饒席兵，錢禛鋒，張蓉瓊，何麗蓮,3，李富生,3*

(1 云南省作物生產(chǎn)與智慧農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；2 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 甘蔗研究所，昆明 650201)

甘蔗(SaccharumofficinarumL.)貢獻(xiàn)了全球糖產(chǎn)量的80%，是一種重要的糖料作物[1]。甘蔗喜大水大肥，同時，其缺乏耐寒、抗旱等特性，加之中國的地形和氣候條件難以滿足甘蔗生長發(fā)育對水分、溫度和光照的需要，從而導(dǎo)致中國蔗區(qū)主要分布在廣西、云南、廣東等南方省市。因此，培育抗逆性強(qiáng)的甘蔗品種，擴(kuò)大甘蔗種植區(qū)域，成為現(xiàn)階段甘蔗育種的主要方向。由于甘蔗栽培種不易開花，且與近緣物種的花期難遇，通過傳統(tǒng)的有性雜交方法難以實(shí)現(xiàn)品種性狀的定向改良，這些因素導(dǎo)致了甘蔗的育種工作進(jìn)展十分緩慢[2]。蔗茅(Erianthusfulvus)是甘蔗的近緣野生種，在中國境內(nèi)分布廣泛，具有較好的抗旱、耐寒、耐貧瘠、成熟早、高錘度等很多甘蔗栽培種不具備的優(yōu)良特性，是改良甘蔗遺傳性狀十分重要的種質(zhì)資源材料[3-4]。

基因轉(zhuǎn)錄有正調(diào)控和負(fù)調(diào)控之分，轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)是起正調(diào)控作用的反式作用因子。相關(guān)研究表明，轉(zhuǎn)錄因子通過特異性結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)域的順式作用元件從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，使植物代謝和生理性狀方面發(fā)生特異改變以應(yīng)對逆境脅迫[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)主要參與調(diào)控植物逆境應(yīng)答反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族有WRKY、NAC、ZFPs、MYB、和AP2/ERF等[7]。其中，MYB家族轉(zhuǎn)錄因子是數(shù)量較多，最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，在調(diào)節(jié)植物次生代謝，參與信號傳導(dǎo)、生物與非生物脅迫應(yīng)答以及激素反應(yīng)等過程中扮演著十分重要的角色[8-11]。

研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)MYB轉(zhuǎn)錄因子超過198個[12]、水稻(OryzasativaL.)超過183個[13]。首個MYB轉(zhuǎn)錄因子于1982年在禽成髓細(xì)胞瘤病毒(AMV)中發(fā)現(xiàn)，并命名為v-MYB[14]。植物中第一個被發(fā)現(xiàn)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因是從玉米(ZeamaysL.)中克隆出來的ZmMYBCI，并發(fā)現(xiàn)該基因在花青素合成過程中起調(diào)控作用[15]。隨著組學(xué)、測序、轉(zhuǎn)基因和基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，許多物種中的MYB家族轉(zhuǎn)錄因子已被鑒定，MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能及其相關(guān)調(diào)控機(jī)理也逐漸被解析[16]。

低溫是限制植物生長、產(chǎn)量和分布的主要環(huán)境因子之一，MYB轉(zhuǎn)錄因子因其調(diào)控低溫應(yīng)答關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子CBFs表達(dá)，進(jìn)而激活眾多下游冷應(yīng)答基因CORs表達(dá)，被認(rèn)為在植物冷脅迫應(yīng)答反應(yīng)中扮演著重要的角色[17]。在擬南芥[18]、大豆(Glycinemax)[19]、番茄(Solanumlycopersicum)[20]、水稻[21]、玉米[22]等植物中，眾多MYB基因能被低溫脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)，進(jìn)一步參與植物低溫應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。然而，在甘蔗及其野生近緣種內(nèi)，相關(guān)的研究一直鮮有報道。本研究通過結(jié)合蔗茅低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用RT-PCR等技術(shù)從蔗茅中克隆到EfMYB1基因，并對該基因與編碼蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及不同脅迫處理的基因表達(dá)差異分析，為豐富甘蔗育種候選基因庫和轉(zhuǎn)基因甘蔗育種提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

本研究涉及的試驗(yàn)材料均來源于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所野生資源圃。用于低溫脅迫處理的材料為蔗茅99-1無性系，于溫室大棚內(nèi)種植于花盆，對照組CK(0 h)于溫室大棚中正常生長，處理組(24 和72 h)待生長至5葉期時轉(zhuǎn)移至光量子通量密度為300 μmol·m-2· s-1，光周期為12 h/d，相對濕度為60%～70%，于低溫(4 ℃)光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行低溫脅迫處理。用于脫落酸(ABA)和茉莉酸甲酯(MeJA)脅迫處理的材料為蔗茅99-1無菌組培苗，處理組(6和12 h)用濃度為100 μmol/L ABA和MeJA溶液噴施整株，對照組CK(0 h)則噴施無菌水，于28 ℃、光強(qiáng)1 500～2 000 Lx、光周期12 h/d的條件下培養(yǎng)。以上處理均3次重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成在脅迫處理各時間點(diǎn)，分別取低溫脅迫處理的根(新生白根)、莖(中上段)、葉(+1葉)，ABA和MeJA脅迫處理的葉組織，置于液氮取回-80℃冰箱中保存。利用Tigen TrizolRNA提取試劑盒(天根，昆明)進(jìn)行總RNA提取，提取的RNA于超凈工作臺下吹晾3 min，加入40 μL RNase-Free ddH2O進(jìn)行溶解混勻。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA，并用紫外分光光度儀進(jìn)一步確定濃度。利用Fast Quant RT Super Mix快速反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根，昆明)將質(zhì)量較好的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈備用。

1.2.2EfMYB1基因的引物設(shè)計(jì)與克隆利用 Primer 6.0 軟件，根據(jù)EfMYB1基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(表1)。使用PrimeSTAR?GXL Premix酶(寶生物，昆明)，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：酶25 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，DEPC處理水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，30個循環(huán)。PCR擴(kuò)增程序結(jié)束后取5 μL PCR反應(yīng)物進(jìn)行1%凝膠瓊脂糖電泳檢測，利用膠回收試劑盒(天根，昆明)進(jìn)行目的片段回收純化，用pLB vector試劑盒(天根，昆明)連接至克隆載體。轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)后于LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌落鑒定與測序分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.3EfMYB1基因的生物信息學(xué)分析使用ORF find、Conserved Domain Search在線網(wǎng)站預(yù)測EfMYB1基因的開放閱讀框(ORF)和保守結(jié)構(gòu)域(CDD)。用 DNAMAN 6.0 軟件推導(dǎo)EfMYB1基因的氨基酸序列。利用SignaIP-3.0、TMHMM Server V2.0、Nephrons 2.0 Server分別預(yù)測編碼蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及磷酸化位點(diǎn)。蛋白二級結(jié)構(gòu)用CFSSP在線軟件分析，三維結(jié)構(gòu)建模用 SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測。用MEGA7.0 進(jìn)行EfMYB1蛋白多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。

1.2.4EfMYB1基因?qū)崟r熒光定量表達(dá)分析使用 Primer 6 軟件根據(jù)EfMYB1基因開放閱讀框設(shè)計(jì)熒光定量引物MYB-F2、MYB-R2，選用肌動蛋白基因β-actin25S-F、β-actin25S-R作為內(nèi)參基因引物(表1)。以低溫、ABA和MeJA脅迫處理反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板，使用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) SuperReal 熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版試劑盒(天根，昆明)，在ABI7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)體系為：2×Real Star Green Fast Mixture with ROX 25 μL,正反向引物各1 μL，模板1 μL，DEPC處理水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA提取與EfMYB1基因克隆分析

利用凝膠成像系統(tǒng)觀察到提取出的RNA條帶清晰可見，沒有發(fā)生降解(圖1，A～D)。紫外分光光度計(jì)測得大多數(shù)RNA的OD260/280在1.8～2.0之間，表明RNA提取純度較高，幾乎沒有污染，可用于反轉(zhuǎn)錄后續(xù)試驗(yàn)所需的cDNA。PCR擴(kuò)增反應(yīng)物經(jīng)電泳檢測，發(fā)現(xiàn)大約在900 bp處有一條清晰的條帶(圖1，E)，經(jīng)北京擎科生物公司測序得到1條長度為1 000 bp大小的序列，表明該基因已成功克隆。

M. DL2000; A(葉片)、B(根): 1～3. CK; 4～6. 24 h冷脅迫; 7～9. 72 h冷脅迫; C. 莖:1～4. CK; 5～8. 24 h冷脅迫; 9～12. 72 h冷脅迫; D.葉片:1～3. CK; 4～6. 6 h ABA脅迫; 7～9. 12 h ABA脅迫; 10～12. 6 h MeJA脅迫; 13～15.12 h MeJA脅迫; E. EfMYB1(1～2)

2.2 EfMYB1基因編碼蛋白生物信息學(xué)分析

將測序得到正確的EfMYB1基因序列在NCBI上進(jìn)行開發(fā)閱讀框ORF預(yù)測，獲得一個全長759 bp的ORF，編碼251個氨基酸(圖2，A)。EfMYB1蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該蛋白具有一個較典型的SANT結(jié)構(gòu)域，位于氨基酸序列的第18～70位。(圖2，B)EfMYB1蛋白親/疏水性分析發(fā)現(xiàn)，得分在0以下的區(qū)域占絕大部分，且親水性平均值為-0.73，說明該蛋白質(zhì)屬于親水性蛋白。EfMYB1蛋白二級結(jié)構(gòu)由51.59%無規(guī)卷曲、34.52%α螺旋和13.89%β折疊構(gòu)成(圖3，B)，三級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主(圖3，A)，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。蛋白質(zhì)信號肽檢測結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)無信號肽，屬于非分泌蛋白(圖3，C)。蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)不具備跨膜結(jié)構(gòu)，屬于膜外蛋白(圖4，A)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，ErMYB1多肽鏈中含有多個絲氨酸(Ser)和蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)(>0.5)(圖4，B)，推測蛋白激酶易與該蛋白質(zhì)作用。

A. 核酸及氨基酸序列; B. 保守結(jié)構(gòu)域

A. 二級結(jié)構(gòu)；B. 三維建模；C. 信號肽預(yù)測[Signal 0.5預(yù)測(真核)序列]

A. 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測; B. 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

2.3 EfMYB1同源蛋白比對及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

為進(jìn)一步了解該蛋白的功能和進(jìn)化特征，通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫搜索到與蔗茅EfMYB1蛋白序列相似的同源蛋白分別來自南荻(Miscanthuslutarioriparius)94.86%、高粱(Sorghumbicolor)92.22%、玉米(Zeamays)81.47%、寡花菊(Dichantheliumoligosanthes)79.91%、谷子(Setariaitalica)78.60%、黍(Panicummiliaceum)78.29%、疣粒稻(Oryzameyerianavar.granulata)62.45%、大麥(Hordeumvulgaresubsp.vulgare)56.28%、節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)55.4%。多序列比對結(jié)果表明，蔗茅EfMYB蛋白與節(jié)節(jié)麥MYB蛋白的相似性最低，而與南荻MYB蛋白、高粱MYB蛋白的相似性最高(圖5)。進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，蔗茅EfMYB與南荻MYB親緣關(guān)系最近(圖6)。

圖5 EfMYB1與其他物種蛋白序列比對結(jié)果

圖6 不同植物MYB蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 EfMYB1基因不同脅迫下的表達(dá)分析

分別以低溫、ABA、MeJA脅迫處理的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析，進(jìn)一步分析EfMYB1基因在不同脅迫條件下的表達(dá)。結(jié)果(圖7，A)顯示，低溫脅迫不同時間，EfMYB1基因在根、莖、葉組織中的表達(dá)量不同。在根和葉組織中，EfMYB1基因的表達(dá)量隨低溫脅迫時間的持續(xù)逐漸上調(diào)；在莖組織中，低溫脅迫對EfMYB1基因的表達(dá)幾乎沒有影響。這說明該基因可能在蔗茅根和葉中發(fā)揮作用，進(jìn)而參與蔗茅冷脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

ABA與MeJA脅迫不同時間，EfMYB1基因的相對表達(dá)量也存在差異(圖7，B)。MeJA脅迫下，EfMYB1基因的相對表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，在處理6 h時達(dá)到最大值，且極顯著高于0 h。而脫落酸脅迫下該基因的表達(dá)水平極顯著低于0 h，表明蔗茅中該基因功能可能不依賴于脫落酸誘導(dǎo)。

A.低溫脅迫; B. ABA和MeJA脅迫；*和**分別表示同一組織(脅迫)不同處理時間基因表達(dá)差異達(dá)顯著 (P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)

3 討 論

經(jīng)過漫長的自然選擇與進(jìn)化，植物形成了其特有的調(diào)控機(jī)制，來適應(yīng)環(huán)境中的種種危害。如通過一些抗逆基因發(fā)揮功能來調(diào)控植物生長發(fā)育的各個生理過程，而調(diào)控過程需要一些相關(guān)酶和調(diào)節(jié)蛋白的參與，MYB轉(zhuǎn)錄因子就屬于這種調(diào)節(jié)蛋白。MYB蛋白的活性與其磷酸化方式有關(guān)。相關(guān)研究表明，通過激酶對C端磷酸化可激活煙草NtMYB2基因的轉(zhuǎn)錄活性[23]。擬南芥ACC1蛋白經(jīng)酪蛋白激酶2磷酸化后，可以提高與靶基因啟動子基因結(jié)合的能力[24]。本研究中克隆到的EfMYB1基因經(jīng)生物信息學(xué)分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該蛋白有多個磷酸化位點(diǎn)，因此，推測該MYB蛋白活性也可能和蛋白質(zhì)磷酸化有關(guān)。

根據(jù)R結(jié)構(gòu)個數(shù)不同，可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、R1R2R3-MYB和4R-MYB四個亞類。本研究得到的EfMYB1蛋白包含1個該家族典型的SANT結(jié)構(gòu)域，推測屬于1R-MYB。相關(guān)研究表明，1R-MYB具有維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄過程等作用[25]，故推測蔗茅EfMYB1基因也有類似功能。對編碼蛋白親疏水性預(yù)測時，發(fā)現(xiàn)得分?jǐn)?shù)小于0的區(qū)域密集度明顯較高，結(jié)合親水性平均值分析，表明該蛋白質(zhì)是一種親水性蛋白。進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測時，沒有發(fā)現(xiàn)該編碼蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，信號肽檢測結(jié)果顯示，該基因編碼蛋白沒有信號肽，說明蛋白的穩(wěn)定性比較高，不易被降解。為進(jìn)一步了解該EfMYB1蛋白的功能和進(jìn)化特征，進(jìn)行了蛋白多序列比對。結(jié)果表明蔗茅MYB蛋白與南荻MYB蛋白相似性最高，遺傳距離最近，表明該基因的功能可能與南荻中的同源基因功能相似。

Dong等[26]發(fā)現(xiàn)薔薇RmMYB108基因能被低溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在擬南芥中過表達(dá)該基因顯著提高了轉(zhuǎn)基因植物的耐寒性；持續(xù)低溫環(huán)境下，與野生型株系相比，轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)更高的存活率和生長速率及更優(yōu)的種子數(shù)量。Li等[27]發(fā)現(xiàn)玉米ZmMYB31基因的表達(dá)也受低溫脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)該基因能影響低溫響應(yīng)基因的表達(dá)水平、轉(zhuǎn)基因株系的活性氧含量及光合強(qiáng)度等，從而賦予植物更強(qiáng)的低溫耐性。本研究在熒光定量表達(dá)分析時發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫可以誘導(dǎo)EfMYB1基因在蔗茅根和葉組織中表達(dá)，且表達(dá)水平隨低溫脅迫時間的持續(xù)逐漸上調(diào)，故推測該基因?qū)儆诘蜏孛{迫誘導(dǎo)型表達(dá)基因，主要在蔗茅根組織和葉組織中行使功能，從而賦予蔗茅較強(qiáng)的耐寒性。

劉佳欣等[28]研究了不同激素處理對MYB基因表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)ABA脅迫能誘導(dǎo)白樺MYB基因表達(dá)。而在本研究中，施加ABA脅迫后EfMYB1基因的相對表達(dá)量反而較CK降低，這可能是因?yàn)镸YB基因的表達(dá)不依賴于ABA。 陸苗等[29]的研究表明，菘藍(lán)LiMYB34基因受MeJA顯著誘導(dǎo)，且在MeJA脅迫6 h時其相對表達(dá)量達(dá)到最大值，本研究得出的結(jié)果與該結(jié)果一致。

本研究通過結(jié)合蔗茅低溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，首次從蔗茅中克隆到一個MYB基因，熒光定量PCR分析結(jié)果表明，該基因?qū)儆诘蜏孛{迫響應(yīng)基因，可能參與蔗茅在低溫脅迫下的應(yīng)答反應(yīng)。本研究為深入解析蔗茅的耐寒機(jī)理及轉(zhuǎn)基因甘蔗育種提供理論基礎(chǔ)。