劉雙龍，楊德潔，牛曉慶，楊福孫，覃偉權(quán)*

（1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/海南省院士創(chuàng)新平臺(tái)/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南文昌 571339；2海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南?？?570228）

0 引言

【研究意義】可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）廣泛存在于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是具有多型性、多寄主的土傳真菌，可在500多種植物上寄生，且表現(xiàn)出不同的癥狀（Yildiz et al.，2014）。謝紅輝等（2016a，2016b）發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢菌可感染桑樹根部引起桑樹根腐病。任亞峰等（2019）研究表明可可毛色二孢可引起茶樹葉斑病。唐中發(fā)等（2021）發(fā)現(xiàn)可可毛色二孢可引起菠蘿葉斑病。本研究中的目標(biāo)菌株可可毛色二孢菌分離自檳榔根部，是引起檳榔根腐病的病原之一，此類病害目前已成為影響海南陵水、萬寧和崖城等檳榔主產(chǎn)區(qū)檳榔生產(chǎn)的主要障礙之一，可導(dǎo)致檳榔植株葉片黃化、枯死，10～20樹齡的結(jié)果樹因發(fā)生此類病害而大量死亡（李增平等，2006）。生物防治具有綠色、安全、有效等優(yōu)點(diǎn)，因此，篩選對可可毛色二孢菌及其他檳榔根腐病菌具有拮抗作用的菌株，對檳榔抗病研究及檳榔產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前對可可毛色二孢菌的防治研究多集中于化學(xué)藥劑的篩選。戴利銘等（2018）通過菌絲生長速率法測定了多菌靈、丙環(huán)唑、甲基硫菌靈、苯醚甲環(huán)唑和異菌脲等10種殺菌劑對可可毛色二孢菌的毒力，發(fā)現(xiàn)多菌靈對可可毛色二孢菌的防治效果最好。歐陽林海（2020）通過試驗(yàn)得出在檳榔根腐病發(fā)病初期用15%食鹽水施于檳榔樹基部，或用70%甲基托布津1000倍液每隔15 d從基部施用1次，連續(xù)2～3次后對檳榔根腐病有較好的防治效果。石金巧等（2021）采用菌絲生長速率法測定了0.3%四霉素AS、5%己唑·四霉素ME、29%吡萘·嘧菌酯SC和36%喹啉·戊唑醇SC等11種藥劑對可可毛色二孢菌的抑菌活性，發(fā)現(xiàn)29%吡萘·嘧菌酯SC和36%喹啉·戊唑醇SC對可可毛色二孢菌的抑制效果最強(qiáng)。雖然化學(xué)藥劑對病害具有很好的防治效果，但極易使致病菌產(chǎn)生抗藥性；同時(shí)，過度使用化學(xué)農(nóng)藥迫使土壤中的有益微生物數(shù)量驟減，削弱了土壤自身的修復(fù)能力，實(shí)施生物防治是解決這些問題的主要選擇（馬成濤等，2007）。關(guān)于可可毛色二孢菌的生物防治有學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)探索。謝紅輝等（2015，2016a，2016b）通過平板對峙法、孢子萌發(fā)法和田間小區(qū)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌對可可毛色二孢菌的抑菌率達(dá)73.3%，病原菌孢子在解淀粉芽孢桿菌培養(yǎng)液中不能萌發(fā)，生防菌田間防治效果為67.94%；采用生長速率法和載玻片孢子萌發(fā)法測定H.11648劍麻葉汁對可可毛色二孢菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)H.11648劍麻葉汁能顯著抑制桑根腐病病菌可可毛色二孢菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)。鄒東霞等（2018）通過菌絲生長速率法測定了不同培養(yǎng)條件下白僵菌S1-7發(fā)酵液對可可毛色二孢菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)白僵菌S1-7在溫度為28℃，培養(yǎng)時(shí)間20 d，pH 7.0～8.0，培養(yǎng)基中葡萄糖、蛋白胨和酵母粉含量分別為40、20、20 g/L時(shí)對可可毛色二孢菌的生長抑制最強(qiáng)。包興濤（2019）采用菌絲生長速率法測定了含1，3，4-噁二唑的砜類化合物對可可毛色二孢菌的抑制活性，發(fā)現(xiàn)化合物1（甲磺酰菌唑）的抑菌活性最好。目前，關(guān)于檳榔內(nèi)生菌的分離研究較少。韓丹丹等（2017）分離得到1株檳榔內(nèi)生細(xì)菌BLG1，發(fā)現(xiàn)其抑菌譜較廣，對水稻紋枯病的盆栽試驗(yàn)防效達(dá)67.05%。宋薇薇等（2017）通過組織塊分離法從檳榔樹的根、葉和花中共分離得到47株內(nèi)生真菌，分屬于8個(gè)屬?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】生物防治具有諸多優(yōu)點(diǎn)，是病害防治研究的熱點(diǎn)之一。目前關(guān)于可可毛色二孢菌的拮抗菌株報(bào)道較少，且大多處于實(shí)驗(yàn)室階段，有效生防菌株匱乏?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以發(fā)病檳榔園健康檳榔根組織及根際土壤為材料，采用組織勻漿法和平板稀釋梯度培養(yǎng)法分別分離檳榔根組織內(nèi)生細(xì)菌和根際土壤中的細(xì)菌，運(yùn)用平板對峙法對可可毛色二孢菌的生防菌株進(jìn)行篩選，并測定生防菌株菌液對檳榔根部病害病原菌可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑制作用；通過盆栽防效試驗(yàn)驗(yàn)證生防菌株的防治效果；采用單因素變化試驗(yàn)對生防菌株的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期得到對可可毛色二孢菌等檳榔常見根部病害病原菌具有顯著防治效果的生防菌株，以進(jìn)一步豐富檳榔根腐病生物防治的菌種資源，為檳榔根部病害生防菌劑的開發(fā)提供菌種及指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試材料供試樣本為健康檳榔植株根部組織和根際土壤，采自海南保亭、瓊海、萬寧3地發(fā)病檳榔園，每園區(qū)隨機(jī)選取3株健康檳榔樹，每棵樹采集3個(gè)不同方位的根樣及土樣，并立即用無菌聚乙烯密封袋密封，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。供試檳榔根部病原真菌：可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）和奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所植物保護(hù)中心分離保存。試驗(yàn)所用檳榔苗熱研1號由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所基地提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基PDA、NYBD、LB、NA和豆芽汁培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制（楊亞男等，2017；何明川等，2021）。細(xì)菌生理生化測定試劑購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（50T）及PCR相關(guān)試劑均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 拮抗菌的分離、篩選及鑒定

1.2.1 樣品細(xì)菌的分離純化采用組織勻漿法（劉波等，2011）和平板稀釋梯度培養(yǎng)法（邢鵬飛，2017）分別分離根組織內(nèi)生細(xì)菌及根際土壤中的細(xì)菌。用自來水將根清洗干凈后用去離子水沖洗3遍，在無菌條件下，用75%酒精表面消毒30 s，去離子水沖洗3次，用無菌濾紙吸干水分，后用2.6%次氯酸鈉表面消毒90 s；再用去離子水清洗3～4次，用無菌濾紙吸干水分，將最后一次清洗組織塊的無菌水用移液槍吸取少量滴入NA培養(yǎng)基觀察有無菌落長出（易天鳳等，2019），將消毒后的根組織進(jìn)行研磨；最后將根際土壤和根研磨液分別稀釋10-1～10-5等5個(gè)梯度懸液，每個(gè)濃度吸取50μL涂布在NA培養(yǎng)基上進(jìn)行分離，挑取單菌落采用平板劃線法進(jìn)行純化，將純化后的菌株用甘油冷凍保藏法進(jìn)行保存。

1.2.2 可可毛色二孢菌拮抗細(xì)菌的篩選采用平板對峙法進(jìn)行拮抗細(xì)菌篩選。以可可毛色二孢菌為供試靶標(biāo)菌，用直徑5 mm的打孔器分別在培養(yǎng)1 d的細(xì)菌平板和培養(yǎng)5 d的病原真菌平板上打孔，獲得同質(zhì)等量的菌塊。將病原真菌菌塊置于直徑為90 mm的PDA培養(yǎng)基中心，同時(shí)在距平皿中心22.5 mm處的圓周上均勻放置3塊細(xì)菌菌塊，設(shè)置不放置細(xì)菌菌塊的平板為對照，各設(shè)3個(gè)重復(fù)，于28℃培養(yǎng)2 d后測量細(xì)菌及病原菌兩接種點(diǎn)連線上病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑制率（朱海云等，2021）。選取拮抗效果最好的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 拮抗菌種子液制備及菌液對檳榔根部3種病原真菌的抑制作用挑取拮抗菌株單菌落于裝有100 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液備用。

采用濾紙片抑菌法進(jìn)行菌液抑菌作用測定：在超凈工作臺(tái)中將無菌濾紙片在拮抗菌種子液中浸泡30 s，用無菌鑷子夾取濾紙片，置于直徑為90 mm的PDA培養(yǎng)基中心，其余操作方法同1.2.2。

1.3 拮抗細(xì)菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)觀察將拮抗菌株接種至NA培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落的形態(tài)、大小、邊緣、透明度等特征，并在光學(xué)顯微鏡下觀察拮抗菌株形態(tài)。1.3.2生理生化特征采用細(xì)菌生理生化試劑進(jìn)行拮抗菌株的生理生化特性檢測，檢測方法嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行，參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）對菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.3 拮抗菌株種屬鑒定采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA，以拮抗菌株的基因組DNA為模板，采用細(xì)菌通用引物27F：5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′/1492R：5′-CTACGGCTACCT TGTTACGA-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50.0μL：2×TaqPCR Mix 25.0μL，上、下游引物各1.5μL，DNA模板1.0μL，ddH2O 21.0μL；擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，58℃30 s，72℃1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI進(jìn)行序列比對。利用MEGA 7.0采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化

1.4.1 拮抗菌最佳培養(yǎng)基組分篩選最佳碳源、氮源及無機(jī)鹽的篩選參照楊亞男（2017）和何明川等（2021）的方法，以豆芽汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入2%的麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和淀粉進(jìn)行最佳碳源篩選；分別加入1%的氯化銨、酵母浸粉、牛肉膏、甘氨酸和蛋白胨進(jìn)行最佳氮源篩選；分別加入0.3%的MgSO4·7H2O、CaCO3、K2HPO4和KH2PO4進(jìn)行最佳無機(jī)鹽篩選。每處理3次重復(fù)。根據(jù)碳源、氮源及無機(jī)鹽單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置3因素3水平正交試驗(yàn)，對其最佳用量進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳培養(yǎng)基組分配方。

1.4.2 拮抗菌培養(yǎng)條件優(yōu)化參照何明川等（2021）的方法，按照1.4.1優(yōu)化結(jié)果配制培養(yǎng)基，通過單因素試驗(yàn)進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化。轉(zhuǎn)速設(shè)120、150、180、210和240 r/min；培養(yǎng)溫度設(shè)24、28、32和36℃；培養(yǎng)曲線測定分別在0～12 h內(nèi)每隔2 h測量1次，12～24 h每隔4 h測量1次，此外在36、48、60和72 h分別測量1次；pH設(shè)4、6、7、8和10；初始接種量分別加入2%、4%、6%、8%和10%種子液進(jìn)行測定。振蕩培養(yǎng)，測量菌液在600 nm波長時(shí)的OD值，確定拮抗菌濃度，進(jìn)而得到最佳培養(yǎng)條件。每組試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.5 室內(nèi)防效試驗(yàn)

1.5.1 拮抗菌株懸浮液制備挑取拮抗菌株單菌落于裝有100 mL NYBD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于恒溫?fù)u床28℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后得到拮抗菌菌懸液，采用平板菌落計(jì)數(shù)法調(diào)節(jié)菌懸液濃度至109CFU/mL。

1.5.2 盆栽防效試驗(yàn)選取長勢基本一致的熱研1號檳榔苗移栽至裝有滅菌土∶蛭石＝1∶1的花盆中，緩苗15 d左右，采用傷根灌注法（劉斯晗等，2021）向試驗(yàn)組和對照組每盆分別接種孢子濃度為107CFU/mL的可可毛色二孢菌孢子液200 mL，接種病原菌10 d后，用濃度為109CFU/mL的拮抗菌菌懸液對檳榔苗進(jìn)行灌根處理，每株苗接種拮抗菌液200 mL，同時(shí)對照組每株淋入無菌NYBD培養(yǎng)基200 mL。每組5次重復(fù)。定期觀察檳榔幼苗感病與生長情況，計(jì)算幼苗發(fā)病率（趙曉霞等，2019）。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析，使用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用GraphPad prim 8.0.2作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的分離和篩選結(jié)果

從采集的檳榔根組織和根際土壤樣本中共分離到248株細(xì)菌。通過平板對峙法篩選，得到5株對可可毛色二孢菌具有拮抗作用的菌株，且5株拮抗菌的抑菌率均在60.00%以上，其中菌株wrj-2-5的抑制率最高，為74.07%，抑菌帶寬度達(dá)8.50 mm，表明菌株wrj-2-5對可可毛色二孢菌具有較好的抑制作用（圖1和表1）。選取菌株wrj-2-5進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 5株拮抗菌株對可可毛色二孢菌的抑制作用Table 1 Bacteriostasis of 5 antagonistic bacterial strains on L.theobromae

2.2 拮抗菌wrj-2-5菌液對3種檳榔根部病原菌的抑制作用

菌株wrj-2-5菌液對3種檳榔根部病原菌可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌均有較好的抑制作用，抑制率均在70.00%以上（表2）。

表2 拮抗菌wrj-2-5菌液對可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑制作用Table 2 Bacteriostasis of antagonistic bacteria solution wrj-2-5 on L.theobromae，F(xiàn).oxysporum and T.paradoxa

2.3 拮抗菌株鑒定

2.3.1 菌株wrj-2-5形態(tài)學(xué)及生理生化特征將菌株wrj-2-5接種至NA培養(yǎng)基上，32℃培養(yǎng)24 h后生長良好，菌落形態(tài)近圓形，邊緣較整齊，為淡黃色，表面突起，平滑，干燥；菌體呈短桿狀，大小約0.8～1.0 μm×1.0～1.5μm。為革蘭氏陰性菌，能水解明膠，但不能水解淀粉，不能利用甘露醇、硫化氫，V-P反應(yīng)為陰性等，對照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001），初步將菌株wrj-2-5歸為假單胞菌屬（Pseudomonas）（圖2、表3）。

表3 拮抗菌株wrj-2-5的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of antagonistic bacterial strain wrj-2-5

2.3.2 菌株wrj-2-5 16S rDNA序列分析結(jié)果由16S rDNA測序結(jié)果得出擴(kuò)增后的菌株wrj-2-5序列長度為1439 bp，將測序結(jié)果通過BLAST程序與GenBank中序列進(jìn)行比對分析，選取13個(gè)同源性較高的菌株序列，并以Azorhizophilus paspail（LN874287.1）為外群，用MEGA 7.0的NJ法構(gòu)建菌株wrj-2-5系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖3可知，菌株wrj-2-5的16S rDNA序列與銅綠假單胞菌（P.aeruginosaHF572851.1）處于同一分支，遺傳距離最近，相似性達(dá)98%。結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)觀察和生理生化檢測結(jié)果，將菌株wrj-2-5鑒定為銅綠假單胞菌。

2.4 菌株wrj-2-5發(fā)酵條件優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 不同碳源對菌株wrj-2-5生長的影響由圖4可知，菌株wrj-2-5在5種碳源中均可生長，但當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)生長最佳，菌液OD600達(dá)3.47，顯著高于其他碳源處理（P＜0.05，下同）。因此，菌株wrj-2-5生長的最佳碳源為葡萄糖。

2.4.2 不同氮源對菌株wrj-2-5生長的影響由圖5可知，菌株wrj-2-5在5種氮源中均可生長，但當(dāng)以酵母浸粉為氮源時(shí)生長最佳，菌液OD600達(dá)2.82，其次為牛肉膏和蛋白胨處理，三者間菌液OD600差異不顯著（P＞0.05，下同）。因此，菌株wrj-2-5生長的最佳氮源為酵母浸粉。

2.4.3 不同無機(jī)鹽對菌株wrj-2-5生長的影響由圖6可知，菌株wrj-2-5在4種無機(jī)鹽中均可較好地生長，且不同無機(jī)鹽處理的菌液OD600差異不顯著，其中以MgSO4·7H2O為無機(jī)鹽時(shí)菌株wrj-2-5生長最佳，菌液OD600達(dá)2.03。因此，菌株wrj-2-5生長的最佳無機(jī)鹽為MgSO4·7H2O。

2.4.4 菌株wrj-2-5培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)結(jié)果以葡萄糖、酵母浸粉和MgSO4·7H2O為因素的正交試驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，RC＞RB＞RA，根據(jù)表中K值大小，得出最佳培養(yǎng)基組合為1.5%葡萄糖、1.5%酵母浸粉、0.2%MgSO4·7H2O，即優(yōu)化培養(yǎng)基配方為葡萄糖1.5 g、酵母浸粉1.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、水100 mL。

表4 葡萄糖、酵母浸粉和MgSO4·7H2O正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of glucose，yeast extract and MgSO4·7H2O

2.4.5 不同培養(yǎng)條件對菌株wrj-2-5生長的影響以優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，通過單因素試驗(yàn)進(jìn)行最佳培養(yǎng)條件篩選，依次研究不同轉(zhuǎn)速、溫度、時(shí)間、pH、接種量對菌株wrj-2-5生長的影響。結(jié)果顯示，菌株wrj-2-5的最適轉(zhuǎn)速240 r/min（圖7-A）、最適溫度28℃（圖7-B）、最適種子液接種量8%（圖7-C）、最適初始pH 6（圖7-D）、最適培養(yǎng)時(shí)間36 h（圖7-E）。

2.5 盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證

盆栽試驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組有3株植株葉片葉尖首先發(fā)黃隨后干枯，主根維管束變黑腐爛，長勢普遍較弱，最后整株枯死，發(fā)病率為60.00%；試驗(yàn)組幼苗整體長勢較好（圖8）。由于檳榔根腐病未進(jìn)行過分級，不能得出其防治效果，因此本研究用對照組和試驗(yàn)組的發(fā)病率來表示生防菌對病害的防效。由對照組和試驗(yàn)組的根腐病發(fā)病率得出菌株wrj-2-5對由可可毛色二孢菌引起的根腐病具有較好的防治效果。

3 討論

本研究篩選到的生防菌株wrj-2-5為檳榔根內(nèi)生菌。內(nèi)生菌是指其生活史的一定階段或全部階段定殖于植物器官、組織內(nèi)部以及細(xì)胞間隙的微生物。植物內(nèi)生菌長期與植物共生在一起，已形成多種防病作用機(jī)制，不同內(nèi)生菌的防病機(jī)制可能有所不同，大體分為產(chǎn)生次生代謝物、誘導(dǎo)宿主植物產(chǎn)生抗性、與病原菌競爭3種作用機(jī)制，且3種作用機(jī)制可以相互轉(zhuǎn)化（宋薇薇等，2018；韋俊宏等，2019；蔣晶晶等，2020）。研究表明，從大豆內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）TF28中分離得到1種分子量為1057 u的抗菌肽伊枯草菌素A，不僅能抑制水稻惡苗病菌（F.nwnilifornu）的菌絲生長及孢子萌發(fā)，還能抑制灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）和尖孢鐮刀菌等其他病原菌的生長（Zhang et al.，2012）。組織分離法（宋薇薇等，2017）和組織勻漿法（劉波等，2011）是內(nèi)生菌傳統(tǒng)分離的主要方法，是篩選有益菌株如拮抗菌的最佳選擇（張晨智，2018）。前期研究發(fā)現(xiàn)，檳榔根內(nèi)生細(xì)菌分離更適合采用組織勻漿法。內(nèi)生菌作為潛在生防資源和外援基因載體在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為農(nóng)業(yè)專家研究的焦點(diǎn)（胡桂萍等，2010）。檳榔根腐病是檳榔極易發(fā)生的病害，主要以葉尖變黃、根莖腐爛變色為主，是由多種病原引起的真菌性病害（李增平等，2006）。本研究對其中一種病原可可毛色二孢菌進(jìn)行拮抗菌篩選，得到1株拮抗效果好的菌株wrj-2-5，并發(fā)現(xiàn)菌株wrj-2-5對檳榔其他根腐病病原也有較好的抑制作用，該菌株經(jīng)鑒定為銅綠假單胞菌，在拮抗菌生理生化測定中硝酸鹽還原和檸檬酸鹽利用與黃妙容等（2017）測定的結(jié)果存在差異，可能是由于菌株生長的環(huán)境、分離的部位及菌株的進(jìn)化等原因造成，但本研究結(jié)果基本符合《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）中假單胞菌屬的特性。

銅綠假單胞菌作為生防菌株的研究時(shí)間較短（蔣海霞等，2015），目前發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的吩嗪-1-羧酸、吩嗪-1-酰胺、藤黃綠膿菌素、3,4-二羥基-N-甲基-4-苯并二氫吡喃酮-丁酰胺、L-2-氨基-4-甲氧基-反式-3-丁烯酸和鼠李糖脂等一系列次生代謝物質(zhì)均有較強(qiáng)的抑菌作用（Bano and Musarrat，2003；Sulochana et al.，2014）。銅綠假單胞菌除具有抗病作用外，還有一定的促生作用：代謝產(chǎn)生鐵載體，通過特異的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)將鐵元素轉(zhuǎn)移至體內(nèi)，供植物生長（蔣海霞等，2015）。已有報(bào)道銅綠假單胞菌菌液對煙草青枯病的防治效果為60%，且優(yōu)于農(nóng)用鏈霉素的防效（胡軍華等，2009），對番茄枯萎病防效達(dá)81%（郝曉娟等，2011）；鐘小燕等（2009）報(bào)道假單胞菌次生代謝物質(zhì)對香蕉枯萎病有較好的抑制作用。本研究從健康檳榔根中分離篩選到的銅綠假單胞菌菌株wrj-2-5對3種檳榔根部病原菌可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌的抑制率達(dá)70.00%以上，通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株wrj-2-5對根腐病有較好的防治效果，研究結(jié)果為可可毛色二孢菌的生物防治提供了參考依據(jù)。

銅綠假單胞菌在生長過程中能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，在外界營養(yǎng)和發(fā)酵均適宜的條件下，其產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)通常更豐富（葉云峰等，2011）。對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化能提高生物農(nóng)藥制劑的抑菌效果，節(jié)約生產(chǎn)成本（力治剛，2016）。因此，本研究采用單因素變化試驗(yàn)等進(jìn)行了菌株wrj-2-5的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化。本研究菌株wrj-2-5的最佳發(fā)酵條件與韓志雪等（2019）對銅綠假單胞菌MEW079的優(yōu)化結(jié)果相比，在單因素試驗(yàn)確定最佳碳源和發(fā)酵的最佳轉(zhuǎn)速時(shí)，菌株wrj-2-5生長的最佳碳源是葡萄糖，而菌株MEW079生長的最佳碳源是蔗糖，菌株wrj-2-5發(fā)酵時(shí)的最佳轉(zhuǎn)速是240 r/min，而菌株MEW079發(fā)酵時(shí)的最佳轉(zhuǎn)速為150 r/min，其他發(fā)酵條件則基本相似，2株銅綠假單胞菌最佳發(fā)酵條件存在差異的原因可能是由于菌株來源、生境、用途等不同所造成，后續(xù)應(yīng)再次驗(yàn)證。本研究結(jié)果為銅綠假單胞菌的生物防治提供了更多的參考及依據(jù)，下一步將加強(qiáng)菌株wrj-2-5次生代謝產(chǎn)物分離等方面的研究。

4 結(jié)論

經(jīng)鑒定菌株wrj-2-5為銅綠假單胞菌，其對可可毛色二孢菌、尖孢鐮刀菌和奇異根串珠霉菌均有較好的抑制作用，對由可可毛色二孢菌引起的檳榔根腐病有較好的防治效果，可作為研制檳榔根腐病生防菌劑的候選菌株資源。