨立性檢驗，檢測高發(fā)和低發(fā)病率環(huán)境各項指標的顯著性。

回歸分析采用python中的numpy工具包。首先對數(shù)據(jù)進行清理，刪除數(shù)據(jù)超過前后14 d內(nèi)2倍的中位數(shù)絕對偏差值，并進行數(shù)據(jù)對齊。處理完成后針對上述數(shù)據(jù)，使用兩兩對比的回歸分析。選用指數(shù)回歸、傅里葉回歸、高斯回歸、線性回歸、多項式回歸共5種方式進行試驗，根據(jù)數(shù)據(jù)點選取合適的回歸形式及回歸方程。選取發(fā)病率檢測指標后，使用scatterplot函數(shù)繪制預警散點圖，并將其中數(shù)據(jù)點使用熱圖，加入發(fā)病率數(shù)據(jù)，得最終預警曲線。

1.5 田間試驗設計溫室長60.0 m，寬7.5 m，金棚8號B型番茄，株距0.40 m，行距0.70 m。選擇病毒病發(fā)生嚴重的冬茬番茄(9月27日定植)，澆足定植水。根據(jù)預警，在煙粉虱發(fā)生前10 d，以醚菌酯+吡蟲啉為對照，設計不同的生物農(nóng)藥防治。設11個處理，每個處理30株，3次重復，隨機區(qū)組排列。其中 CK(清水)；處理①化學農(nóng)藥(醚菌酯懸浮液1 g/1 500 mL+吡蟲啉1 g/1 500 mL)；處理②小檗堿可濕性粉劑(1 g/1 500 mL)；③寡糖·鏈蛋白可濕性粉劑(1 g/1 500 mL)；④枯草芽孢桿菌(3.5 g/1 500 mL)；⑤綠僵菌可濕性粉劑(1 g/1 500 mL)；⑥桉油精可溶液劑(2 mL/1 500 mL)；⑦小檗堿1 g/1 500 mL+免疫蛋白1 g/1 500 mL；⑧小檗堿1 g/1 500 mL+免疫蛋白1 g/1 500 mL+綠僵菌1 g/1 500 mL；⑨小檗堿1 g/1 500 mL+免疫蛋白1 g/1 500 mL+綠僵菌1 g/1 500 mL+桉油精2 mL/1 500 mL；⑩枯草芽孢桿菌1 g/1 500 mL+免疫蛋白1 g/1 500 mL。根據(jù)2014—2018年回歸和預警規(guī)律，預防試驗在煙粉虱發(fā)生前10 d用藥，治療試驗在黃化曲葉病毒出現(xiàn)當天用藥。

1.6 預防和防治施藥時間根據(jù)2016—2018年土壤和空氣資料，預防試驗于2019年9月28日(煙粉虱出現(xiàn)前10 d)，10月8日、18日 、28日，11月8日、18日17：00后噴藥，共6次噴藥，12月1日計數(shù)觀察。治療試驗分別于2019年10月8日(首次觀察到粉虱)、18日、28日，11月8日、18日、28日17：00后噴藥，共6次噴藥，12月1日計數(shù)觀察。各處理嚴格按試驗設計用藥量折算，控制用藥量和時間，其他管理措施同大棚。

1.7 調(diào)查方法

1.7.1灰飛虱調(diào)查方法。最后一次噴藥24、72 h后，各處理小區(qū)5點法取樣，每采樣點選取10株番茄，每株選取上、中、下各1片葉，統(tǒng)計成蟲數(shù)量，計算蟲口減退率。

蟲口減退率=(清水對照組蟲口數(shù)-處理組蟲口數(shù))/清水對照組蟲口數(shù)×100%

(1)

1.7.2黃化曲葉病毒調(diào)查方法。番茄感染病毒，葉片畸形、皺縮，植株輕度矮化，失去經(jīng)濟價值，故計算病株率和防治效果，計算公式：

病株率=病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù)×100%

(2)

防治效果=( 清水處理區(qū)病株數(shù)-處理區(qū)病株數(shù))/清水處理區(qū)病株數(shù)×100%

(3)

2 結果與分析

2.1 主要指標的分析與篩選在大棚番茄的全年種植季中，將發(fā)病率高和發(fā)病率低2個季節(jié)的相關氣象數(shù)據(jù)進行整理和分析，比較2個不同季節(jié)的各項指標是否存在明顯差異，結果見表1。由表1可知，在2個不同的種植季中，除土壤平均含水量不存在明顯差異外，平均氣溫、平均濕度、平均土壤溫度和平均光照強度均存在較大差別(P<0.001)。其中，土壤平均溫度的差異最為明顯。與此同時，針對發(fā)病率較高的種植季，比較了各項參數(shù)之間的相對標準偏差(RSD)，結果表明，土壤溫度的波動最小，是較為穩(wěn)定的大棚環(huán)境參數(shù)，受到外界的影響較小。

表1 不同種植季節(jié)各項環(huán)境指標的差異性檢驗和相對標準偏差

針對上述試驗結果，將不同季節(jié)的數(shù)據(jù)進行了整合，探究是否可以用較為穩(wěn)定的土壤溫度作為大棚環(huán)境的表征，探究其與病蟲害之間的關系(置信區(qū)間95%)。擬合的試驗結果見圖1。由圖1可知，土壤溫度與其他4種環(huán)境因素之間均存在較強的相關性。在不同種植季節(jié)的土壤溫度變化范圍內(nèi)，大棚內(nèi)平均氣溫、平均濕度、土壤含水量和平均光照強度之間，均可使用多項式進行描述，證明上述指標存在較強的相關性。根據(jù)不同的回歸分析結果，土壤溫度與其他環(huán)境因素之間存在的關系方程式：

圖1 土壤溫度與平均氣溫(a)、土壤濕度(b)、土壤含水量(c)和日均光照強度(d)的回歸分析

土壤溫度t與平均氣溫T的回歸曲線:

T=0.04t2-0.48t+12.82

土壤溫度t與濕度H的回歸曲線：

H=-0.39t2+11.55t+5.19

土壤溫度t與土壤含水量W的回歸曲線：

W=-0.014t3+0.653t2-9.69t+64.8

土壤溫度t與光照強度L的回歸曲線：

L=11.32t3-533.5t2-8 295t

由于土壤溫度變化波動較小，因此土壤溫度是作為番茄病毒病較為理想的指標。

2.2 煙粉虱、TYLCD發(fā)病率與土壤溫度、時間的三維分析為進一步研究環(huán)境因素的變化與煙粉虱、TYLCD發(fā)病率之間的關系，針對該2種病害發(fā)生率較高的種植季，對其土壤溫度、種植時間和發(fā)病率之間的關系進行了統(tǒng)計和分析，結果見圖2。由圖2可知，煙粉虱和TYLCD的發(fā)病率均在土壤溫度較高的環(huán)境下發(fā)生，且TYLCD的發(fā)病速率要慢于煙粉虱的發(fā)病速率，因煙粉虱是傳播TYLCD的關鍵因素。由此可知，在土壤溫度逐漸上升的種植季，是大棚番茄受到煙粉虱和TYLCD影響較大的時期。與此同時，煙粉虱和TYLCD的發(fā)病高風險區(qū)域為土壤溫度穩(wěn)定增長到20 ℃以上，此時環(huán)境溫度較高、濕度較低，且日均光照時間較長，適合煙粉虱的生長。在此溫度下，經(jīng)過約10 d的時間，煙粉虱和TYLCD進入暴發(fā)式的增長階段。因此，根據(jù)該試驗結果推斷，在土壤溫度連續(xù)大于20 ℃的情況下，應盡早進行煙粉虱和TYLCD的生物防控和干預，且預防煙粉虱是預防TYLCD的關鍵。

圖2 土壤溫度、種植時間與發(fā)病率之間的相關性分析

2.3 不同生物農(nóng)藥復合使用對煙粉虱的防治效果為研究生物農(nóng)藥對煙粉虱的防治作用，進行了相關生物農(nóng)藥的配比試驗。結果表明，預防組用藥24 h后，小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精(19.4%)、桉油精(17.0%)均有不同程度的退蟲作用，蟲口退減率在17%以上，其余各組蟲口退減率較低或出現(xiàn)殘留蟲數(shù)大于對照組(表2)。在防治組，小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精(22.0%)、桉油精(17.3%)蟲口退減率較高，其余各組蟲口退減率較低或出現(xiàn)殘留蟲數(shù)大于對照組。預防組用藥72 h后，小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精蟲口退減率最高(3.3%)，其他各組均非常低。防治組小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精蟲口退減率最高(4.4%)。上述結果說明，煙粉虱種群活躍，繁殖快，種群恢復迅速，番茄種植密度等原因決定煙粉虱種群恢復速度。同一處理各組預防與防治組間煙粉虱殘留蟲數(shù)和蟲口退減率均無顯著差異；同一處理各組72 h殘留蟲數(shù)和蟲口退減率無顯著差異，說明藥物處理能短期驅(qū)趕或抑制灰飛虱，72 h后灰飛虱種群迅速恢復。預防用藥未降低煙粉虱數(shù)量和蟲口退減率，藥劑防治煙粉虱短期有效，長期效果不顯著。

表2 不同處理對煙粉虱的預防和治療效果

2.4 不同處理對TYLCD的防治效果針對出現(xiàn)的TYLCD進行治療試驗，番茄出現(xiàn)病毒癥狀時使用殺菌劑，防效低(表3)，枯草芽孢桿菌防效最高(14.90%)，未達15%，依次為小檗堿(13.13%)、小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌(11.95%)、小檗堿+免疫蛋白(11.90%)、枯草芽孢桿菌+免疫蛋白(11.80%)、綠僵菌(9.23%)、寡糖·鏈蛋白(9.23%)、醚菌酯+吡蟲啉(9.18%)、小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精(7.85%)和桉油精(5.23%)。預防效果由高到低表現(xiàn)為小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌(70.59%)>小檗堿+免疫蛋白(57.36%)>寡糖·鏈蛋白(50.00%)>小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精(47.06%)>小檗堿(44.12%)>枯草芽孢桿菌+免疫蛋白(38.24%)>綠僵菌(22.06%)>桉油精(19.12%)>枯草芽孢桿菌(17.65%)>醚菌酯+吡蟲啉(16.18%)。單獨用藥的免疫蛋白和小檗堿防效高于44%，二者均能提高植物免疫力，通過提高免疫達到防治作用。預防試驗組，使用殺菌劑對番茄TYLCD防效明顯高于防治組。

表3 不同處理對TYLCD的防治效果

3 討論

外部氣候因素變化直接影響TYLCD的發(fā)生、發(fā)展[7-9]。該研究根據(jù)2014—2018年采集的設施番茄環(huán)境因素，檢驗空氣溫度、濕度、光照和土壤濕度，并與土壤溫度進行相關性分析。結果表明，上述指標均與TYLCD存在較強的相關性，其中隨溫度升高TYLCD發(fā)生率明顯增加。2013年，吐魯番地區(qū)溫室晚茬番茄全部感染TYLCD，導致絕收，認為氣溫高病毒傳播蔓延快，加上秋冬茬番茄播種早、株間距密、氮肥施用多、管理粗放等，有利煙粉虱危害傳毒[10-11]。由于土壤溫度變化波動小，作為番茄病毒病發(fā)生的預警指標，比較穩(wěn)定。根據(jù)回歸，當土壤平均溫度高于20 ℃，TYLCD發(fā)生概率增加，需預防用藥。

傳統(tǒng)關于煙粉虱田間預測預報，主要用黃板誘集、性信息素誘集和田間調(diào)查統(tǒng)計等方法，根據(jù)田間蟲態(tài)的發(fā)生發(fā)育進度、蟲量及天敵數(shù)量，結合田間作物生長情況，分析預測煙粉虱的發(fā)生趨勢[12]。利用大數(shù)據(jù)預警，能及時、有效地防止病蟲害暴發(fā)[13]。該研究結果表明，2014—2018年，番茄黃化曲葉病毒病嚴重發(fā)生期和輕發(fā)生期空氣溫度、空氣濕度、光照、土壤溫度、土壤濕度等與煙粉虱發(fā)生率的相關性。若土壤平均溫度高于20 ℃維持10 d以上，即使土壤溫度因天氣原因再次降低，病毒病的發(fā) 病率也無明顯改善。由圖2顏色變化看出，煙粉虱發(fā)病率的增長，相對于病毒病感染率慢[14]。因此，病毒病的防治，主要以煙粉虱的防治為主。當煙粉虱發(fā)病率超過20%，若不能有效控制，則10 d之內(nèi)病毒病的感染率會快速達60%以上，造成大棚大面積減產(chǎn)甚至絕收。

該研究結果表明，對于煙粉虱防控，預防用藥比治療用藥防效高，且持續(xù)時間長。鑒于煙粉虱極強的傳毒和繁殖力，在番茄整個生命周期，依靠化學藥劑防效低，不能實現(xiàn)對番茄黃化曲葉病毒病的有效防控。番茄大棚煙粉虱防治困難，故設施番茄生產(chǎn)過程，應密切監(jiān)控煙粉虱的發(fā)生發(fā)展。該研究使用各種生物農(nóng)藥組合，小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌+桉油精組，預防和治療24 h內(nèi)蟲口退減率可達19%～22%。隨時間推移至72 h，蟲口退減率僅為3.3%～4.4%，退蟲效果不明顯。在不同處理對TYLCD的防治效果中，根據(jù)預警，提前15 d用藥預防，TYLCD發(fā)病率明顯降低，小檗堿+免疫蛋白+綠僵菌組防效可達70.59%。國內(nèi)外關于TYLCD的防控方案，多推薦葉面噴施殺蟲劑殺滅傳毒昆蟲煙粉虱為主，在生產(chǎn)實踐中，菜農(nóng)在防治番茄TYLCD時多噴藥防治，但實際防治效果差，甚至無效果[15]。因此，在預警基礎上如提前施藥免疫蛋白+小檗堿，可提高植株免疫力，從而提高植物對TYLCD的抵抗力。