何亞琴，蘇進(jìn)達(dá)，趙少輝，王健，謝小亮

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 1. 外科學(xué)研究室 3. 結(jié)直腸外科，寧夏 銀川 750004；2. 寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004）

結(jié)直腸癌是全世界最常見(jiàn)的癌癥之一，是癌癥死亡的主要原因[1]。腸癌患者在診斷時(shí)，根據(jù)臨床分期系統(tǒng)（I～Ⅳ） 進(jìn)行分層，據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，約有20%～25% 的結(jié)腸癌患者患有轉(zhuǎn)移性疾病，另有25%的患者在隨訪期間會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，迫切需要尋找精確的生物標(biāo)志物，改善診斷、預(yù)防和治療癌癥手段，提高患者生存率。

核因子κB（nuclear kappa B，NF-κB）異常激活是腸癌惡性腫瘤中最重要的病因之一[3]。激活的NF-κB 導(dǎo)致亞單位p65 結(jié)合DNA 能力增強(qiáng)，并誘導(dǎo)炎癥、細(xì)胞增殖、癌細(xì)胞增殖等[4]。NF-κB 作為炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，在不同癌癥中發(fā)現(xiàn)NF-κB 的多個(gè)靶基因表達(dá)嚴(yán)重失調(diào)。Xu 等[5]研究發(fā)現(xiàn)羅伯酸（roburic acid）以高親和力直接與腫瘤壞死因子結(jié)合，強(qiáng)力阻斷NF-κB 信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)。Bakshi 等[6]報(bào)道體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西紅花苷可抑制NF-κB 活化，降低血管生成和腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此，NF-κB 信號(hào)通路在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，本研究探討NF-κB 信號(hào)在結(jié)直腸癌進(jìn)展中調(diào)控機(jī)制。

近來(lái)研究[7]表明，趨化因子廣泛應(yīng)用于診斷和治療癌癥的生物靶點(diǎn)，趨化因子受體5（chemokine receptor 5，CCR5）及其配體構(gòu)成趨化因子網(wǎng)絡(luò)重要調(diào)控軸，并介導(dǎo)多種生理功能及惡性腫瘤相關(guān)的其他功能。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）通過(guò)泛素化和激活下游通路引起促炎因子的釋放，在癌癥進(jìn)展中具有關(guān)鍵作用[8]。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K） 信號(hào)通路在細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖中起著決定性作用，結(jié)腸癌中編碼激活、終止或轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3K 信號(hào)的基因在體細(xì)胞中發(fā)生異常突變，而且PI3K 磷酸化異常過(guò)度表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[9]。磷酸酶和張力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）是人類(lèi)癌癥中最常見(jiàn)的突變腫瘤抑制基因之一，PTEN 基因的消融會(huì)加速多種人類(lèi)癌癥的進(jìn)展，PTEN 在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括細(xì)胞代謝、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、基因組維持和細(xì)胞衰老[10]。上述研究發(fā)現(xiàn)表明CCR5、PI3K、TRAF6、PTEN 是腫瘤進(jìn)展關(guān)鍵調(diào)控信號(hào)，但其在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用機(jī)制尚不清晰，因此，本研究利用NF-κB、TRAF6、CCR5 抑制劑處理HT29 和SW480 細(xì)胞，探討各關(guān)鍵蛋白表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用及其之間的相互聯(lián)系，以期闡明影響結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)細(xì)胞

HT29 和SW480 細(xì)胞來(lái)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞研究所。

1.2 試驗(yàn)試劑

兔抗人NF-κB 單克隆抗體、兔抗人TRAF6 單克隆抗體、兔抗人CCR5 單克隆抗體、兔抗人PI3K單克隆抗體，兔抗人PTEN 單克隆抗體以及羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司。CCK-8 試劑盒購(gòu)自MedChemExpress（cat: No. HY-K0301）公司，Transwell小室和Matrigel 膠購(gòu)自康寧公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分組 人結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29 和SW480 在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，添加10% FBS，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別利用Maraviroc（250 nmol/L）、MG-132 （50 μmol/L）、NF-κB 抑制劑NF-BAY （90 μmol/L） 與HT29 細(xì)胞孵育0、12、24、48 h，取對(duì)應(yīng)細(xì)胞分析相應(yīng)指標(biāo)。 利用Maraviroc （300 nmol/L）、 MG-132 （70 μmol/L）、NF-BAY （140 μmol/L） 與SW480 細(xì)胞孵育0、12、24、48 h，取對(duì)應(yīng)細(xì)胞分析相應(yīng)指標(biāo)。

1.3.2 Western blot 利用RIPA 緩沖液獲得全細(xì)胞蛋白提取物，EZQ 蛋白定量試劑盒（Invitrogen）進(jìn)行定量分析。使用預(yù)制Mini-PROTEAN TGX 無(wú)染色凝膠（Bio-Rad）通過(guò)SDS-PAGE 分離蛋白提取物，并使用Trans-Blot Turbo 轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將蛋白印跡到聚偏二氟乙烯膜（PVDC）上。用含5%牛血清白蛋白或脫脂奶粉的TBS-T 封閉膜，然后分別用兔單克隆抗NF-κB （1∶1 000）、TRAF6 （1∶1 000）、CCR5（1∶1 000）、PI3K（1∶1 000）、PTEN（1∶1 000）孵育過(guò)夜。以兔單克隆抗β-actin（1∶1 000）作為上樣對(duì)照。聯(lián)合辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的羊抗兔IgG 與增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)、ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)顯示條帶。分析各組細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測(cè) CCK-8 試驗(yàn)（Cell Count Kit-8 SAB biotech）用于細(xì)胞增殖檢測(cè)。按照生產(chǎn)商的方案，將細(xì)胞以每孔1.0×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6 孔板中，在添加5%FBS 的培養(yǎng)基中孵育24 h，并在37 ℃、5% CO2條件下孵育。轉(zhuǎn)染后24 h，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，一式三份接種到96 孔板中（3×104個(gè)細(xì)胞/孔）。每孔用10 μL/孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 溶液孵育2 h，每天孵育5 d。在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm 處的光密度。進(jìn)行了3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞遷移和侵襲檢測(cè) 將細(xì)胞鋪板于含有2% FBS 的Transwell 細(xì)胞培養(yǎng)小室或Transwell Matrigel?侵襲室頂室中，下室置于含5% FBS 作為化學(xué)引誘物的培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37 °C、5% CO2的潮濕環(huán)境中孵育24 h 或48 h。下表面遷移的癌細(xì)胞用95%酒精固定，并用0.1%結(jié)晶紫（Solarbio）染色。在相差顯微鏡下計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)并拍照（放大100 倍）（每孔4 個(gè)隨機(jī)視野）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 分析軟件和Graphpad Prism 8 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、制圖，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抑制CCR5細(xì)胞蛋白表達(dá)變化

用CCR5 抑制劑（Maraviroc） 處理HT29 和SW480 細(xì)胞0、12、24、48 h 后，Western blot 分別檢測(cè)各組細(xì)胞中CCR5、PTEN、NF-κB、TRAF6 和PI3K 蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在Maraviroc 處理后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，HT29 和SW480 細(xì)胞中CCR5 和PI3K 蛋白的表達(dá)呈逐漸降低趨勢(shì)，而抑癌蛋白PTEN 表達(dá)呈升高趨勢(shì)（部分P＜0.05），但NF-κB 和TRAF6 的表達(dá)無(wú)明顯變化（均P＞0.05）（圖1）。

圖1 CCR5抑制劑處理細(xì)胞后蛋白表達(dá)變化 1）與0 h比較，P＜0.05Figure 1 Changes in protein expressions after treatment of CCR5 inhibitor 1) P＜0.05 vs. 0-h value

2.2 抑制TRAF6細(xì)胞蛋白表達(dá)變化

用TRAF6 抑制劑（MG132）處理HT29 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞0、12、24、48 h 后，Western blot 分析細(xì)胞中CCR5、PTEN、NF-κB、TRAF6 和PI3K 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MG132 處理后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，HT29 和SW480 細(xì)胞中TRAF6、PI3K 和CCR5 表達(dá)基本呈逐漸降低趨勢(shì)，而PTEN 表達(dá)呈升高趨勢(shì)（部分P＜0.05），NF-κB 表達(dá)無(wú)明顯變化（均P＞0.05）（圖2）。

圖2 TRAF6抑制劑處理細(xì)胞后蛋白表達(dá)變化 1）與0 h比較，P＜0.05Figure 2 Changes in protein expressions after treatment of TRAF6 inhibitor 1) P＜0.05 vs. 0-h value

2.3 抑制NF-κB細(xì)胞蛋白表達(dá)變化

用NF-BAY 處理HT29 和SW480 細(xì)胞0、12、24、48 h 后，Western bolt 分析細(xì)胞中CCR5、NF-κB、PTEN、TRAF6 和PI3K 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，NF-BAY 處理后，隨時(shí)間延長(zhǎng)，HT29 和SW480 細(xì)胞中CCR5、NF-κB、TRAF6、PI3K 蛋白表達(dá)基本呈逐漸降低趨勢(shì)，而PTEN 表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)（部分P＜0.05）（圖3）。

圖3 NF-κB抑制劑處理細(xì)胞后蛋白表達(dá)變化 1）與0 h比較，P＜0.05Figure 3 Changes in protein expressions after treatment of NF-κB inhibitor 1) P＜0.05 vs. 0-h value

2.4 不同抑制劑處理對(duì)細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 分析不同抑制劑處理后， HT29 和SW480 細(xì)胞增長(zhǎng)的變化，結(jié)果顯示，與處理24 h 比較，抑制劑處理48 h 后HT29 和SW480 細(xì)胞增殖明顯抑制（均P＜0.05）（圖4）。

圖4 CCK-8分析細(xì)胞增殖Figure 4 Proliferation analysis by CCK-8 assay

2.5 不同抑制劑對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

利用CCR5 抑制劑（Maraviroc）、TRAF6 抑制劑（MG132） 以及NF- κB 抑制劑（NF-BAY） 處理HT29 和SW480 細(xì)胞，Transwell 小室試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，Maraviroc、MG132 以及NF-BAY 處理后HT29 和SW480 細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯降低（均P＜0.05）（圖5）。

圖5 Transwell分析細(xì)胞遷移和侵襲能力 1）與對(duì)照組比較，P＜0.05Figure 5 Determination of cell migration and invasion abilities by Transwell assay 1) P＜0.05 vs. control group

3 討 論

結(jié)直腸癌是全世界最常見(jiàn)癌癥之一，早期診斷識(shí)別可盡早手術(shù)治療并改善患者預(yù)后，降低結(jié)直腸癌病死率[11]。結(jié)腸鏡檢查是結(jié)直腸癌篩查金標(biāo)準(zhǔn)，具有高敏感度和特異度，但對(duì)操作人員、設(shè)備和資金方面有一定高要求。目前，先進(jìn)的分子技術(shù)對(duì)大腸癌檢查和治療是重大突破，據(jù)報(bào)道[12]，蛋白質(zhì)、DNA、RNA、腸道微生物結(jié)構(gòu)等已逐步成為大腸癌變的生物標(biāo)記物。

本研究結(jié)果表明， Maraviroc 抑制HT29 和SW480 細(xì)胞中CCR5 蛋白后，顯著降低PI3K 的表達(dá)，不影響TRAF6 和NF-κB 的表達(dá)，促進(jìn)PTEN 的表達(dá)；利用MG132 抑制細(xì)胞中TRAF6 蛋白后，可顯著降低PI3K 和CCR5 的表達(dá)，而不影響NF-κB 的表達(dá)，促進(jìn)PTEN 表達(dá)；抑制NF-κB 表達(dá)后，可顯著降低CCR5、TRAF6 和PI3K 表達(dá)，并促進(jìn)PTEN表達(dá)。抑制該信號(hào)通路中CCR5、TRAF6 和NF-κB蛋白，可降低癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。綜上，推測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中NF-κB 通過(guò)調(diào)控TRAF6/CCR5/PI3K 信號(hào)通路，最終調(diào)節(jié)PTEN 的表達(dá)在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮作用。

NF-κB 信號(hào)通路調(diào)控不同的蛋白及下游分子的在免疫、炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞存活和凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究[13]表明NF-κB 信號(hào)參與重要的細(xì)胞過(guò)程，并且在不同病理?xiàng)l件下，通過(guò)抑制或激活其靶基因參與氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)機(jī)制，如腫瘤、免疫性疾病等。Wu 等[14]提出溴多巴胺和末端外結(jié)構(gòu)域抑制劑可通過(guò)抑制癌轉(zhuǎn)錄因子治療腫瘤，可通過(guò)抑制NF-κB 為大腸癌潛在治療提供理論基礎(chǔ)。結(jié)直腸癌組織中NF-κB 信號(hào)通路激活在腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用，并且結(jié)腸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，這可能是結(jié)腸癌治療靶點(diǎn)[15]。Rong 等[16]發(fā)現(xiàn)MGP 增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平，促進(jìn)NF-κB 磷酸化，激活程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CD8+T 細(xì)胞耗竭，導(dǎo)致大腸癌肝轉(zhuǎn)移。Berkovich 等[17]通過(guò)分析結(jié)直腸癌患者、結(jié)腸腺瘤和炎癥過(guò)程患者組織樣本，結(jié)果表明NF-κB 通路強(qiáng)烈參與結(jié)腸癌發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程，在良性息肉樣病變中表達(dá)與炎癥病因中表達(dá)相當(dāng)，這表明NF-κB 在炎癥和腺體瘤早期發(fā)揮作用。Ma 等[18]表明趨化因子CCL3 和受體CCR5 與TRAF6 和NF-κB 表達(dá)呈正相關(guān)，并可通過(guò)TRAF6和NF-κB 促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。這與本研究結(jié)果一致，體外抑制HT29 和SW480 細(xì)胞NF-κB 信號(hào)通路可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并且與CCR5、TRAF6 和PI3K 信號(hào)通路有關(guān)。

研究[19]發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，TRAF6 在多種腫瘤組織中的表達(dá)增加，過(guò)表達(dá)的TRAF6 可賦予細(xì)胞癌變特征，包括維持增殖信號(hào)、抵抗細(xì)胞死亡和誘導(dǎo)血管生成。Zhu 等[20]提出，TRAF6 高表達(dá)的結(jié)直腸癌患者預(yù)后生存率很低。另外，Garo等[21]提出慢性炎癥可以驅(qū)動(dòng)腫瘤發(fā)展，微小RNA-146 可靶向TRAF6 調(diào)控大腸癌發(fā)生，臨床前給予miR-146 模擬物或小分子抑制TRAF6 可改善結(jié)腸炎癥和大腸癌。Li 等[22]發(fā)現(xiàn)環(huán)形RNA PTEN 在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，可通過(guò)TRAF6 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，抑制Akt 磷酸化，并調(diào)控炎癥因子異常表達(dá)參與結(jié)直腸癌進(jìn)展。由上可知TRAF6 在結(jié)直腸癌表達(dá)上調(diào)，可能與促進(jìn)炎癥進(jìn)展有關(guān)。但Wu 等[23]提出，TRAF6 通過(guò)驅(qū)動(dòng)自噬基因表達(dá)，發(fā)揮抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和大腸癌抑制過(guò)程，這與本研究結(jié)果相反，可能與TRAF6 在不同腫瘤環(huán)境中激活不同下游通路有關(guān)。因此，將TRAF6 作為結(jié)直腸癌治療靶點(diǎn)，還需考慮其上下游調(diào)控靶點(diǎn)。

Nishikawa 等[24]發(fā)現(xiàn)CCR5 及其配體（CCL3、CCL4 和CCL5） 在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中過(guò)度表達(dá)，CCR5 抑制劑在體內(nèi)可抑制間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)，而且CCR5 過(guò)度表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后差相關(guān)，因此作者提出血清CCL3 和CCL4 水平可能是預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者預(yù)后生物標(biāo)志物。CCR5 基因在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)，其高表達(dá)特性與患者預(yù)后不良相關(guān)[25]。Gu 等[26]表明ARCR 通過(guò)介導(dǎo)微小RNA-153-3p/CCR5 調(diào)節(jié)軸，抑制M2 巨噬細(xì)胞極化，抑制結(jié)直腸癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。上述研究提示，CCR5 通過(guò)不同調(diào)控機(jī)制參與結(jié)直腸癌進(jìn)展，本研究結(jié)果表明，CCR5 是TRAF6 下游調(diào)控基因，抑制CCR5 可降低HT29 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并顯著促進(jìn)PTEN 表達(dá)，這與前期研究結(jié)果一致。

PI3K 信號(hào)通路在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，Muzny 等[27]提出，結(jié)直腸癌組織中PI3K通路異常表達(dá)，抑制PI3K 通路可改善結(jié)直腸癌腫瘤進(jìn)展。Mao 等[28]報(bào)道，莫西西?。∕OX）在體內(nèi)外均顯示出良好的抗膠質(zhì)母細(xì)胞瘤作用，MOX 可以誘導(dǎo)自噬停止，促進(jìn)自噬啟動(dòng)，抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)可以誘導(dǎo)抑制PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展，并抑制體內(nèi)移植瘤的生長(zhǎng)。Deng 等[29]表明巖藻多糖通過(guò)激活TLR4 介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)軸，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞糖酵解并調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化為M1 表型，改善了免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，有利于提高結(jié)直腸癌對(duì)化療的敏感度。

本研究結(jié)果表明，抑制NF-κB、TRAF6 以及CCR5 都會(huì)降低結(jié)直腸癌細(xì)胞中PI3K 的表達(dá)，并與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲有關(guān)，因此，PI3K 通路在結(jié)直腸癌進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PTEN 是PI3K/Akt通路中的一種抑制劑，PTEN 的缺失可激活PI3K 而導(dǎo)致長(zhǎng)期的腫瘤生長(zhǎng)，在20%～40%的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中發(fā)現(xiàn)PTEN 表達(dá)缺失[30]，與本研究結(jié)論一致。

綜上，本研究結(jié)果表明，結(jié)直腸癌細(xì)胞中存在NF-κB 異?；罨笳呖赡芡ㄟ^(guò)上調(diào)TRAF6 與CCR5 的表達(dá)，抑制抑癌分子PTEN 的活性，從而導(dǎo)致促癌分子PI3K 及其通路的活性升高。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。