張舒琴，張海燕，于 淼，胡小妹，邢楊天，劉 倫

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，合肥 230036)

中國(guó)是世界上梨栽培面積最大的國(guó)家，2020年，中國(guó)梨栽培總面積達(dá)87.0萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量約1.61×107t，占世界總面積和總產(chǎn)量的67.3%和69.7%[1]。碭山境內(nèi)黃河故道地區(qū)是中國(guó)梨主產(chǎn)區(qū)之一，其主栽品種‘碭山酥梨’具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、耐粗放管理等優(yōu)點(diǎn)，但近年來(lái)由于缺鐵所導(dǎo)致的葉片黃化已儼然成為了制約當(dāng)?shù)乩娈a(chǎn)業(yè)發(fā)展的生理性病害之一。

鐵是植物體內(nèi)重要的微量元素，參與植物葉綠素的生物合成、氧化應(yīng)激保護(hù)和各種代謝途徑[2]。雖然土壤中鐵含量高，但由于土壤pH的影響，其生物活性量很低[3]，缺鐵易導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)受損，葉綠素合成受阻，葉綠素降解加劇，植株表現(xiàn)為幼葉黃化[4]。為應(yīng)對(duì)缺鐵脅迫所帶來(lái)的影響，植物形成了以雙子葉植物和非禾本科植物為代表的鐵還原策略Ⅰ和以禾本科植物為代表的鐵螯合策略Ⅱ兩種鐵吸收機(jī)制[5]，而梨的鐵吸收方式屬于鐵還原策略Ⅰ。其首先通過(guò)根系向根際分泌H+，從而酸化土壤，緊接著在鐵離子螯合還原酶FRO2(ferric-chelate reductase oxidase2)的作用下，F(xiàn)e3+被還原成易被植物體吸收利用的Fe2+形式，繼而通過(guò)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白IRT1(iron regulated transporter1)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[6]，供植物體生理、生化過(guò)程所需。

鐵代謝基因的表達(dá)受以bHLH(basic-helix-loop-helix)轉(zhuǎn)錄因子為主的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]。bHLH是廣泛分布于植物中的最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一，由堿性氨基酸區(qū)(N-末端)和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)(C-末端)所組成[8]，除參與調(diào)控逆境脅迫、花青素代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)外[9]，bHLH在提升植物抗缺鐵脅迫能力也具有重要意義[7]，涉及FIT(FER-like iron deficiency-induced transcription factor)、PYE(POPEYE)、BTS(BRUTUS)、URI(upstream regulator of IRT1)等途徑參與調(diào)控鐵的吸收代謝[10]。在擬南芥中，缺鐵脅迫可誘導(dǎo)bHLH Ⅲa類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子FIT的表達(dá)，并促使其結(jié)合于IRT1、FRO2啟動(dòng)子而提升其抗缺鐵能力[11]。除此之外，F(xiàn)IT對(duì)下游基因的結(jié)合活性受其互作蛋白基因AtbHLH38/39/100/101(bHLH Ⅰb類(lèi))的影響，其功能缺失三突變體在缺鐵條件下的擬南芥葉片嚴(yán)重萎黃，且外源鐵處理無(wú)法促進(jìn)其鐵的吸收，葉片持續(xù)黃化[12-13]。另一方面，bHLH Ⅳa類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH34/104/105/115也可于缺鐵條件下與bHLH Ⅰb類(lèi)基因啟動(dòng)子結(jié)合而促進(jìn)其表達(dá)，從而以FIT依賴(lài)性途徑調(diào)控鐵的吸收[14-16]。與此同時(shí)，bHLH Ⅳb類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AtbHLH121/URI也參與了擬南芥缺鐵脅迫響應(yīng)，其可通過(guò)磷酸化作用與bHLH Ⅳc互作或直接作為bHLH Ⅰb類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的上游而維持?jǐn)M南芥鐵穩(wěn)態(tài)平衡[17-18]。與之相反，AtbHLH47/PYE可通過(guò)與AtbHLH105互作以及其他作用方式而抑制其活性，抑制鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)和貯藏[19-20]，而AtbHLH11也可通過(guò)招募Fe代謝共抑制子TPR/TPL而起到抑制bHLH Ⅳc類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)bHLH Ⅳb類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控效應(yīng)[21]。BTS則可與AtbHLH105和bHLH115相互作用，并促進(jìn)其降解，從而負(fù)調(diào)控植株鐵吸收[22]。除擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子之外，大豆[23]、番茄[24]、蘋(píng)果[25]和楊樹(shù)[26]等物種的bHLH也在不同程度上響應(yīng)了缺鐵脅迫。因此，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在缺鐵脅迫過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的功能。

前期研究結(jié)果表明，缺鐵黃化復(fù)綠葉內(nèi)Fe2+顯著降低，而施用濃度為0.2% FeSO4可誘導(dǎo)黃化葉的復(fù)綠，并造成其葉內(nèi)Fe2+含量的顯著增加[27]，說(shuō)明該黃化葉復(fù)綠與其鐵代謝能力的增強(qiáng)相關(guān)。推測(cè)鐵代謝中心調(diào)控因子bHLH在此過(guò)程中起著重要作用。但目前為止，關(guān)于以PbrbHLH鐵代謝調(diào)控因子，在梨葉缺鐵黃化復(fù)綠中的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

為揭示PbrbHLH在梨葉缺鐵黃化復(fù)綠過(guò)程中的功能，本研究以‘碭山酥梨’正常植株與缺鐵黃化植株為試材，以外源0.2% FeSO4噴施黃化葉面，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，篩選并分析了梨葉內(nèi)和根中響應(yīng)缺鐵黃化葉復(fù)綠的PbrbHLH基因及其相對(duì)表達(dá)量，探究了PbrbHLH在地上部葉內(nèi)和地下部根系內(nèi)的調(diào)控模式；通過(guò)與各時(shí)期葉內(nèi)Fe2+含量[27]進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，篩選調(diào)控梨缺鐵黃化復(fù)綠的關(guān)鍵PbrbHLH基因，旨在為研究‘碭山酥梨’缺鐵黃化調(diào)控機(jī)制提供候選基因，并為培育抗缺鐵梨品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

試驗(yàn)以安徽省碭山縣園藝場(chǎng)15年生‘碭山酥梨’缺鐵黃化植株與正常植株為試驗(yàn)材料，在保證立地條件與栽培管理水平一致的情況下，于生長(zhǎng)期對(duì)缺鐵黃化植株全樹(shù)葉面噴施0.2% FeSO4(2 g/L FeSO4)溶液，每株樹(shù)施用量為10 L，對(duì)照組為噴施清水的正常植株和黃化植株，每3株樹(shù)為1個(gè)處理，每個(gè)處理包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，共計(jì)梨樹(shù)27棵。取清水處理的正常、黃化植株葉片及其地下部砧木(杜梨)的幼嫩根毛，并于FeSO4分別處理3、6、9和12 d收集黃化植株葉片，所有樣品經(jīng)液氮固定后，于-80 ℃保存待用。

1.2 方 法

1.2.1bHLH基因的篩選各葉樣RNA-seq分析數(shù)據(jù)由華大基因交互式報(bào)告平臺(tái)提供(https://report.bgi.com/ps/login/login.html)。梨PbrbHLH全基因家族及相關(guān)命名均參考Dong等[28]的研究。以P-value (N/C)≤0.02為標(biāo)準(zhǔn)[29]，初步篩選對(duì)照組正常植株葉片內(nèi)差異表達(dá)的PbrbHLH，再根據(jù)FeSO4處理黃化植株3、6、9和12 d的基因整體表達(dá)趨勢(shì)，進(jìn)一步篩選出候選PbrbHLH基因?；贜CBI梨基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/12793)，查詢(xún)并獲取‘碭山酥梨’的候選bHLH基因的全長(zhǎng)序列；同時(shí)基于GDR(https://www.rosaceae.org/species/pyrus/all)在線(xiàn)網(wǎng)站，獲取杜梨基因組數(shù)據(jù)，以Bioedit(Version 7.0.9)進(jìn)行Blast序列分析，獲取其內(nèi)的與該候選基因同源的基因序列，并以DNAMAN(version 9.0)進(jìn)行序列的兩兩比對(duì)，以此初步驗(yàn)證Blast比對(duì)結(jié)果，其基因命名據(jù)其相應(yīng)‘碭山酥梨’基因ID而定。

1.2.2 候選bHLH基因的生物信息學(xué)分析使用ExPaSy(http://www.expasy.org/ tools/)在線(xiàn)網(wǎng)站具對(duì)篩選得到的梨候選PbrbHLH基因編碼蛋白序列的氨基酸數(shù)、分子量、等電位點(diǎn)、脂肪族氨基酸數(shù)和蛋白質(zhì)疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。使用在線(xiàn)工具M(jìn)EME(http://meme-suite.org/)對(duì)梨候選PbrbHLH基因進(jìn)行motif基序分析，獲取文件，并以TBtools的Gene Struture View(Advanced)功能進(jìn)行可視化分析。于擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR(https://www.arabidopsis.org/)獲取該候選基因的同源序列，對(duì)篩選得到的兩物種bHLH基因所編碼的蛋白序列采用ClustalW 2.0進(jìn)行多重比對(duì)，以MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建(鄰接法)與可視化，其中自展值的初始值設(shè)置為1 000次，最后以PowerPoint 2016進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的美化。

1.2.3 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR按照天根植物多糖多酚RNA提取試劑盒操作方法提取‘碭山酥梨’葉片總RNA。采用PC54-TRUEscript RT kit(+gDNA Eraser)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(試劑盒均購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司)合成cDNA。使用Premier 5.0軟件對(duì)篩選出的梨候選bHLH基因設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)引物(表1)。試驗(yàn)于BIO-RAD T100 PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行，反應(yīng)總體系為：10 μL SYBR Green Master Mix，2 μL模板cDNA，上游引物和下游引物各加0.8 μL，6.4 μL DEPC，設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性90 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃再延伸10 min，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本含3次生物學(xué)重復(fù)。以梨GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，使用2-ΔΔCT法求得待測(cè)樣品的相對(duì)表達(dá)量[30]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理運(yùn)用Excel以單因素方差分析(ANOVA)法，并以Duncan多重極差法進(jìn)行各處理的平均值檢驗(yàn)，并運(yùn)用SPSS 23軟件(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)在0.05的水平(LSD)，分析各處理間顯著差異性。關(guān)聯(lián)性分析運(yùn)用雙變量分析的方法，于0.05水平對(duì)均值和標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

④待連接端面用專(zhuān)用電熱板加熱，加熱板溫度設(shè)定為210±10℃，待連接件的端面加熱時(shí)間為5 min，加熱壓力為1.73MPa。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨候選PbrbHLH基因的生物信息學(xué)分析

2.1.1 梨候選PbrbHLH基因的鑒定與其蛋白理化性質(zhì)分析以P-value(N/C)≤0.02為標(biāo)準(zhǔn)，于正常植株葉片和黃化植株葉內(nèi)共鑒定到64個(gè)差異表達(dá)PbrbHLH基因，進(jìn)一步分析FeSO4處理后3、6、9和12 d葉內(nèi)該基因的表達(dá)量，最終篩選得到21個(gè)呈現(xiàn)一定表達(dá)規(guī)律的PbrbHLH基因(圖1)。

N. 正常植株；C. 清水處理；下同

該21個(gè)候選基因所編碼的蛋白分子長(zhǎng)度不等(表2)，其氨基酸數(shù)在147(PbrbHLH155)～714(PbrbHLH78)之間，相對(duì)分子質(zhì)量差異較大，介于16 676.43(PbrbHLH155)～79 095.60(PbrbHLH78)Da之間，理論等電點(diǎn)范圍位于4.97(PbrbHLH7)～9.43(PbrbHLH119)內(nèi)。該21個(gè)PbrbHLH蛋白中13個(gè)蛋白成員呈酸性，其內(nèi)酸性氨基酸所占比重較大。而蛋白質(zhì)疏水性的分析結(jié)果表明，所有蛋白的疏水性平均值均為負(fù)值，表明其均為親水性蛋白。

表2 梨PbrbHLH轉(zhuǎn)錄因子的理化性質(zhì)

2.1.2 梨候選PbrbHLH基因motif與系統(tǒng)進(jìn)化分析以MEME在線(xiàn)軟件對(duì)鑒定、篩選得到的21個(gè)PbrbHLH基因進(jìn)行基序(motif)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)存在多種motif結(jié)構(gòu)，其中motif 1、motif 2(除PbrbHLH183外)廣泛分布于各個(gè)基因，表明其可能是梨PbrbHLH基因的保守基序。多數(shù)PbrbHLH基因內(nèi)含2～3個(gè)motif，而PbrbHLH104、PbrbHLH122兩基因內(nèi)motif數(shù)最為豐富，高達(dá)8個(gè)。除此之外，相鄰分支上的PbrbHLH轉(zhuǎn)錄因子基序組成大致相同(圖2)。

對(duì)以Bioedit分析所獲得的擬南芥基因組內(nèi)PbrbHLH同源序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，21個(gè)梨PbrbHLH基因共對(duì)應(yīng)了20個(gè)擬南芥AtbHLH基因，其中PbrbHLH104和PbrbHLH122的擬南芥同源序列均為AtbHLH137。參考Heim等[31]對(duì)擬南芥AtbHLH的分類(lèi)研究，發(fā)現(xiàn)該同源AtbHLHs基因涉及Ⅲ、Ⅳa、Ⅴ、Ⅶ、Ⅺ、Ⅻ這6大亞族。而就梨PbrbHLH基因而言，其主要分布位于Ⅲ亞族和Ⅻ亞族，分別擁有8個(gè)和5個(gè)PbrbHLHs，其次為Ⅳa和Ⅶ亞族，均含3個(gè)PbrbHLHs，而Ⅺ亞族內(nèi)，有且僅有PbrbHLH15。而擬南芥Ⅲ、Ⅳa亞族AtbHLH參與了缺鐵脅迫在內(nèi)的植物逆境脅迫的響應(yīng)[32]，說(shuō)明該亞族內(nèi)的PbrbHLHs在調(diào)控鐵代謝方面可能具有重要功能，如PbrbHLH41、PbrbHLH78、PbrbHLH119等。目前關(guān)于其他4個(gè)亞族bHLH與逆境脅迫(缺鐵等)的相關(guān)研究較少，但其在正常葉、黃化葉以及FeSO4所調(diào)控的缺鐵黃化葉復(fù)綠過(guò)程中的表達(dá)差異特性，也說(shuō)明了其在鐵代謝和葉綠素代謝方面可能具有一定的調(diào)控作用，且相關(guān)基因的具體功能有待進(jìn)一步研究。

2.2 梨候選PbrbHLH基因在梨葉缺鐵黃化復(fù)綠中的表達(dá)分析

為探究bHLH轉(zhuǎn)錄因子在梨葉黃化復(fù)綠中的表達(dá)模式，采用qRT-PCR分析了該21個(gè)梨候選PbrbHLH基因在清水處理正常葉片(N)和黃化葉片(C)，以及外源FeSO4處理后3、6、9和12 d時(shí)的表達(dá)。如圖4所示，C葉內(nèi)PbrbHLH7/29/41/104/119/122/128/135/155/183/191這11個(gè)基因表達(dá)量均顯著高于N葉，其中PbrbHLH41/104/122/155/183/191這6個(gè)基因均在FeSO4溶液處理后3～9 d內(nèi)較C葉顯著下調(diào),且除PbrbHLH41/183/191在處理后12 d的表達(dá)量與C葉無(wú)顯著差異外，其他3個(gè)基因的該時(shí)期表達(dá)量仍顯著低于C葉；與前者變化規(guī)律不同，PbrbHLH7/29/119/128這4個(gè)基因的表達(dá)量在處理后3和12 d與C葉均無(wú)顯著差異，但其在處理后6和9 d的表達(dá)量也較C葉顯著下降。而PbrbHLH135在FeSO4處理后的表達(dá)規(guī)律基本與PbrbHLH7/29/119/128這4個(gè)基因的表達(dá)規(guī)律相反。

不同小寫(xiě)字母表示同一基因不同處理間在P<0.05水平上的差異顯著性，下同

C葉內(nèi)PbrbHLH15/42/46/53/69/78/89/115/137/144這10個(gè)基因表達(dá)量則均顯著低于N葉，F(xiàn)eSO4溶液處理后3 d，PbrbHLH15/78/89/144表達(dá)量均較C葉顯著上調(diào)，而其他基因的該時(shí)期表達(dá)量與C葉無(wú)顯著差異；在處理后6 d，除PbrbHLH42外，其他9個(gè)基因的表達(dá)量均較C葉顯著增加，且達(dá)到峰值，并基本于該時(shí)期后，其表達(dá)量逐步降低，直至達(dá)到與C葉無(wú)顯著差異或顯著低于C葉的水平。

同時(shí)，為探究同一bHLH轉(zhuǎn)錄因子在梨地上部與地下部表達(dá)的協(xié)同/拮抗性，試驗(yàn)分析了杜梨(‘碭山酥梨’砧木)根系內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)特性。如圖5所示，黃化梨樹(shù)的砧木根內(nèi)PbbHLH29/41/53/89/119/128/135/155/183/191這10個(gè)基因相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常梨樹(shù)砧木根系，與葉內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)趨勢(shì)一樣；而黃化梨樹(shù)的砧木根內(nèi)PbbHLH53/89基因表達(dá)量則較正常梨樹(shù)砧木根系顯著降低，該基因變化趨勢(shì)也與其在梨葉內(nèi)的表達(dá)模式相一致。與上述結(jié)果不同，黃化梨樹(shù)和正常梨樹(shù)的砧木根中PbbHLH7/46/78/115/137/144基因表達(dá)量并無(wú)顯著差異。由此說(shuō)明缺鐵脅迫條件下的葉內(nèi)和根中bHLH的響應(yīng)可能存在一定差異，但多數(shù)梨bHLH基因在葉片和根系的表達(dá)調(diào)控中具有協(xié)同性。

圖5 正常與黃化梨樹(shù)根中PbrbHLH基因相對(duì)表達(dá)量

為進(jìn)一步探討PbrbHLHs與葉片復(fù)綠的關(guān)系，試驗(yàn)分析了正常葉、黃化葉以及FeSO4處理后各時(shí)期相關(guān)基因表達(dá)量與各葉樣內(nèi)Fe2+含量[27]的相關(guān)性。結(jié)果表明，在所篩選的21個(gè)梨PbrbHLHs基因中，有且僅有PbrbHLH41和PbrbHLH78與各葉樣內(nèi)Fe2+含量顯著相關(guān)，其中PbrbHLH78與各葉樣內(nèi)Fe2+含量呈顯著正相關(guān)，PbrbHLH41與各葉樣內(nèi)Fe2+含量呈顯著負(fù)相關(guān)(圖6)。因此，相較于其他19個(gè)PbrbHLHs基因而言，PbrbHLH41和PbrbHLH78在調(diào)控缺鐵黃化葉復(fù)綠過(guò)程中的作用可能更強(qiáng)。值得注意是，PbrbHLH41和PbrbHLH78同屬Ⅲ 亞族，但其調(diào)控模式卻截然相反，再次說(shuō)明了同一系統(tǒng)分支內(nèi)PbrbHLHs基因的功能多樣性，也表明PbrbHLHs可能以協(xié)同或拮抗的作用方式而參與調(diào)控同一生理作用。

*表示顯著相關(guān)

3 討 論

植物體內(nèi)鐵含量雖然很低，但其對(duì)于維持葉綠體結(jié)構(gòu)、促進(jìn)葉綠素合成，維持植株生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義[2]。研究表明，較強(qiáng)的鐵吸收能力可保證番茄在缺鐵脅迫條件下的鐵吸收和葉綠素的合成，從而避免其葉片黃化[33]，且可保證堿性土壤條件下小麥的葉綠素生物合成、光合作用和正常生長(zhǎng)[34]。因此，鐵吸收能力的增強(qiáng)可穩(wěn)定或增強(qiáng)葉綠素合成而避免或改善葉片失綠。所以外源FeSO4所調(diào)控的的缺鐵黃化葉復(fù)綠現(xiàn)象及其葉內(nèi)Fe2+含量的增加均反映出了其鐵吸收能力的增強(qiáng)。

梨樹(shù)鐵吸收依賴(lài)于HA、IRT1、FRO2等基因的表達(dá)[5]，而其和相關(guān)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)均受bHLH類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[9]。近年來(lái)，隨著基因組學(xué)研究的開(kāi)展，更多植物內(nèi)bHLHs基因被鑒定且被證實(shí)參與其缺鐵脅迫應(yīng)答[23-26]。雖然白梨基因組的測(cè)序早已完成[35]，但直至近年，才見(jiàn)其PbrbHLH全轉(zhuǎn)錄因子家族的報(bào)道[28]，并揭示了其與梨幼苗抗冷、抗旱、葉綠素降解及ROS積累相關(guān)，表明PbrbHLHs響應(yīng)梨非生物脅迫。本試驗(yàn)中，共64個(gè)PbrbHLHs于清水處理正常葉和黃化葉顯著差異表達(dá)，且21個(gè)PbrbHLHs與FeSO4所調(diào)控的黃化葉復(fù)綠相關(guān)，說(shuō)明該基因可能與擬南芥[36]、蘋(píng)果[25]、柚子[37]內(nèi)部分bHLHs一樣，參與調(diào)控鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)。除此之外，多數(shù)PbrbHLHs基因在根中的表達(dá)模式與葉內(nèi)表達(dá)模式相一致，說(shuō)明其在地上部和地下部的協(xié)同調(diào)控性。

另一方面，不同處理葉樣中Fe2+含量[27]與該葉樣內(nèi)PbrbHLHs表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果表明，PbrbHLH41和PbrbHLH78可能在調(diào)控‘碭山酥梨’缺鐵黃化葉內(nèi)Fe2+積累及其復(fù)綠過(guò)程中發(fā)揮重要作用。外源FeSO4處理上調(diào)了葉內(nèi)以PbrbHLH78為代表的鐵代謝正調(diào)控因子的表達(dá)，從而可能以促進(jìn)根系鐵的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)以及優(yōu)化葉內(nèi)Fe的分配和還原等方式，促進(jìn)葉內(nèi)Fe2+的積累；而同時(shí)該處理也降低了葉內(nèi)以PbrbHLH41為代表的鐵代謝負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)，繼而可能以解除其對(duì)于鐵代謝相關(guān)過(guò)程抑制作用的方式，參與調(diào)控葉內(nèi)Fe2+的積累，促進(jìn)葉片復(fù)綠。

而系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，PbrbHLH41和PbrbHLH78與擬南芥AtbHLH1和AtbHLH42均處于第Ⅲ亞族，其表達(dá)模式卻截然相反。迄今，關(guān)于AtbHLH1和AtbHLH42研究甚少，但不乏關(guān)于該亞族基因功能的研究。例如，AtbHLH6可激活A(yù)BA信號(hào)[38]，而ABA可促進(jìn)葉綠素降解而使葉片黃化[39]，推測(cè)AtbHLH6可能間接引起葉片黃化；而AtbHLH29則可維持缺鐵條件下的葉綠素穩(wěn)定，改善葉片黃化[40]。因此，同一亞族內(nèi)的基因可能存在拮抗性調(diào)控，與本文處于同一亞支的PbrbHLH41和PbrbHLH78相似。

綜上所述，本研究以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)合qRT-PCR，分析了PbrbHLHs基因在梨缺鐵黃化葉復(fù)綠過(guò)程中的表達(dá)，說(shuō)明了PbrbHLHs可能參與梨樹(shù)缺鐵黃化葉復(fù)綠，且通過(guò)不同葉樣內(nèi)Fe2+含量和相關(guān)基因表達(dá)量的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)PbrbHLH41、PbrbHLH78在梨缺鐵黃化葉復(fù)綠過(guò)程中起重要作用，且兩者作用模式可能相反。但是，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)解析PbrbHLHs在葉片缺鐵脅迫應(yīng)答和黃化葉復(fù)綠過(guò)程中的作用和途徑，并且對(duì)該脅迫條件下關(guān)鍵PbrbHLHs轉(zhuǎn)錄因子的特征分析，對(duì)于揭示PbrbHLHs在梨葉中的功能機(jī)制也至關(guān)重要。