李貴生

(吉首大學(xué) 生物資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，湖南吉首 416000)

胚胎發(fā)生是植物繁殖的重要方式，除此之外是壓條、扦插和嫁接。植物的胚胎發(fā)生既可通過合子、也可通過體細(xì)胞進(jìn)行。很多種類的體細(xì)胞都能進(jìn)行胚胎發(fā)生，譬如單倍體的小孢子和二倍體的莖尖。體細(xì)胞可以直接形成胚胎，也可在此之前先形成愈傷。一般來講，體細(xì)胞胚胎發(fā)生的原胚期會先后經(jīng)歷細(xì)胞重編程、細(xì)胞獲得全能性以及胚性細(xì)胞形成[1-2]。體細(xì)胞胚胎隨后依次變成球狀胚、心形胚、魚雷胚、子葉胚等，這與雙子葉植物合子的胚胎發(fā)生極為相似，除了沒有最后的失水以及休眠[3]。愈傷的胚胎發(fā)生是了解體細(xì)胞胚胎發(fā)生以及合子胚胎發(fā)生的重要工具。

104個代謝物的靶向研究表明，咖啡(Coffeaarabica)的愈傷在增殖期較分化期有更多的葡萄糖、果糖、甘氨酸、蛋氨酸以及甘油，而后者有更多的蔗糖、亮氨酸、賴氨酸、色氨酸、咖啡酸、苯甲酸、鳥苷、肌苷以及黃苷[4]。用核磁共振分析香莢蘭(Vanillaplanifolia)愈傷中的12個化合物發(fā)現(xiàn)，其增殖期相比于分化期有更多的蔗糖、葡萄糖和丙氨酸，而后者有更多的γ-氨基丁酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、纈氨酸以及次級代謝物(如酚類化合物)[5]。LC-MS的非靶向代謝組研究在棉花(Gossypiumhirsutum)的愈傷胚胎發(fā)生中發(fā)現(xiàn)了581個代謝物，且其分化期相比于增殖期有更多的天冬氨酸、組氨酸、精氨酸、蘇氨酸以及維生素B1[6]。質(zhì)譜分析在水飛薊(Silybummarianum)愈傷中鑒定了19個代謝物，而其增殖期有更多的谷氨酰胺、異亮氨酸、精氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、色氨酸、蔗糖、肉桂酸、莰非醇、槲皮苷、亞麻酸、楊梅苷、莽草酸-3-磷酸等，分化期則有更多的尿素、葡萄糖以及果糖[7]。裸子植物的愈傷形成體細(xì)胞胚胎的過程中，賴氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和絲氨酸會顯著增加，而蔗糖顯著減少[8]。此外，凹唇姜(Boesenbergiarotunda)的胚性愈傷相比于非胚性愈傷含有更多的谷氨酸、精氨酸和賴氨酸，但幾乎不含喬松素、球松素、小豆蔻素以及山姜素[9]。甘蔗的胚性和非胚性愈傷相比有更多的糖和氨基酸[10]。苯丙醇以及多酚類如羥基肉桂酸對于愈傷的誘導(dǎo)非常重要[11]，而多胺、肉桂酸、莰非醇、五羥黃酮、楊梅黃酮、亞麻酸在體細(xì)胞胚的形成中有重要作用[7,12]。相比于外植體和再生植株，愈傷組織有更多的能量代謝和細(xì)胞分裂方面的代謝物如糖和氨基酸，但是含有較少的木質(zhì)化代謝物如咖啡酸酯和膽堿，以及免疫性相關(guān)的代謝物如甲基哌啶和3-甲基-2-酮哌嗪[13]。

蕨類植物是種子植物的姊妹類群，對于陸地植物胚胎發(fā)生的認(rèn)識具有不可替代的作用。樹蕨(Cyatheadelgadii)的直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生能被分為3個階段，即線狀原胚期、胚胎的一葉期以及二葉期[14]，并且有相關(guān)蛋白的伴隨[15]。水蕨(Ceratopterisrichardii)是蕨類植物研究的準(zhǔn)模式物種，而它的體細(xì)胞胚胎可從莖尖誘導(dǎo)，即先在6-芐氨基嘌呤(6BA)的培養(yǎng)基中形成愈傷，然后在沒有添加任何外源激素的情況下分化、直至最后形成再生植株[16-17]。水蕨的體細(xì)胞胚胎發(fā)生可能與BABYBOOM(BBM)之類的基因有關(guān)[18]。本研究通過非靶向代謝組學(xué)分析，比較水蕨愈傷的增殖期和分化期代謝物的差異，為進(jìn)一步了解植物胚胎發(fā)生提供了資料。

1 材料和方法

1.1 愈傷組織培養(yǎng)

水蕨(Langdale JA贈)孢子用1∶5倍稀釋的次氯酸鈉消毒，然后用無菌水洗5遍[16-17]。水蕨孢子于盛有20 mL 1× MS液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑 9 cm)中，置于光照培養(yǎng)箱(25 ℃，16 h光照)。經(jīng)萌發(fā)、受精、胚胎發(fā)育，約4周后，將已有根和莖的孢子體置于含5 μmol/L 6BA的1× MS固體培養(yǎng)基上。約2周后，從孢子體莖尖清理出愈傷組織、并將之分小，然后繼代培養(yǎng)。制備材料時，將同一部分愈傷組織分為2份，而1份放于含6BA的培養(yǎng)基，另1份放于只有MS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d后收集。前一種材料命名為6BA，而后一種材料命名為MS，它們各有6份作為生物學(xué)重復(fù)。

1.2 非靶向代謝組學(xué)測定

材料用液氮速凍并保存于-70 ℃，然后用干冰運往華大基因(深圳，中國)。取150 mg材料，加入1 mL預(yù)冷的甲醇和水的混合液，用組織研磨器在50 Hz、4 ℃研磨5 min，并每10 min渦旋1次、共3次，4 ℃放置過夜[19]。再次渦旋，然后離心(13 000 g，10 min，4 ℃)。取800 μL上清液，將之過濾備用(0.22 μm)。用ACQUITY UPLC I-Class(Waters，美國)以及QTRAP6500 Plus(SCIEX，美國)進(jìn)行LC-MS分析，色譜柱是ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100 mm，1.8 μm)(Waters)。流動相A液是0.1%甲酸水溶液，而B液是0.1%甲酸乙腈溶液。40 ℃梯度洗脫，依次是0～2 min，5% B；2～22 min，5%～95% B；22～27 min，95% B；27～30 min，5% B，溶液流速是0.3 mL/min。離子源參數(shù)是500 ℃、4 500 V，GS1、GS2和CUR分別是10、40和20 psi。在MRM模式下設(shè)置代謝物的母子離子對信息、碰撞能量、去簇電壓以及保留時間。上樣順序是QC(標(biāo)準(zhǔn)品)-1、QC-2、MS.1、MS.2、MS.3、MS.4、MS.5、QC-3、MS.6、6BA.1、6BA.2、6BA.3、6BA.4、6BA.5、6BA.6、QC-4和QC-5。

1.3 數(shù)據(jù)分析

在HRAM-PMDB(華大基因)和mzCloud(https://www.mzcloud.org/)數(shù)據(jù)庫鑒定代謝物，用MultiQuant軟件(SCIEX)計算代謝物色譜質(zhì)譜圖峰面積(此即代謝物的相對含量)。運用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量和樣品類別之間的關(guān)系模型，通過計算變量投影重要度即VIP來衡量各代謝物表達(dá)模式對各組樣本分類的影響強度和解釋能力(一般認(rèn)為VIP大于1才表示該代謝物對樣本類別的區(qū)分有顯著作用)。峰面積數(shù)據(jù)先進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行Pareto縮比，然后用于建立偏最小二乘法-判別分析即PLS-DA的模型[20]。建立模型時進(jìn)行7折交互驗證(7 fold cross validation)，并進(jìn)行200次響應(yīng)排序檢驗。差異積累代謝物的標(biāo)準(zhǔn)是VIP≥1，變化倍數(shù)≥1.2或者≤0.83，以及P< 0.05(單尾不成對等方差t檢驗)。通過人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫即HMDB和京都基因與基因組百科全書即KEGG對代謝物進(jìn)行功能注釋。差異積累代謝物聚類分析時先將峰面積數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換以及z-score標(biāo)準(zhǔn)化，然后采用歐氏距離進(jìn)行層次聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 水蕨愈傷胚胎發(fā)生過程

在6BA培養(yǎng)基上的愈傷會一直處于增殖狀態(tài)，而其顏色保持為祖母綠(圖1，A)。愈傷轉(zhuǎn)到?jīng)]有任何激素添加的MS培養(yǎng)基后，開始分化。分化早期(第4天)沒有明顯的顏色改變(圖1，B)，但隨著分化的推進(jìn)愈傷開始變綠(圖1，C)。一直分化到第12天，愈傷都沒有形態(tài)上的明顯變化(圖1，D)。但是，最終(第24天)愈傷會再生出莖葉(圖1，E)，而根會在更晚的時候出現(xiàn)。因此，處于以上兩個不同生長環(huán)境的愈傷可分別代表水蕨愈傷的增殖期樣本和分化期樣本，而側(cè)重分化早期能避開疊加的形態(tài)差異、從而捕捉到觸發(fā)分化的分子機制。

A. 增殖期；B. 分化4 d；C. 分化8 d；D. 分化12 d；E. 分化24 d；標(biāo)尺=1 mm

2.2 水蕨愈傷代謝物的種類

通過儀器檢測以及數(shù)據(jù)庫比對，發(fā)現(xiàn)MS樣本里有402個代謝物。在6BA樣本里有同樣多的代謝物，也就是說沒有樣本特異性代謝物。其中257個代謝物能被KEGG系統(tǒng)分類，它們分屬于生物作用化合物、植物化學(xué)化合物、類脂、以及其他物質(zhì)(表1)。生物作用化合物中，苯及其衍生物、氨基酸/肽及其類似物、有機酸等占了約48.9%，而其他種類的物質(zhì)最多8種、最少1種。植物化學(xué)化合物中，黃酮最多，萜類次之，而其他類最多含有6種物質(zhì)。類脂中聚酮最多、脂肪酰次之、而固醇脂只有一種。其他物質(zhì)中，各個種類均只有1～2種化合物。

有多種氨基酸，但沒有賴氨酸、精氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸或其類似物。有3種激素即赤霉素、脫落酸、茉莉酸，但沒有生長素和6BA。有4種核苷酸或其類似物。相當(dāng)一部分為藥物成分，如6種喜樹堿衍生物、依托泊苷、達(dá)卡巴嗪、拓?fù)涮婵?、蟾毒靈、古倫賓、鹽酸阿霉素、放線菌酮、烏苯美司、鬼臼毒素可以用于抗腫瘤，厄貝沙坦、醋丁洛爾、地奧司明可以用于降血壓，另外還有帕金森病藥物苯海索、抑郁癥藥舍曲林、抗過敏藥物倍他米松和三七素。

2.3 水蕨愈傷代謝物的含量

幾乎所有402個代謝物在MS和6BA兩類樣本中的含量大致相同(圖2)。93.03%代謝物的含量水平大約集中在14～23之間，而其中含量水平約為17的代謝物最多、占比19.65%。含量水平低的前5個代謝物依次是麥黃酮、表沒食子兒茶素、銀杏內(nèi)酯C、十五酸以及維采寧Ⅱ，而含量水平高的前5個依次是梣酮、對羥基肉桂酸、對香豆酸、香豆素以及蟾毒靈；它們的差異倍數(shù)多達(dá)220。7種沒食子衍生物、6種喜樹堿衍生物中含量最高均可達(dá)19。赤霉素和茉莉酸的含量均約為18，而脫落酸的含量可達(dá)24。腺嘌呤、脯氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、胞嘧啶、色氨酸、酪氨酸、絲氨酸、胸苷、尿苷、乳糖等的含量依次降低，但都大于17。

2.4 統(tǒng)計分析

MS組內(nèi)的斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)平均為(0.96±0.03)，6BA組內(nèi)也為(0.96±0.03)，而組間為(0.95±0.03)，可以看出組內(nèi)相關(guān)性高于組間相關(guān)性。PLS-DA預(yù)測到3個主成分，前2個主成分的比例分別是31.12%和19.52%(圖3，A)。所用模型的適合度R2為1，預(yù)測力Q2為0.52，而模型檢驗表明R2的截距為0.92、Q2的截距為-0.89(圖3，B)。PLS-DA檢測到VIP≥1的代謝物有119個。t檢驗表明，其中只有45個代謝物為P< 0.05，而又有3個代謝物的變化倍數(shù)小于1.2。代表性代謝物的分析表明，皂皮酸和鹽酸拓?fù)涮婵荡_是差異顯著、但變化倍數(shù)太小，而棉籽糖和異土木香內(nèi)酯滿足以上3個標(biāo)準(zhǔn)，白頭翁皂苷A和四氫小檗堿則不滿足任何一個標(biāo)準(zhǔn)(圖3，C)。所以，水蕨愈傷分化確實導(dǎo)致了代謝物的差異性積累。

2.5 水蕨愈傷代謝物的差異性積累

42個代謝物在2個樣本間有差異性積累，變化倍數(shù)大約在1.2～2.0之間。聚類分析中一個6BA樣品與MS樣品的距離較近、但并不混雜其中，這與兩類樣品的取材時間間隔較小相一致(圖4)。在MS樣本里有23個代謝物含量較高，其中前3個分別是桑黃素、哈爾堿鹽酸鹽以及鼠尾草酚，后3個分別是3-(3-甲氧基苯基)丙酸、美迪紫檀苷以及異土木香內(nèi)酯(圖4)。在6BA樣本里有19個代謝物含量較高，其中前3個是N-乙酰-DL-色氨酸、麥角甾醇以及4′-去甲基鬼臼毒素，后3個則是棉籽糖、羥異梔子苷以及L-亮氨酸。MS中含量較高的代謝物大致可以分為3簇，而6BA中含量較高的代謝物大致可以分為2簇。不過，這些簇別并不對應(yīng)于某類特殊結(jié)構(gòu)或者功能的代謝物。例如，棉籽糖、三七素、羥異梔子苷、4′-去甲基鬼臼毒素、紫菫定酚等構(gòu)成了A1簇，但它們分別是碳水化合物、氨基酸類似物、萜類、木質(zhì)素以及生物堿。一些藥物用途的代謝物顯示了差異積累，如A3簇的甘松新酮可抗抑郁，B1簇的高藜蘆酸和A2簇的醋丁洛爾可用于心血管疾病治療。氨基酸中只有亮氨酸顯示了差異性積累，其在6BA樣本中含量較高，并與野百合堿同屬A0簇。

紅-黑-綠顏色梯度表示相對含量；不同顏色的條帶表示代謝物分簇

富集分析表明，差異積累代謝物與兩條代謝途徑有關(guān)。其中，黃酮合成途徑的P值是0.0028，涉及到的代謝物是山奈酚和橙皮素，而它們都在分化期有更高含量。ABC通道蛋白(ATP-binding cassette transporters)途徑的P值是0.0080，涉及到的代謝物是棉籽糖和L-亮氨酸，而它們都在增殖期積累。

3 討 論

3.1 水蕨愈傷代謝物的種類和含量

我們在水蕨的愈傷中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百個代謝物，但是更好的檢測儀器、更大的搜索數(shù)據(jù)庫、以及分析更多的發(fā)育時期或者生理狀態(tài)一定會鑒定出其他的代謝物。并且，隨著功能注釋的完善，也一定會發(fā)現(xiàn)水蕨愈傷具有更多作用明確的代謝物。另外，水蕨的愈傷因含有多種可治療疾病的代謝物而引人注目。增殖期的愈傷與分化期的愈傷有著同樣種類的代謝物，這暗示二者間的轉(zhuǎn)變是一個量變而非質(zhì)變。正如我們后面看到的確實有些代謝物在數(shù)量上發(fā)生了顯著變化。盡管幾乎用了同樣的儀器、并且也測到了其他激素，卻沒有在水蕨的增殖或者分化的愈傷中發(fā)現(xiàn)生長素和激動素。這種情況在凹唇姜中幾乎相反[9]，可能的原因是水蕨的愈傷要消耗大量的生長素和激動素、以致于它們在組織中的濃度低到難以檢測。水蕨的愈傷組織里有多種已作為藥物的代謝物，而它們之中僅有一種喜樹堿也存在于棉花的愈傷中[6]。所以，植物愈傷胚胎發(fā)生的代謝組可能具有物種特異性。

多數(shù)代謝物在水蕨愈傷的增殖期和分化期具有相似的含量，所以它們與水蕨愈傷的這種轉(zhuǎn)變無關(guān)，而個別差異積累的代謝物可能對此負(fù)責(zé)。各代謝物含量的變化倍數(shù)可多達(dá)220；與此類似，類別、結(jié)構(gòu)、或者功能相似的代謝物并不具有大致相同的含量。水蕨愈傷不同于棉花愈傷，因為后者中酪氨酸的含量高于亮氨酸和谷氨酸[6]。

3.2 水蕨愈傷差異積累代謝物

水蕨愈傷從增殖期到分化期的轉(zhuǎn)變伴隨著較多代謝物的上調(diào)以及較少代謝物的下調(diào)，這一點與棉花相同[6]，這表明愈傷胚胎發(fā)生是一個日益復(fù)雜的過程。棉花的研究中差異積累的代謝物的比例大約是23.92%，并且差異倍數(shù)均在2倍以上[6]。相比而言，本研究的差異性積累代謝物的比例大約為10.44%，并且差異倍數(shù)均不超過2倍，這可能與我們的兩類樣本分歧時間較短有關(guān)。差異積累代謝物特別是其中的一些藥物如何影響水蕨愈傷從增殖到分化的轉(zhuǎn)變尚不得而知。黃酮合成途徑被預(yù)測在該轉(zhuǎn)變中發(fā)生了變化，因而可能對水蕨愈傷的胚胎發(fā)生不可缺少[6,21]。ABC通道蛋白是一個遍布于原核和真核生物的大家族，它們利用ATP水解的能量去主動轉(zhuǎn)運離子、糖、脂類、肽和藥物[22]。在植物中，ABC通道蛋白的突出功能是排出毒物和運輸生長素[23]。ABC通道蛋白途徑在水蕨愈傷組織增殖期活性突出，這與咖啡中愈傷相對于外植體有更多的ABC通道蛋白一致[24]，從而表明愈傷增殖期有獨特的生長素極性運輸機制[25]。