周昕越，劉葉飛，邱 銳，韓慧杰，劉亞玲，趙 彥*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 草原與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)部飼草栽培、加工與高效利用重點實驗室/教育部草地資源重點實驗室/教育部創(chuàng)新團(tuán)隊——草地資源可持續(xù)利用的研究[IRT-17R59]，呼和浩特 010018；2 內(nèi)蒙古蒙草生態(tài)環(huán)境[集團(tuán)]股份有限公司，呼和浩特 010030)

黃花苜蓿(MedicagofalcataL.)是多年生苜蓿屬豆科牧草，適口性好[1]，營養(yǎng)價值非常高，具有很強(qiáng)的抗逆性[2]。在解決中國畜牧業(yè)面臨的蛋白質(zhì)飼料缺乏、改善天然草地和草原土壤肥力下降等問題中具有重要的地位和作用[3]。由于現(xiàn)有黃花苜蓿品種的再生性和抗病性較差，容易受到生物和非生物因素的脅迫，從而影響品質(zhì)和產(chǎn)量[4-6]。為了降低這些影響，植物進(jìn)化出一系列復(fù)雜的抵御外界脅迫的反應(yīng)機(jī)制，即通過轉(zhuǎn)錄因子整合外界信號和基因調(diào)控的方式產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白和代謝產(chǎn)物來適應(yīng)脅迫，從而提高植物的抗逆性[7]。

植物中的MYB家族十分龐大,尤其是R2R3-MYB亞家族[8-9]。MYB類蛋白的N端通常含有約51個氨基酸組成的高度保守的MYB結(jié)構(gòu)域，C端為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。MYB30轉(zhuǎn)錄因子屬于R2R3-MYB家族，R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子擁有一個N端保守的MYBDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個通常定位在C端的可變的激活或抑制區(qū)域[10]。MYB30轉(zhuǎn)錄因子最早被發(fā)現(xiàn)是在植物抵抗病原菌侵染的HR(Hypersensitive Response)反應(yīng)的最初階段[11]。研究顯示，MYB30轉(zhuǎn)錄因子參與了多種植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)過程，如參與植物次生生長、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及參與多種植物逆境防御反應(yīng)[12]，在信號通路中，MYB30轉(zhuǎn)錄因子通過與其他蛋白互作或是在蛋白水平上受到修飾，或是調(diào)節(jié)下游基因從而參與脅迫應(yīng)答[13]。還有研究表明，MYB30轉(zhuǎn)錄因子具有生物學(xué)功能的多效性，可在非生物逆境抗性及抗病性中具有生物學(xué)功能[14]。對模式植物擬南芥的研究表明，MYB30轉(zhuǎn)錄因子可以加快擬南芥的開花過程，從而將其病原菌脅迫相應(yīng)通路與開花調(diào)控過程聯(lián)系在一起[15]。桑樹MaMYB30基因可能參與桑樹對桑脈帶相關(guān)病毒的防御調(diào)控過程，證明該基因與植物抵御逆境脅迫關(guān)系密切[16]。MYB30還可以通過調(diào)控超長鏈脂肪酸(Very Long Chain Fatty Acid, VLCFA)的代謝參與低氧脅迫響應(yīng)[17]。由此可見，MYB30轉(zhuǎn)錄因子基因在介導(dǎo)植物抵御生物與非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用。

綜上，本研究以呼倫貝爾黃花苜蓿(MedicagofalcataL.cv. Hulunbuir)為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到黃花苜蓿MfMYB30基因，對該基因進(jìn)行生物信息學(xué)特征分析，利用熒光定量PCR技術(shù)分析MfMYB30在不同刈割天數(shù)后的相對表達(dá)，并在擬南芥原生質(zhì)體中進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，以期為黃花苜蓿抗逆與再生基因篩選及分子育種應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

本研究選取的植物材料為呼倫貝爾黃花苜蓿，挑選顆粒飽滿的黃花苜蓿種子，用砂紙打磨破除硬實，放在培養(yǎng)皿里培養(yǎng)至發(fā)芽，將發(fā)芽的種子播種于無菌培養(yǎng)土中并放至人工氣候室中培養(yǎng)，栽培期間為長日照條件(16 h光照/8 h黑暗)，晝/夜溫度為26 ℃/18 ℃，通風(fēng)良好，定期澆水。當(dāng)生長到開花期時，進(jìn)行刈割脅迫處理。

選取3株長勢較好并處于開花期的黃花苜蓿進(jìn)行模擬刈割處理，刈割留茬高度15 cm，分別處理3、5和7 d，各時間點選取葉片與莖組織于2 mL離心管，并選取一株未進(jìn)行刈割處理的植株作為對照，同時取樣，液氮速凍，-80 ℃條件保存?zhèn)溆茫飳W(xué)重復(fù)3次。

1.2 方 法

1.2.1 RNA的提取與cDNA的合成取-80 ℃保存?zhèn)溆玫狞S花苜蓿樣品按照TransZoL. Up Plus RNA kit試劑盒(北京全式金基因科技有限公司)參考說明書提取總RNA。利用紫外分光光度計測定RNA含量，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗，將質(zhì)量合格的RNA在-80 ℃條件保存?zhèn)溆?。以測定后的高質(zhì)量總RNA為模板，使用TransScriptⅡOne-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金基因科技有限公司)試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，-20 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2MfMYB30基因的克隆根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選的差異表達(dá)候選基因，獲取MfMYB30基因全長序列，用Oligo7.0軟件設(shè)計擴(kuò)增引物(表1)，以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包含cDNA模板2 μL，高保真酶PrimeSTAR 25 μL，上、下游引物各2.5 μL，ddH2O補(bǔ)至50 μL。擴(kuò)增程序為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min，16 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后膠回收，然后將其連接到克隆載體1300-cYFP上，采用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽性單菌落，經(jīng)過菌落以及菌液PCR檢測后送往廣州睿博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

表1 所用引物信息

1.2.3 生物信息學(xué)分析對克隆得到的MfMYB30基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，運(yùn)用NCBI中的BLAST (https://bL.ast.ncbi.nL.m.nih.gov/BL.ast.cgi)功能進(jìn)行序列比對；利用NCBI中的Open Reading Frame Finder(https://www.ncbi.nL.m.nih.gov/orffinder/)工具，找到cDNA序列中的最大開放閱讀框；利用SMART(http://smart.embL.-heideL.berg.de/)在線工具分析保守結(jié)構(gòu)域；利用ExpasyProtParam tooL.(https://web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；利用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pL.?page=npsa_sopma.htmL.)和SWISS-MODEL.(https://swissmodeL..expasy.org/interactive)在線軟件分別預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu)。利用SignaL.P-5.0(https://services.heaL.thtech.dtu.dk/service.php?SignaL.P-5.0)預(yù)測蛋白質(zhì)信號肽；TMHMM-2.0(https://services.heaL.thtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)分析蛋白跨膜結(jié)構(gòu)；利用Plant CARE在線軟件(https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtooL.s/pL.antcare/htmL./)分析預(yù)測順式作用元件。利用MEGA7.0軟件、ITOL在線軟件及鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)(bootstrap=1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其與其他物種之間的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4MfMYB30基因的表達(dá)分析根據(jù)克隆得到的MfMYB30基因序列，采用實時熒光定量PCR方法，設(shè)計qRT-PCR引物(表1)，以黃花苜蓿Actin基因作為內(nèi)參基因，檢測黃花苜蓿分別在模擬刈割脅迫處理3、5和7 d后的表達(dá)情況。試驗進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)結(jié)束后對結(jié)果進(jìn)行分析。使用Excel按照2-ΔΔCT方法進(jìn)行計算,樣品間的差異性用SPSS 25.0進(jìn)行檢驗。

1.2.5 MfMYB30亞細(xì)胞位置的預(yù)測及定位利用在線軟件WoLFPSORTPrediction對MfMYB30蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析。采用酶切連接法構(gòu)建以PUC19為骨架的pUC19-HA-MfMYB30-GFP瞬時表達(dá)載體。以空載體GFP作為對照，將構(gòu)建好的載體pUC19-HA-MfMYB30-GFP及核定位信號(nucle-us localization signal,NLS)RFP融合紅色熒光蛋白的載體共同轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，利用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號，進(jìn)行MfMYB30亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 MfMYB30基因的克隆

以呼倫貝爾黃花苜蓿總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到大小為1 000 bp左右的片段，所得片段大小與預(yù)期理論值一致。對片段進(jìn)行回收純化、載體連接及轉(zhuǎn)化，最后將陽性菌液送至廣州睿博生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示片段長1 060 bp(圖1)。進(jìn)一步分析表明該序列開放閱讀框(ORF)957 bp，編碼318個氨基酸(圖2)，并將其命名為MfMYB30。

M. DL5000;1.MfMYB30

圖2 MfMYB30基因的完整開放閱讀框及推測氨基酸序列

2.2 黃花苜蓿MfMYB30蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

利用Expasy-ProtParam tool對MfMYB30基因的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，分子量為86.85 kD，理論等電點為5.11，分子式為C3257H5456N1060O1363S174，氨基酸組成為Ala(33.9%)、Cys(16.4%)、Gly(21.2%)、Thr(28.5%)，脂肪系數(shù)為33.87，不穩(wěn)定系數(shù)為44.43，該蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用Protscale預(yù)測MfMYB30基因編碼蛋白的親疏水性，結(jié)果顯示，最大親水分值為-0.633，最大疏水分值為2.033，總平均親水指數(shù)(grand average of hydropathicity, GRAVY)為0.736，為疏水性蛋白。利用SMART分析MfMYB30蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，有2個SANT保守結(jié)構(gòu)(分別位于13～63 bp和66～114 bp)和1個低復(fù)雜性結(jié)構(gòu)域(Low-complexity domain, LCD)，均具有與MYB家族相似的結(jié)構(gòu)(圖3)。MfMYB30 蛋白的信號肽以及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析表明，MfMYB30蛋白無信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。

A.MfMYB30蛋白的保守域分析; B.MfMYB30蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu):藍(lán)色.α螺旋;紅色.延伸鏈;紫色.無規(guī)則卷曲;綠色.β轉(zhuǎn)角

通過 SPOMA 在線工具分析二級結(jié)構(gòu)，預(yù)測表明MfMYB30含有33.02%的α-螺旋，5.66%的延伸鏈，59.75%的不規(guī)則卷曲。α-螺旋對于黃花苜蓿MfMYB30蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來說具有一定穩(wěn)定性，無規(guī)則卷曲在功能上充當(dāng)酶和蛋白質(zhì)的活性中心(圖4)。

Mf.黃花苜蓿；Mt.蒺藜苜蓿；Cc.木豆；Gs.野大豆；Mp.刺毛黛豆；Ss.密花豆；Va.赤豆；Vr.綠豆；Vu.豇豆

2.3 MfMYB30基因的元件分析

利用Plant CARE在線軟件分析表明(表2)，在MfMYB30基因上游啟動子區(qū)含有基本元件TATA-box和CAAT-box，光響應(yīng)順式作用元件 G-box、Box-4、LAMP-element和MRE，與抗病、再生相關(guān)的響應(yīng)元件P-box、TCA-element和ARE，此外，還有與轉(zhuǎn)錄因子MYB結(jié)合位點有關(guān)順式作用元件Box Ⅲ、MYB和MYB-like sequence。

表2 MfMYB30基因啟動子序列順式作用元件

2.4 MfMYB30編碼氨基酸序列比對與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將MfMYB30氨基酸序列提交至NCBI在線BLASTn檢索，利用DNAMAN軟件對綠豆、豇豆、野大豆等8種豆科植物的MYB30蛋白進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果表明，MfMYB30編碼的氨基酸序列與不同豆科植物MYB30氨基酸序列表現(xiàn)出高度相似性，大約在65%～99%之間，其中與同科植物蒺藜苜蓿MtMYB(Medicagotruncatula, XP_003618488.1)的氨基酸序列相似性最高，相似度達(dá)到了99%(圖5)。

為了更好地了解MfMYB30蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將大豆(14個)、蒺藜苜蓿(5個)、紫花苜蓿(3個)、擬南芥(5個)和木豆(2個)MYB蛋白，用MEGA7.0軟件與ITOL軟件對30個MYB蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)，根據(jù)進(jìn)化樹分支, 將30 個MYB 轉(zhuǎn)錄因子劃分為6類, 其中黃花苜蓿MfMYB30蛋白與紫花苜蓿MsMYB4、擬南芥AtMYB30、木豆CcMYB30、蒺藜苜蓿MtMYB30和大豆GmMYB60聚為一類，表明氨基酸序列差異較小，親緣關(guān)系較近，具有較高的相似性, 在功能上可能也具有相似性。

Mf.黃花苜蓿；Mt.蒺藜苜蓿；Ms.紫花苜蓿；Cc.木豆；Gm.大豆；At.擬南芥

2.5 黃花苜蓿MfMYB30基因的表達(dá)分析

為初步分析MfMYB30基因的功能，采用實時熒光定量PCR方法，以刈割脅迫不同天數(shù)后的黃花苜蓿葉片與莖組織的cDNA為模板，并以黃花苜蓿Actin基因作為內(nèi)參基因，檢測黃花苜蓿刈割(模擬放牧)不同天數(shù)MfMYB30基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明：在模擬刈割脅迫不同天數(shù)處理下，MfMYB30基因相對表達(dá)量呈現(xiàn)“降-升-升”的變化趨勢，在刈割7 d后達(dá)到峰值(圖6)。說明刈割(模擬放牧)處理對MfMYB30的表達(dá)有影響，黃花苜蓿面對非生物脅迫(刈割或放牧)時MfMYB30可能具有一定的調(diào)節(jié)功能。

星號分別表示處理與對照之間基因表達(dá)水平存在顯著性差異(*. 0.01

2.6 黃花苜蓿MfMYB30蛋白的亞細(xì)胞定位

通過WolF PSORT Protein Subcellular localization Prediction在線工具對MfMYB30蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，分析該蛋白位于細(xì)胞的細(xì)胞核中。為進(jìn)一步驗證MfMYB30蛋白的作用機(jī)制，我們構(gòu)建了以pUC19為骨架的pUC19-HA-MfMYB30-GFP瞬時表達(dá)載體,通過擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，利用激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，單獨(dú)的GFP熒光呈現(xiàn)彌散的狀態(tài)，而轉(zhuǎn)入MfMYB30-GFP融合蛋白后，熒光聚集在細(xì)胞核中，進(jìn)一步證實MfMYB30蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中(圖7)。

圖7 MfMYB30蛋白的亞細(xì)胞定位

3 討 論

MYB類是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育和抗逆過程中起著重要作用。其中，R2R3-MYB亞家族是植物中發(fā)現(xiàn)的最豐富的MYB家族，在植物特有的信號通路中，初生和次生代謝、細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)育和對生物脅迫和非生物脅迫的響應(yīng)等發(fā)揮著重要作用[18]。

本研究根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)基礎(chǔ)篩選差異表達(dá)基因，克隆得到黃花苜蓿一個MYB(MfMYB30)基因。結(jié)構(gòu)分析表明，MfMYB30編碼的蛋白由318個氨基酸組成，N端具有2個SANT 結(jié)構(gòu)，2個結(jié)構(gòu)域分別由51和49個氨基酸組成，屬于典型的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征。通過分析其編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)MfMYB30蛋白與蒺藜苜蓿MtMYB30蛋白具有很高的相似性，在系統(tǒng)進(jìn)化上，該蛋白與蒺藜苜蓿MtMYB30親緣關(guān)系較近，并且與處于進(jìn)化樹同一分枝的其他植物的同源蛋白具有相同的保守結(jié)構(gòu)域，說明MfMYB30在進(jìn)化過程中具有功能上的高度保守性。亞細(xì)胞定位結(jié)果分析表明, MfMYB30蛋白定位在細(xì)胞核。

刈割是牧草的主要利用方式之一，科學(xué)合理的刈割制度是確保牧草生產(chǎn)力和品質(zhì)，保證草地畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的重要前提[3,19]，當(dāng)植物受到刈割脅迫后，容易受到病原菌的感染，植物受病原菌侵染后，誘導(dǎo)表達(dá)的抗病蛋白能夠直接與病原體的侵染結(jié)構(gòu)接觸，抑制、干擾病菌的生長進(jìn)程，激發(fā)植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性，發(fā)揮廣譜抗病作用[20-21]。前人研究表明，MYB30轉(zhuǎn)錄因子是通過調(diào)控乙酰輔酶A(acyL-CoA)延伸酶復(fù)合體基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控超長鏈脂肪酸(Very-Long-Chain Fatty Acid,VLCFA)合成基因的表達(dá)以及HR反應(yīng)，包括 KCS、FDH、KCR、ECR、PAS2/HCD、CER2、CER3 和 LTPG1[22]。而MYB30同時也能調(diào)控抗病相關(guān)激素水楊酸(SA)的合成[23]。在BR(Brassinosteroids)信號通路中，MYB30和BES1(BriL.-Ems-Suppressor 1)相互作用，共同調(diào)控了BR響應(yīng)基因的表達(dá)，從而影響模式植物擬南芥下胚軸的伸長[24]。脫落酸(ABA)是被認(rèn)為是非生物和生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控因子，MYB30是ABA信號通路的正調(diào)節(jié)物，它能被SUMO E3連接酶SIZ1所SUMO化，這對MYB30在ABA信號通路中的作用非常重要，MYB30可以調(diào)控脫落酸信號下的根細(xì)胞伸長[25-26]。還有研究表明，MYB30能調(diào)控擬南芥蠟粉的合成，表皮蠟粉在植物抵御病蟲害和降低紫外線福射等方面起著重要作用[27-29]。通過上述分析，黃花苜蓿MfMYB30基因可能在響應(yīng)刈割脅迫反應(yīng)起作用，提高植物的抗逆性，進(jìn)而促進(jìn)植物的再生。

實時熒光定量PCR是一種快速準(zhǔn)確的核酸定量分析技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、速度快等優(yōu)點。本研究RT-PCR的結(jié)果進(jìn)一步表明了MfMYB30很有可能參與黃花苜蓿中刈割脅迫調(diào)控，在刈割3、5和7 d處理下，MfMYB30在5 d和7 d后的表達(dá)均有明顯上調(diào)。由此推測在刈割脅迫條件下MfMYB30可能起正調(diào)控作用。

由于在生命活動中真正起作用的是基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)的功能與其在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位密切相關(guān)，蛋白質(zhì)位于細(xì)胞的不同部位所行使的功能也不同，因此對蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位是研究其功能必不可少的環(huán)節(jié)之一[30]。為了進(jìn)一步探究MfMYB30的作用機(jī)制，確定黃花苜蓿MfMYB30蛋白在細(xì)胞中的存在位置，本實驗構(gòu)建了pUC19-HA-MfMYB30-GFP瞬時表達(dá)載體，并通過擬南芥原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)進(jìn)行分析，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果表明，MfMYB30定位于細(xì)胞核中，是一個核蛋白。

綜上所述，本研究從黃花苜蓿轉(zhuǎn)錄組中篩選和克隆獲得1個表達(dá)顯著上調(diào)的MfMYB30基因，并通過生物信息學(xué)方法和RT-qPCR分析對其生物學(xué)特性與功能進(jìn)行研究，以期為闡明黃花苜蓿MfMYB30基因在響應(yīng)刈割(或放牧)脅迫的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。同時通過RNA-Seq測序和數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，在獲得的黃花苜蓿轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中除MYB轉(zhuǎn)錄因子外還存在其他差異表達(dá)基因，挖掘和解析這些重要基因的功能有助于進(jìn)一步提高黃花苜蓿的抗逆性，也為利用分子生物學(xué)手段培育抗逆性強(qiáng)的黃花苜蓿品種奠定基礎(chǔ)。