朱佳杰，敖秋桅，譚蕓，羅永巨，蔣和生

（1廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院，廣西南寧 530021；2廣西民族大學(xué)，廣西南寧 530006；3廣西大學(xué)，廣西南寧 530004）

0 引言

【研究意義】羅非魚(yú)是我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模及集約化程度的不斷提高，其病害頻繁暴發(fā)，尤其是無(wú)乳鏈球菌病已成為制約羅非魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸難題（郭富強(qiáng)等，2018；羅偉等，2018；敖秋桅和朱佳杰，2020）。培育優(yōu)良品種是解決羅非魚(yú)病害問(wèn)題的有效途徑之一?？共⌒誀钍撬a(chǎn)養(yǎng)殖品種選育的重要經(jīng)濟(jì)性狀，篩選出抗病力強(qiáng)、養(yǎng)殖成活率高的品種，才能獲得更高的經(jīng)濟(jì)效益。近年來(lái)，利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的基因?qū)?jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行選擇，已成為魚(yú)類(lèi)育種的主流方向（魯翠云等，2019）。魚(yú)類(lèi)抗病性狀是受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，尋找抗病關(guān)鍵基因?qū)罄m(xù)開(kāi)展分子育種顯得尤為重要（陳松林等，2008；沈夏霜等，2018），即開(kāi)展魚(yú)類(lèi)抗病相關(guān)基因的篩選及功能研究可為其抗病分子育種提供基因資源?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】組織蛋白酶B（Cathepsin B，CtsB）屬于半胱氨酸蛋白酶家族（Zhang et al.，2008；Toomey et al.，2014；黃媛等，2016；徐揚(yáng)等，2021），主要位于溶酶體中，參與機(jī)體多種生理和生物學(xué)過(guò)程，尤其在宿主防御病原體感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用（Niu et al.，2013；朱鵬等，2020）。鑒于CatB基因在機(jī)體抵抗病原侵染中的重要性，已在多個(gè)水產(chǎn)物種上得到研究報(bào)道。牙鲆（Paralichthys olivaceus）CatB基因cDNA序列全長(zhǎng)1801 bp，共編碼330個(gè)氨基酸殘基，牙鲆感染彈狀病毒后其脾臟、頭腎、腸道、鰓和肌肉等組織中的CatB基因相對(duì)表達(dá)量較感染前上調(diào)10倍以上（Zhang et al.，2008）。皺紋盤(pán)鮑（Haliotis discus hannai）感染弧菌后多個(gè)組織的CatB基因表達(dá)上調(diào)，且CatB重組蛋白對(duì)鰻弧菌具有明顯的抗性作用，表明在皺紋盤(pán)鮑抵御細(xì)菌侵染過(guò)程中CatB主要參與免疫反應(yīng)（Qiu et al.，2013）。斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）感染柱狀黃桿菌和愛(ài)德華氏菌后，其黏膜中的CatB基因表達(dá)量顯著上調(diào)，暗示CatB基因在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用（Li et al.，2015）。此外，過(guò)表達(dá)CatB基因可顯著抑制卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）感染愛(ài)德華氏菌，敲除CatB基因后卵形鯧鲹對(duì)愛(ài)德華氏菌的敏感性增加（Shen et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】至今，CatB基因已在多個(gè)水產(chǎn)物種上得到研究報(bào)道，但有關(guān)羅非魚(yú)CatB基因的研究尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從不同抗性吉富羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后脾臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出顯著差異表達(dá)的CatB基因，通過(guò)RACE克隆羅非魚(yú)CatB基因cDNA序列，并探究感染無(wú)乳鏈球菌前后的表達(dá)差異，為深入研究羅非魚(yú)抗無(wú)乳鏈球菌感染的免疫應(yīng)答機(jī)制及通過(guò)SNP分子標(biāo)記/基因組編輯技術(shù)快速獲得吉富羅非魚(yú)抗病新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚(yú)來(lái)源及樣品采集

供試吉富羅非魚(yú)取自廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院那馬中試基地，在前期選育的吉富羅非魚(yú)抗病家系和易感家系中各隨機(jī)篩選100尾，平均體重約60 g/尾。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)1周，待魚(yú)適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境后再開(kāi)展人工感染無(wú)乳鏈球菌試驗(yàn)。無(wú)乳鏈球菌（HN016菌株）由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院魚(yú)病研究室提供，菌株復(fù)壯后通過(guò)人工腹腔注射的方法分別感染抗病群體和易感群體，菌株半數(shù)致死濃度為1.1×108CFU/mL，注射劑量為0.2 mL/尾，以注射等量PBS為空白對(duì)照，攻毒后的魚(yú)群置于30℃的大水桶中養(yǎng)殖觀察（沈夏霜等，2018）。于感染前（0 h）、感染后5 h、感染后50 h及感染后7 d分別隨機(jī)挑選抗病群體、易感群體及對(duì)照組群體羅非魚(yú)各9尾，采集其腦、鰓、肝臟、脾臟、頭腎、腸道、皮膚和肌肉等組織樣品，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA/RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

采用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取基因組DNA，以0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取效果。同時(shí)采用TRIzol Reagent試劑盒（OMEGA）提取總RNA，以核酸蛋白定量?jī)x（Bio-Rad Smart Spec Plus）檢測(cè)RNA純度及完整性，并用cDNA Synthesis Reagent Kit試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.3 CtsB基因cDNA序列擴(kuò)增

根據(jù)從吉富羅非魚(yú)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（Zhu et al.，2018）檢索的CtsB基因部分序列，設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增引物（表1）用于擴(kuò)增CtsB基因cDNA序列。RACE反應(yīng)體系25.0μL：2×ESTaqMasterMix（含染料）12.5μL，通用引物UPM 1.0μL，3′-GSPs 1.0μL，3′-cDNA模板1.0μL，RNase-free H2O 9.5μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳回收后克隆至pMD18-T載體上，并送至上海捷瑞生物工程有限公司測(cè)序。

表1 吉富羅非魚(yú)CtsB基因擴(kuò)增引物序列信息Table 1 Primer sequence information of CtsB gene in GITF tilapia

1.4 生物信息學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

采用DNAMAN 6.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行編輯，并與原始基因片段進(jìn)行拼接整合，得到完整的CtsB基因cDNA序列；使用SMART和Splign分析基因結(jié)構(gòu)，運(yùn)用MEGA v6.0和BoxShade進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析。從NCBI下載已公布的其他物種CtsB基因cDNA序列，通過(guò)Lasergene 7.0的MegAlign程序進(jìn)行多序列比對(duì)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增

按照TaKaRa SYBR?Green I Premix ExTaqTM試劑盒（TaKaRa）說(shuō)明進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0μL：SYBR qPCR Master Mix 10.0μL，上、下游引物各0.4μL，cDNA模板5.0μL，ddH2O 4.2μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃10 s，60℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)（擴(kuò)增讀取熒光信號(hào)）；95℃15 s，65℃1 min（讀取熔解曲線）；95℃15 s，40℃30 s（冷卻）。以β-actin為內(nèi)參基因（GenBank登錄號(hào)XM_003455636），采用2-ΔΔCt法計(jì)算CtsB基因相對(duì)表達(dá)量，并以SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）及Duncan's多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉富羅非魚(yú)CtsB基因cDNA序列分析結(jié)果

經(jīng)測(cè)序比對(duì)獲知，吉富羅非魚(yú)CtsB基因cDNA序列全長(zhǎng)1746 bp，其中5′端非編碼區(qū)（5′-UTR）為161 bp，3′端非編碼區(qū)（3′-UTR）為592 bp，開(kāi)放閱讀序列（ORF）為993 bp，共編碼331個(gè)氨基酸殘基，包括218個(gè)保守氨基酸殘基（圖1）。

2.2 吉富羅非魚(yú)CtsB蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

SOMPA預(yù)測(cè)結(jié)果（圖2）顯示，吉富羅非魚(yú)CtsB蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)包含42個(gè)α-螺旋（占16.94%）、49個(gè)β-轉(zhuǎn)角（占19.76%）、23個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲（占9.27%）和134個(gè)延伸鏈（占54.03%）。以SWISS-MODEL預(yù)測(cè)吉富羅非魚(yú)CtsB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吉富羅非魚(yú)CtsB蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)與人類(lèi)CtsB蛋白的結(jié)構(gòu)相似（圖3）。

2.3 吉富羅非魚(yú)CtsB氨基酸序列同源比對(duì)分析結(jié)果

吉富羅非魚(yú)CtsB氨基酸序列與其他19個(gè)物種的CtsB氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，結(jié)果顯示，吉富羅非魚(yú)與奧利亞羅非魚(yú)（O.aureus，XP_0315867 61.1）的CtsB氨基酸序列相似性最高，為99.39%?；贑tsB氨基酸序列相似性，構(gòu)建吉富羅非魚(yú)與奧利亞羅非魚(yú)、烏鱧（Channa argus，KAF3686289.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus，XP_035484582.1）、牙鲆（XP_019935873.1）、鯉魚(yú)（Cyprinus carpio，XP_018937282.2）、歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla，KAG 5847099.1）、黃金鱸（Perca flavescens，TDH17225.1）、卵形鯧鲹（QCV57273.1）、軍曹魚(yú)（Rachycentron canadum，AWM30698.1）、尖吻鱸（Lates calcarifer，XP_018522457.1）、點(diǎn)帶石斑魚(yú)（Epinephelus coioides，AHF27212.1）、鱖魚(yú)（Siniperca chuatsi，XP_0440368 81.1）、黃鰭棘鯛（Acanthopagrus latus，XP_0369519 29.1）、大黃魚(yú)（Larimichthys crocea，XP_010730616.2）、大刺鰍（Mastacembelus armatus，XP_026149893.1）、大口黑鱸（Micropterus salmoides，XP_038557705.1）、青鱂（Oryzias latipes，XP_020555295.2）及半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis，XP_024911145.1）的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖4）顯示，吉富羅非魚(yú)先與奧利亞羅非魚(yú)聚為一小分支，再與烏鱧聚為一支，即吉富羅非魚(yú)與奧利亞羅非魚(yú)的親緣關(guān)系最近，而與鯉魚(yú)、大菱鲆、牙鲆、半滑舌鰨等物種相距較遠(yuǎn)。

2.4 吉富羅非魚(yú)CtsB基因組織表達(dá)譜

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，CtsB基因在吉富羅非魚(yú)的肝臟、脾臟、鰓、前腎、腦、腸道、皮膚和肌肉等組織中均有表達(dá)（圖5）。其中，以鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，是其他器官組織的2.0～3.0倍（P＜0.05，下同）；其次在腸道、肝臟和皮膚中也檢測(cè)到較高水平的相對(duì)表達(dá)量，而在脾臟、肌肉、腦和頭腎等組織中的相對(duì)表達(dá)量較低。

2.5 感染無(wú)乳鏈球菌后CtsB基因的表達(dá)變化

2.5.1 感染無(wú)乳鏈球菌后CtsB基因在吉富羅非魚(yú)脾臟中的表達(dá)變化吉富羅非魚(yú)抗病家系和易感家系感染無(wú)乳鏈球菌（HN016菌株）后，CtsB基因在其脾臟中的表達(dá)情況如圖6所示。在人工感染前（0 h），易感家系脾臟的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量是抗病家系的3.0倍；感染后5 h，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均呈顯著的上調(diào)趨勢(shì)，且抗病家系的上調(diào)表達(dá)倍數(shù)高于易感家系；感染后50 h，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均達(dá)峰值，與感染前（0 h）相比其相對(duì)表達(dá)量分別顯著上調(diào)7.2倍和2.1倍；至感染后7 d，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量呈明顯下調(diào)趨勢(shì)，且抗病家系的下調(diào)幅度大于易感家系。

2.5.2 感染無(wú)乳鏈球菌后CtsB基因在吉富羅非魚(yú)腎臟中的表達(dá)變化感染無(wú)乳鏈球菌后，吉富羅非魚(yú)抗病家系和易感家系CtsB基因在腎臟中的表達(dá)情況如圖7所示。在人工感染前（0 h），易感家系和抗病家系腎臟中的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著（P＞0.05，下同）；感染后5 h，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，且抗病家系的上調(diào)幅度大于易感家系；至感染后50 h，抗病家系和易感病家系的腎臟CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均達(dá)峰值，與感染前（0 h）相比分別顯著上調(diào)14.6倍和10.9倍；至感染后7 d，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)至感染前的水平。

2.5.3 感染無(wú)乳鏈球菌后CtsB基因在吉富羅非魚(yú)肝臟中的表達(dá)變化感染無(wú)乳鏈球菌后，吉富羅非魚(yú)抗病家系和易感家系CtsB基因在肝臟中的表達(dá)情況圖8所示。在人工感染前（0 h），抗病家系和易感家系肝臟中的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量也無(wú)顯著差異；感染后5 h，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)峰值，抗病家系和易感家系的上調(diào)倍數(shù)分別為5.0倍和4.1倍；至感染后50 h，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，但相對(duì)表達(dá)量仍高于感染前（0 h）；至感染后7 d，2個(gè)家系的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量均下調(diào)至感染前的水平。

3 討論

CtsB是一種半胱氨酸蛋白酶，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)的多各器官中（黃媛等，2016）。大量研究表明，脊椎動(dòng)物中的CtsB基因參與多種生理生化反應(yīng)，且在不同器官組織中其功能和作用各不相同（黃媛等，2016）。在哺乳動(dòng)物中，普遍認(rèn)為CtsB在抗原降解和抗原提呈的過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用（Wei et al.，2014）。本研究克隆吉富羅非魚(yú)CtsB基因cDNA序列，并分析不同抗性吉富羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后CtsB基因的表達(dá)差異，研究結(jié)論有助于深入了解羅非魚(yú)抗病免疫的分子機(jī)制，為羅非魚(yú)抗病育種提供新思路。

本研究通過(guò)RACE擴(kuò)增獲得吉富羅非魚(yú)CtsB基因cDNA序列，其cDNA序列全長(zhǎng)1746 bp，包括161 bp的5′-UTR、592 bp的3′-UTR及993 bp的ORF，共編碼331個(gè)氨基酸殘基；將吉富羅非魚(yú)CtsB基因cDNA序列提交至NCBI并與其他魚(yú)類(lèi)的CtsB基因進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鯉魚(yú)（Tan et al.，2006）、牙鲆（Zhang et al.，2008）、斑點(diǎn)叉尾鮰（Li et al.，2015）的CtsB基因cDNA序列全長(zhǎng)分別為1580、1801和1470 bp，但均編碼330個(gè)氨基酸殘基。不同硬骨魚(yú)類(lèi)間的CtsB基因cDNA序列長(zhǎng)度差異可能與其進(jìn)化過(guò)程有關(guān)。此外，本研究基于CtsB氨基酸序列相似性采用MEGA v6.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，吉富羅非魚(yú)與同為麗魚(yú)科的奧利亞羅非魚(yú)聚為一支，而與鯉魚(yú)（鯉科）、大菱鲆（菱鲆科）、牙鲆（鲆科）、半滑舌鰨（舌鰨科）等物種相距較遠(yuǎn)，進(jìn)一步驗(yàn)證CtsB基因在魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性。

為闡明CtsB基因在吉富羅非魚(yú)抵抗無(wú)乳鏈球菌侵染過(guò)程中發(fā)揮的作用機(jī)制，本研究通過(guò)構(gòu)建吉富羅非魚(yú)CtsB基因的組織表達(dá)譜，并比較不同抗性吉富羅非魚(yú)感染無(wú)乳鏈球菌后CtsB基因在免疫相關(guān)組織（脾臟、腎臟和肝臟）中的表達(dá)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CtsB基因在吉富羅非魚(yú)的肝臟、脾臟、鰓、前腎、腦、腸道、皮膚和肌肉等組織中均有表達(dá)，且以鰓組織中的相對(duì)表達(dá)量最高，是其他器官組織的2.0～3.0倍，說(shuō)明在正常狀態(tài)下CtsB基因主要參與機(jī)體的能量代謝；但大菱鲆以肌肉中的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量最高（Xiao et al.，2010），牙鲆以鰓組織和腸道中的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量較高（Ahn et al.，2013），黃花魚(yú)則以脾臟中的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量最高（Li et al.，2014）?？梢?jiàn)，CtsB基因在不同物種中的表達(dá)模式存在明顯差異，故推測(cè)CtsB在不同物種中的作用也不同。

硬骨魚(yú)類(lèi)主要的免疫器官是脾臟和腎臟。本研究結(jié)果表明，在感染前（0 h）吉富羅非魚(yú)易感家系脾臟的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量是抗病家系的3.0倍，但無(wú)乳鏈球菌感染后5和50 h抗病家系的上調(diào)幅度顯著大于易感家系，說(shuō)明CtsB基因高表達(dá)有助于減輕無(wú)乳鏈球菌對(duì)脾臟組織的損失，進(jìn)而降低吉富羅非魚(yú)發(fā)病死亡率。腎臟是吉富羅非魚(yú)的重要排泄器官，吉富羅非魚(yú)抗病家系和易感家系在感染前（0 h）的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，至感染后50 h時(shí)達(dá)峰值，與感染前（0 h）相比分別顯著上調(diào)14.6倍和10.9倍，且抗病家系的相對(duì)表達(dá)量顯著高于易感家系，表明CtsB基因高表達(dá)還有助于緩解無(wú)乳鏈球菌對(duì)腎臟的損傷，減輕腎小管的變性與壞死。肝臟是魚(yú)類(lèi)能量合成和解毒的重要器官，也是機(jī)體維持生理機(jī)能的核心，在病原菌侵染下肝臟也會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷，并影響其生理功能（劉問(wèn)，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，在無(wú)乳鏈球菌感染后5 h，吉富羅非魚(yú)抗病家系和易感家系肝臟的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)并達(dá)峰值，可能是肝臟需要合成更多的能量物質(zhì)以應(yīng)對(duì)病原菌入侵，而感染后50 h的CtsB基因相對(duì)表達(dá)量顯著下降，說(shuō)明肝臟組織因無(wú)乳鏈球菌入侵已受損，進(jìn)而影響機(jī)體的能量合成和解毒機(jī)能，導(dǎo)致其抗病能力下降。綜上所述，CtsB基因在吉富羅非魚(yú)抵御無(wú)乳鏈球菌入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要的免疫作用。

4 結(jié)論

CtsB基因在魚(yú)類(lèi)的進(jìn)化過(guò)程中具有高度保守性，但在不同物種中的表達(dá)模式存在明顯差異。CtsB基因是吉富羅非魚(yú)的重要免疫因子，在抵御無(wú)乳鏈球菌入侵過(guò)程中發(fā)揮著重要的免疫作用，可作為羅非魚(yú)抗病育種的SNP分子標(biāo)記給予開(kāi)發(fā)利用。