李紀潮，張金渝，蔡明姬，陳秀花，唐乙云，楊紹兵*

（1云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，云南昆明 650231；2云南省元謀縣黃瓜園鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務中心，云南楚雄 652100；3云南省貢山縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南怒江傈僳族自治州 673200；4云南省怒江州木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究所，云南怒江傈僳族自治州 673200）

0 引言

【研究意義】草果（Amomum tsao-ko）為姜科豆蔻屬多年生常綠叢生草本植物，在我國具有悠久的食、藥用歷史，既是食品調(diào)料中的“五香之一”，同時具有燥濕除寒、祛痰截瘧等藥用功能（Liu et al.，2019）。云南省是我國草果主產(chǎn)區(qū)，種植面積占全國95%以上，怒江州作為草果的最適宜生長區(qū)，同時地處中緬國界線的地理位置，草果的廣泛栽培和產(chǎn)業(yè)發(fā)展已作為政府實施“一帶一路”的重要經(jīng)濟部署，全州帶動種植草果6.93×104ha，已成為鄉(xiāng)村振興的“致富果”（楊紹兵和張金渝，2018）。云南省農(nóng)業(yè)科學院專家團隊2014—2018年對怒江州草果病蟲害的調(diào)查結(jié)果表明，葉斑病類病害對草果產(chǎn)量和品質(zhì)的影響最大，其發(fā)病率高、發(fā)生范圍廣，種植區(qū)葉斑病和疫病可使草果產(chǎn)量損失20%～30%，嚴重的年份可達50%以上。目前怒江州草果葉斑病類病害發(fā)生總面積達1.67×104ha，平均每年損失草果5030 t（Qin et al.，2021），因此，對草果葉斑類病害的防控技術(shù)進行深入研究，對于指導該病害的科學用藥和高效防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】新型藥劑不僅具有殺菌譜廣、低毒、低殘留、內(nèi)吸型降解快的優(yōu)良特點，還具有不同程度的植物生長調(diào)節(jié)保護作用，是作物綠色防控的重點研究目標（Ma et al.，2018）。Yao等（2018）研究表明，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑通過影響病菌電子傳遞繼而導致其能量供應不足，從而抑制病菌呼吸作用影響其生長，該類殺菌劑的殺菌譜廣且與菌劑無交互抗性，對植物葉部炭疽病具有較高的防控效果；馬云云等（2020）研究結(jié)果顯示，咪鮮胺對膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）菌絲生長有明顯的抑制作用；劉世江等（2020）研究表明丙環(huán)唑?qū)λ炯y枯病菌（Rhizoctonia solani）具有較強的抑制活性，且病菌對丙環(huán)唑的敏感性較高，不受菌株地理來源的影響。另外，新型高活性藥劑具有低殘留和降解快等特點，對人體不會產(chǎn)生不可接受的膳食風險。Sefiloglu等（2021）研究表明嘧菌酯可防控茄子葉斑病，且種植過程中最終檢出殘留量＜0.01～1.61 mg/kg，遠低于國家膳食風險標準，評估為較安全的食用級可施用殺菌劑。同時，新型高效殺菌劑之間的合理配伍聯(lián)用不僅能延長病原菌產(chǎn)生抗藥性的時間，還能提高單一藥劑的防治效果，節(jié)省成本。謝立等（2020）研究表明咪鮮胺與微生物菌劑枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Czk1復配對橡膠炭疽病菌（C.gloeosporioides）的抑菌活性具有明顯增效作用；Cao等（2021）研究表明甾醇脫甲基抑制劑（DMIs）對子囊菌和半知菌引起的多種真菌病害防效最好，但頻繁使用易產(chǎn)生抗藥性，而與咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑復配可達到178的增效系數(shù)，可在顯著降低藥劑使用量的同時達到較長的防治時效；周艾艾等（2021）田間試驗結(jié)果顯示丙環(huán)唑與肟菌酯組合對水稻紋枯病菌具有較好的協(xié)同防治效果，且可極大減少藥劑使用量?！颈狙芯壳腥朦c】民間草果種植一直沿襲傳統(tǒng)模式，至今大部分地區(qū)仍處于半野生栽培狀態(tài)，缺乏科學的栽培管理方法與病害防治措施，而化學藥劑在病害暴發(fā)的應急防治方面具有較大優(yōu)勢，管理方式更為廣泛、及時、高效。目前，尚未見有關草果葉斑病類病害防治藥劑敏感性以及針對當?shù)貎?yōu)勢致病型菌株進行藥劑篩選的研究報道，缺乏化學單劑及單劑復配對草果葉斑病類病害防效的綜合性研究?！緮M解決的關鍵問題】以3種草果葉斑類病害（炭疽病、葉瘟病和葉斑病）的強致病菌［炭疽菌（Colletotrichumsp.）、灰梨孢菌（Pyricularia grisea）和莖點霉（Phomasp.）］為材料，采用菌絲生長速率法測定6種藥劑（嘧霉胺、腈菌唑、咪鮮胺、代森錳鋅、嘧菌酯和吡噻菌胺）對草果葉斑病類致病菌株的敏感性和毒力變異系數(shù)，分析藥劑間的交互抗性，旨在篩選出對草果葉斑類病害防效和安全性較好的藥劑及組合，為草果葉斑類病害的綠色防控和生態(tài)種植提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試病菌從怒江州草果主產(chǎn)區(qū)瀘水市、福貢縣和貢山縣等10個草果產(chǎn)區(qū)采集病害樣品共30份進行病原菌分離純化，依照柯赫氏法則進行回接鑒定，獲得引起3種草果葉斑類病害（炭疽病、葉瘟病和葉斑?。┑膹娭虏【?5份，其中炭疽菌屬8份、灰梨孢菌5份、莖點霉12份，保存于PDA斜面培養(yǎng)基，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試藥劑400 g/L嘧霉胺懸浮劑（拜耳作物科學有限公司）；40%腈菌唑懸浮劑（福建新農(nóng)大正生物工程有限公司）；40%咪鮮胺水乳劑（山西泓洋化工有限公司）；80%代森錳鋅可濕性粉劑（安道麥股份有限公司）；240 g/L嘧菌酯懸浮劑（世科姆作物科技有限公司）；20%吡噻菌胺懸浮劑（世科姆作物科技有限公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：葡萄糖20 g、土豆200 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL。

1.1.4 主要儀器GR60DA電熱壓力蒸汽滅菌鍋（致微儀器有限公司）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；DHP-9051微生物培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 藥劑對病菌菌絲生長的影響采用菌絲生長速率法測定（馮寶珍和李培謙，2019）。將培養(yǎng)基加熱后冷卻至50℃左右，分別倒入100 mL無菌錐形瓶中，在預試驗的基礎上，將6種供試藥劑母液稀釋成系列濃度，分別加入錐形瓶中均勻攪拌，向每個培養(yǎng)皿內(nèi)倒入10 mL含藥培養(yǎng)基，以不加藥劑的PDA培養(yǎng)基為對照，各處理3次重復。將保存的菌種于無菌的PDA培養(yǎng)基中進行活化培養(yǎng)，培養(yǎng)6 d后每份菌株隨機選取3個病菌培養(yǎng)基，用打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，將菌絲塊接種至已凝固的含藥培養(yǎng)基及空白對照培養(yǎng)基正中央，于25℃恒溫條件下倒置培養(yǎng)，每3 d測量一次菌落直徑，直至空白對照組菌落占培養(yǎng)皿的80%。用垂直十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

1.2.2 藥劑抑制中濃度（EC50）和變異系數(shù)分析采用SPSS 20.0的Probit回歸分析計算藥劑EC50。以藥劑濃度對數(shù)值為自變量x，以抑菌率的概率值為因變量y，建立毒力回歸方程，通過毒力回歸方程計算各藥劑EC50，EC50越小則說明該藥劑的毒力越強。

采用SPSS 20.0計算病菌對各藥劑的毒力變異系數(shù)。

式中，X代表3種致病菌，Y代表6種藥劑。變異系數(shù)代表X病菌對Y藥劑的敏感性差異程度，變異系數(shù)越大代表Y藥劑對X病菌的抑制作用越不穩(wěn)定，存在較大的個體差異。

1.2.3 交互抗性運用病菌對藥劑的EC50對數(shù)值進行Spear-man’s秩相關系數(shù)分析。若P＜0.05，說明2種藥劑間存在交互抗性；P＞0.05，則說明2種藥劑間無交互抗性，可復配或交替使用（Cao et al.，2021）。

1.3 統(tǒng)計分析

運用SPSS 20.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，試驗數(shù)據(jù)以x±s表示，用Duncan’s新復極差法進行數(shù)據(jù)差異顯著性檢驗（α=0.01），用Excel 2017繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 草果炭疽病菌對6種藥劑的敏感性和毒力變異系數(shù)測定結(jié)果

對6種藥劑的毒力敏感性測定結(jié)果（表1）顯示，吡噻菌胺各濃度對草果炭疽菌的抑制作用均較強，對病菌菌絲生長抑制率均在61.68%以上，最高達93.57%；吡噻菌胺和咪鮮胺對病菌的EC50最小、毒力最強，且與其他藥劑的EC50差異顯著（P＜0.05，下同）。吡噻菌胺對病菌的EC50為0.03～0.07μg/mL，平均值為0.04μg/mL；咪鮮胺對病菌的EC50為0.05～0.09μg/mL，平均值為0.08μg/mL；嘧霉胺和代森錳鋅對病菌的EC50最大、毒力較弱，嘧霉胺的EC50平均值為26.71μg/mL，與毒力最強的吡噻菌胺的EC50相差約667.75倍。草果炭疽菌對各藥劑的毒力變異系數(shù)測定結(jié)果（表1）顯示，吡噻菌胺和咪鮮胺對病菌的毒力變異系數(shù)最大，分別為31.22%和25.50%，2種藥劑的毒力雖然最強，但對病菌的抗性存在較大的個體差異；嘧霉胺、代森錳鋅和晴菌唑?qū)Σ【亩玖ψ儺愊禂?shù)較小，對病菌的抗性較穩(wěn)定。

表1 草果炭疽菌對6種藥劑的敏感性和毒力變異系數(shù)Table 1 Sensitivity and coefficients of variation of virulence of Colletotrichum sp.from Amomum tsao-ko to 6 medicaments

2.2 草果葉瘟病菌對6種藥劑的敏感性和毒力變異系數(shù)測定結(jié)果

對6種藥劑的毒力敏感性測定結(jié)果（表2）顯示，咪鮮胺和吡噻菌胺對草果灰梨孢菌的EC50最小，毒力最強，且與其他藥劑的EC50顯差異著。咪鮮胺對病菌的EC50為1.28～1.77μg/mL，平均值為1.66μg/mL；吡噻菌胺對病菌的EC50為2.18～4.25μg/mL，平均值為3.15μg/mL；嘧霉胺和嘧菌酯對病菌的EC50最大、毒力較弱，嘧霉胺和嘧菌酯的EC50平均值分別為43.61和41.60μg/mL，與毒力最強的咪鮮胺的EC50相差26.27和25.06倍。毒力變異系數(shù)測定結(jié)果（表2）顯示，吡噻菌胺對病菌的毒力變異系數(shù)最大，為22.30%，咪鮮胺和嘧霉胺的毒力變異系數(shù)次之，分別為12.49%和13.46%，咪鮮胺和吡噻菌胺的毒力雖然最強，但對病菌的抗性存在較大的個體差異；晴菌唑的毒力變異系數(shù)較小，對病菌的抗性較穩(wěn)定。

表2 草果灰梨孢菌對6種藥劑的敏感性和毒力變異系數(shù)Table 2 Sensitivity and coefficients of variation of virulence of P.grisea from Amomum tsao-ko to 6 medicaments

2.3 草果葉斑病菌對6種藥劑的敏感性和毒力變異系數(shù)測定結(jié)果

對6種藥劑的毒力敏感性測定結(jié)果（表3）顯示，嘧菌酯對草果莖點霉的抑制效果較好，對病菌菌絲的生長抑制率最高達93.34%。各藥劑對病菌的EC50均較低，EC50介于0.17～4.99μg/mL。咪鮮胺和嘧菌酯對病菌的EC50最小、毒力最強，且與其他藥劑的EC50差異顯著；咪鮮胺對病菌的EC50為0.14～0.23μg/mL，平均值為0.17μg/mL；嘧菌酯對病菌的EC50為0.28～0.42μg/mL，平均值為0.32μg/mL；代森錳鋅對病菌的EC50最高、毒力最弱。毒力變異系數(shù)測定結(jié)果（表3）顯示，吡噻菌胺和咪鮮胺對病菌的毒力變異系數(shù)最大，分別為14.37%和13.14%，2種藥劑對病菌的抗性存在較大的個體差異；代森錳鋅對病菌的毒力變異系數(shù)最小，對病菌的抗性較穩(wěn)定。

表3 草果莖點霉對6種藥劑的敏感性和毒力變異系數(shù)Table 3 Sensitivity and coefficients of variation of virulence of Phoma sp.from Amomum tsao-ko to 6 medicaments

2.4 不同藥劑毒力交互抗性分析結(jié)果

各藥劑對3種病菌的lgEC50相關性分析結(jié)果（表4）顯示，咪鮮胺、晴菌唑和吡噻菌胺3種藥劑間極顯著相關（P＜0.01，下同），藥劑間存在較大的交互抗性；咪鮮胺與晴菌唑的相關系數(shù)為0.827、與吡噻菌胺的相關系數(shù)為0.922，晴菌唑與吡噻菌胺的相關系數(shù)為0.770。咪鮮胺和吡噻菌胺分別與嘧霉胺、代森錳鋅、嘧菌酯之間無顯著相關性（P＞0.05），藥劑間無交互抗性。

表4 各藥劑間毒力的相關系數(shù)分析Table 4 Correlation coefficent analysis of virulence between medicaments

3 討論

在殺菌劑新品種研發(fā)層面，高活性殺菌劑如甲氧基丙烯酸酯類、嘧啶胺類、酰胺類和三唑類殺菌劑等相繼取得重大突破，這些殺菌劑對生態(tài)環(huán)境友好，較少造成污染殘留，且具有特定的反應機理，適宜大面積應用于植物病害防治。一些病害如霜霉病、灰霉病、水稻稻瘟病和水稻紋枯病等難以防治的病害用這類殺菌劑治療有特效。綠色農(nóng)用殺菌劑是未來殺菌劑發(fā)展的必然趨勢（Chen et al.，2020；張恒等，2021）。

本研究結(jié)果顯示，吡噻菌胺和咪鮮胺對炭疽菌及灰梨孢菌2種病菌的毒力最強，且與其他藥劑的EC50差異顯著，研究結(jié)果與部分炭疽病防控藥劑篩選結(jié)果相似。如Zhang等（2017）研究表明咪鮮胺對辣椒炭疽病菌的EC50為0.053μg/mL，且通過毒力敏感基線和頻率圖分析發(fā)現(xiàn)，除少數(shù)野生種源外，炭疽菌對甾醇脫甲基型抑制劑（DMIs）的抗藥風險較低；Wei等（2020）研究表明45%咪鮮胺對辣椒炭疽病菌的抑制效果最好，田間防效達80.26%；Mora-Aguilera等（2021）研究表明500 mg/mL咪鮮胺水分散粒劑對芒果炭疽病菌株的抑菌效果最好，平均EC50僅為0.03μg/mL。另外，研究顯示新型防控藥劑除具有殺菌譜廣的特點外，還具有低殘留和降解快的優(yōu)良特點。Noh等（2019）對連續(xù)施用吡噻菌胺的紫蘇葉進行農(nóng)藥殘留分析，結(jié)果表明吡噻菌胺代謝率較高，殘留物持久性為4.9%，根據(jù)食品安全國家標準確定其健康風險較低，評估為較安全的高效殺菌劑。因此，新型高效低毒的咪鮮胺和吡噻菌胺藥劑可作為草果葉斑病類病害的綠色防控藥劑，可用于對草果葉炭疽病和葉瘟病的綜合防控。

本研究中莖點霉對供試6種藥劑的敏感性均較強，各藥劑對病菌的EC50均較低，介于0.17～4.99μg/mL，其中以咪鮮胺和嘧菌酯的毒力最強。Pintore等（2018）研究表明咪鮮胺對油棕草莖點霉的毒力最強，EC50為1.45 mg/L，防控效果最好；Zamani-Noor和Knüfer（2018）研究表明，25%嘧菌酯對油菜莖點霉的EC50最低，為0.66μg/mL，且田間試驗中平均防效達86.81%。另外，研究表明新型藥劑還具有不同程度的植物生長調(diào)節(jié)保護作用。Navathe等（2020）研究結(jié)果顯示嘧菌酯不僅有效降低了小麥葉斑病發(fā)病率，且顯著增加了谷粒日積累量和干物重，提高了小麥產(chǎn)量。目前市面上所推廣的嘧菌酯價格相對較低，適宜農(nóng)戶在草果葉斑類病害的防治中使用。

單一連續(xù)使用同類殺菌劑時病原菌容易產(chǎn)生抗藥性，導致防效下降，混劑可增加對病害的綜合防控效果。本研究不同藥劑交互抗性分析結(jié)果顯示，咪鮮胺和吡噻菌胺分別與嘧霉胺、代森錳鋅、嘧菌酯間無顯著相關性，藥劑間無交互抗性。前期研究結(jié)果顯示咪鮮胺與氟啶胺以3∶1和6∶1的比例混合可對炭疽菌孢子抑制產(chǎn)生協(xié)同效應，而以1∶6或1∶3混合可產(chǎn)生增效效應（Patel et al.，2019）。Zhang等（2019）對咪鮮胺與菌核凈復配的研究表明，混合藥劑可提升對致病菌的刺激度，2種殺菌劑的混合物對細胞膜滲透性的影響具有增效效應，對致病菌抑制效率顯著提高。因此，選擇吡噻菌胺和咪鮮胺分別與嘧霉胺、代森錳鋅、嘧菌酯復配或輪換使用，可避免病菌產(chǎn)生抗藥性，同時達到科學、廣泛、高時效的防治效果。

目前，尚未見草果葉斑類病害新型低毒藥劑篩選與評價的相關報道。本研究通過測定6種藥劑對3種草果葉斑類病害致病菌株的敏感性和毒力變異系數(shù)，并分析藥劑間的交互抗性，綜合篩選出具有較高防控效果的藥劑及組合，對于指導草果葉斑類病害的田間科學用藥和高效防治具有重要意義。但目前咪鮮胺及藥劑組合僅在怒江州草果部分種植區(qū)施用，實際應用效果還需在多個試驗地進一步驗證，下一步也需從多角度分析致病菌對新型防控藥劑的生理響應以闡明其抑菌機理。此外，草果葉斑病類病害防控應貫徹“預防為主，綜合治理”的方針。加強病害預測預報，建立監(jiān)測網(wǎng)絡體系，全面、及時、準確地通報草果病害發(fā)生動態(tài)，在染病初期結(jié)合藥劑及時根治，避免草果葉斑病類病害大面積發(fā)生，以確保草果的產(chǎn)品質(zhì)量，實現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)。

4 結(jié)論

吡噻菌胺和咪鮮胺可作為草果葉斑病類病害的新型低毒防控藥劑，2種藥劑與嘧霉胺、代森錳鋅、嘧菌酯復配具有較好的協(xié)同效果，可減少藥劑使用量且避免病菌產(chǎn)生抗藥性，達到高效防控草果葉斑類病害的效果。吡噻菌胺和咪鮮胺單劑分別與嘧霉胺、代森錳鋅、嘧菌酯的復配劑可作為草果葉斑病類病害的新型低毒防控藥劑在草果生態(tài)種植中推廣使用。