楊永華，劉 新

(1.寧德市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建福安 355017；2.福建省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，福州 350000)

甲基硫菌靈是一種低毒、廣譜殺菌劑，具有內(nèi)吸、預(yù)防和治療作用[1]。它主要通過(guò)一系列生化反應(yīng)，產(chǎn)生能夠干擾病菌菌絲分裂的物質(zhì)，使病菌孢子萌發(fā)長(zhǎng)出的芽管細(xì)胞壁扭曲畸形，病菌無(wú)法正常生長(zhǎng)而達(dá)到殺菌效果[2]。甲基硫菌靈可廣泛用于防治糧食、花卉、果樹(shù)和蔬菜等作物的多種病害，如蘆筍褐斑病、莖枯病等。蘆筍口味鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受國(guó)際市場(chǎng)歡迎，我國(guó)蘆筍種植面積廣，在全球蘆筍貿(mào)易中占有重要地位。但據(jù)報(bào)道，近年來(lái)我國(guó)有約65%蘆筍由于農(nóng)藥殘留超標(biāo)出口受阻[3]。加強(qiáng)農(nóng)藥殘留檢測(cè)在應(yīng)對(duì)國(guó)外嚴(yán)格的綠色貿(mào)易壁壘上具有重要作用。有關(guān)枸杞[4]、芒果[5]、獼猴桃[6]、馬鈴薯[7]中甲基硫菌靈的殘留分析已有文獻(xiàn)報(bào)道，但未見(jiàn)甲基硫菌靈在蘆筍中殘留分析研究，建立一種準(zhǔn)確、可靠且操作簡(jiǎn)便的蘆筍中甲基硫菌靈殘留量分析方法，具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

Waters 2695高效液相色譜儀(美國(guó)沃特世公司)；N-EVAP 112型氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)；BP221S分析天平(德國(guó)賽多利斯股份公司)；HR1727攪拌器(飛利浦公司)；T25高速勻漿機(jī)(德國(guó)IKA公司)；冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；MS 3 digital渦旋振蕩器(德國(guó)IKA公司)；移液槍、具塞量筒、燒杯、錐形瓶、0.45 μm濾膜等。

1.1.2 試劑與藥品

甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品(日本曹達(dá)有限公司)；三乙胺、氯化鈉、磷酸(均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；乙腈、甲醇、丙酮、癸烷磺酸鈉(均為色譜純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；無(wú)水硫酸鎂(分析純，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司)；乙二胺基-N-丙基(PSA)(美國(guó)CNW公司)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取0.01 g (精確至0.001 g)甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)品至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解，充分振蕩混勻后定容，保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.2 離子對(duì)試劑配制

癸烷磺酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取癸烷磺酸鈉固體1.0 g (精確至0.1 g)至1 000 mL容量瓶中，加200 mL超純水充分溶解后，再加入10 mL三乙胺和7 mL磷酸，充分混勻后用超純水定容，保存于4 ℃冰箱中，備用。

1.2.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取25 g樣品于燒杯中，加入50 mL乙腈提取液后用高速勻漿機(jī)勻漿2 min，勻漿液過(guò)濾至裝有5 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，蓋上塞子，充分振蕩2 min后室溫靜止30 min，待乙腈相和水相完全分層后，準(zhǔn)確吸取10 mL上層乙腈于離心管中氮吹至近干，用1 mL甲醇溶解，充分振蕩后加入45 mg PSA和180 mg無(wú)水硫酸鎂，5 000 r/min離心15 min，取0.5 mL上層離心液加入0.5 mL離子對(duì)試劑，充分振蕩，過(guò)0.45 μm濾膜后，待測(cè)。

1.2.4 高效液相色譜檢測(cè)條件

色譜柱：Waters XBridge C184.0 mm×250 mm；流動(dòng)相：甲醇+離子對(duì)試劑(體積比50∶50)；流速：0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：30 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在0.1～20 mg/L范圍，配制不同濃度的甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，根據(jù)1.2.4節(jié)中的高效液相色譜檢測(cè)條件，進(jìn)行3次平行測(cè)定，以測(cè)得的峰面積平均值為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，其線性回歸方程為y=129 898x-51 214，R2=0.999 0。

2.2 前處理?xiàng)l件

2.2.1 提取溶劑確定

甲基硫菌靈溶于丙酮、甲醇、乙腈，微溶于己烷，幾乎不溶于水[8]。試驗(yàn)選用丙酮、乙腈、甲醇3種溶劑為萃取溶劑，通過(guò)添加回收試驗(yàn)，分析萃取效果。結(jié)果表明，丙酮為提取試劑時(shí)，其回收率明顯低于甲醇和乙腈；甲醇為提取試劑時(shí)，萃取過(guò)程分層現(xiàn)象不明顯，不易分辨；乙腈為提取試劑時(shí)，試驗(yàn)效果最為理想，回收率高且樣品雜質(zhì)少。

2.2.2 樣品濃縮

對(duì)添加2 mg/kg甲基硫菌靈的蘆筍、蘆筍植株、土壤樣品，提取試驗(yàn)后分別經(jīng)過(guò)濃縮(氮吹)與不濃縮處理，每個(gè)處理設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明(表1)，采用氮吹法對(duì)樣品進(jìn)行濃縮處理，既可增高溶液濃度，避免儀器因溶液濃度過(guò)低而無(wú)法檢出，又可提高樣品回收率。

表1 甲基硫菌靈不同前處理對(duì)回收率的影響

2.2.3 無(wú)水硫酸鎂含量和PSA含量確定

為確定樣品在進(jìn)行凈化操作時(shí)，無(wú)水硫酸鎂和乙二胺基-N-丙基(PSA)的最佳添加量，設(shè)置了不同梯度水平的添加試驗(yàn)，每個(gè)梯度水平設(shè)計(jì)3個(gè)重復(fù)，以平均值計(jì)最終值(表2、表3)。

表2 無(wú)水硫酸鎂不同添加量對(duì)回收率的影響

表3 PSA不同添加量對(duì)回收率的影響

由表2可知，隨著無(wú)水硫酸鎂含量增加，蘆筍、蘆筍植株以及土壤樣品的回收率有提高趨勢(shì)。當(dāng)無(wú)水硫酸鎂添加量為180 mg時(shí)，回收率最高，為80.9%～ 83.7%。但隨著無(wú)水硫酸鎂的持續(xù)增加，樣品回收率呈下降趨勢(shì)，分析其原因可能是由于加入的固體量已經(jīng)超出了使樣品達(dá)到最佳鹽析狀態(tài)含量，過(guò)多固體影響了振蕩、離心、移取等操作，最終導(dǎo)致回收率下降。由表3可知，樣品回收率隨著PSA含量增加而提高，當(dāng)PSA添加量達(dá)到45 mg以上時(shí)，回收率較佳，為81.4%～83.6%，綜合試驗(yàn)效果、價(jià)格等因素，確定凈化操作時(shí)，PSA加入量為45 mg。

2.3 檢測(cè)條件

2.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)確定

通過(guò)PDA二極管陣列檢測(cè)器對(duì)甲基硫菌靈進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm時(shí)，甲基硫菌靈有較好的吸收峰，且不受雜質(zhì)峰干擾，因此確定本方法的檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

2.3.2 流動(dòng)相配比選擇

甲基硫菌靈屬苯并咪唑類殺菌劑，檢測(cè)過(guò)程中如果不通過(guò)加入離子對(duì)試劑、調(diào)節(jié)pH等方法來(lái)優(yōu)化色譜條件，易出現(xiàn)保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、峰拖尾或變形等現(xiàn)象。本試驗(yàn)使用甲醇和離子對(duì)試劑為流動(dòng)相，設(shè)計(jì)了8種不同流動(dòng)相配比，考察了分析效果(表4)。結(jié)果表明，流動(dòng)相中甲醇含量過(guò)低時(shí)，出峰及峰分離效果差；當(dāng)流動(dòng)相中甲醇比例達(dá)70%以上時(shí)，出目標(biāo)峰，但目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離效果不佳。綜合目標(biāo)峰出峰情況、目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰分離效果等因素，選擇流動(dòng)相甲醇與離子對(duì)試劑磷酸-癸烷磺酸鈉溶液配比為50∶50 (體積比)。

表4 甲醇和離子對(duì)試劑不同配比對(duì)目標(biāo)峰的影響

續(xù)表4

2.3.3 柱溫和流速選擇

分別考察了4個(gè)梯度柱溫(25、30、35、40 ℃)和3個(gè)梯度流速(0.6、0.8、1.0 mL/min)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫為25 ℃，流速為0.8 mL/min時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間為15.979 min；當(dāng)柱溫升至40 ℃，流速為1.0 mL/min時(shí)，出峰時(shí)間提前但存在與雜質(zhì)峰交叉現(xiàn)象，且溫度過(guò)高也不利于儀器性能和使用壽命。試驗(yàn)確定最佳柱溫為25 ℃，流動(dòng)相流速為0.8 mL/min。

2.3.4 方法最低檢出濃度

通過(guò)3倍噪音計(jì)算可知本方法最低檢出量為7.5×10-9g，將相應(yīng)樣本溶液進(jìn)樣體積、樣本溶液定容體積等相關(guān)數(shù)據(jù)代入式(1)，求得本方法最低檢出濃度為0.01 mg/kg。

2.3.5 方法重復(fù)性

將100 mg/L甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成5個(gè)不同濃度系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)1.2.4節(jié)高效液相色譜檢測(cè)條件進(jìn)行檢測(cè)分析。由表5可知，甲基硫菌靈目標(biāo)峰保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.01%～0.04%和0.93%～3.00%，方法相對(duì)誤差較小、重復(fù)性好，符合農(nóng)藥殘留試驗(yàn)要求。

表5 甲基硫菌靈不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間與對(duì)應(yīng)峰面積

續(xù)表5

2.3.6 方法的準(zhǔn)確度和精確度

在蘆筍、蘆筍植株及土壤空白樣品中添加0.5、1.0、2.0 mg/kg 3個(gè)不同濃度水平的甲基硫菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本試驗(yàn)樣品前處理方法和色譜檢測(cè)條件進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。結(jié)果表明，添加濃度為0.5～2.0 mg/kg時(shí)，甲基硫菌靈在蘆筍中的平均回收率為73.12%～ 83.55%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.68%～3.98%，在栽培土壤中的平均回收率為75.53%～85.68%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～3.75% (表6)。

表6 甲基硫菌靈在蘆筍、蘆筍植株和土壤中的添加 回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 結(jié) 論

結(jié)合QuEchERS[10]方法，重點(diǎn)對(duì)樣品前處理中提取溶劑、凈化物質(zhì)的最佳添加量等進(jìn)行了考察分析，對(duì)高效液相色譜檢測(cè)條件中檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱溫和流速以及流動(dòng)相最佳配比等色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，建立了蘆筍及其栽培土壤中甲基硫菌靈殘留分析方法，即PSA分散固相萃取和離子對(duì)高效液相色譜法。與氣相色譜法相比，該方法具有靈敏度高，分離效能好、檢測(cè)速度快等優(yōu)勢(shì)。添加回收試驗(yàn)驗(yàn)證了該方法的精確度和準(zhǔn)確度均符合農(nóng)藥殘留分析與檢測(cè)技術(shù)要求，方法具有重復(fù)性好、樣品前處理操作簡(jiǎn)單省時(shí)等特點(diǎn)，可用于檢測(cè)蘆筍及其栽培土壤中甲基硫菌靈的殘留量，為其田間殘留消解動(dòng)態(tài)研究提供了指導(dǎo)。