蘇佳萌，袁 強(qiáng)，張冬瑞，湯 珣，常 纓

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,哈爾濱 150030)

萜類(lèi)化合物是一類(lèi)具有不同結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的天然產(chǎn)物，由異戊二烯單元構(gòu)成，多數(shù)屬于次級(jí)代謝物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的氧化還原反應(yīng)、光吸收、生長(zhǎng)調(diào)控等發(fā)揮著重要作用[1-2]。除此之外，萜類(lèi)化合物可應(yīng)用于化妝品、生物燃料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，擁有巨大的經(jīng)濟(jì)效益顯著[3-4]。萜類(lèi)化合物的生物合成起始于兩種通用五碳前體，異戊烯基二磷酸(IPP)和二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)，二者可通過(guò)位于細(xì)胞質(zhì)的甲羥戊酸途徑(MVA pathway)及質(zhì)體中的甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸途徑(MEP pathway)合成。一般倍半萜、三萜的前體(FPP)由MVA途徑合成，而MEP途徑則提供了單萜、二萜和四萜等化合物的前體物質(zhì)(GPP、GGPP)[5-6]。

MEP途徑中，在1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)催化下甘油醛-3-磷酸(GAP)與丙酮酸縮合形成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，DXS合成酶作為限速酶控制著DXP的供應(yīng)，從而對(duì)植物體內(nèi)萜類(lèi)化合物的合成產(chǎn)生影響[7]。目前已在多種植物中對(duì)DXS基因進(jìn)行了克隆分析，如，構(gòu)建長(zhǎng)春花(Catharanthusroseus)CrDXS轉(zhuǎn)基因毛狀根使得萜類(lèi)生物堿的積累量增加[8]，丹參(Salviamiltiorrhiza)毛狀根中過(guò)表達(dá)SmDXS2產(chǎn)生了比對(duì)照組水平更高的丹參酮[9]，桑樹(shù)(Morusnotabilis)MnDXS1的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系開(kāi)花時(shí)間早、GA積累增加[10]，煙草(Nicotianatabacum)中表達(dá)大豆(Glycinemax)GmDXS的轉(zhuǎn)基因株系葉綠素等光合作用色素含量顯著升高[11]。此外，過(guò)表達(dá)DXS基因可以間接提高植物的抗逆性，楊樹(shù)(Populustrichocarpa)幼苗在ABA、NaCl、10%聚乙二醇6000和H2O2處理下，PtDXS的表達(dá)增加，推測(cè)PtDXS能夠提高楊樹(shù)抗鹽、抗旱能力。非生物脅迫處理下的馬尾松(Pinusmassoniana)中也出現(xiàn)了相似的表達(dá)模式，表明PmDXS與馬尾松的抗逆性呈正相關(guān)[12-13]。

香鱗毛蕨(Dryopterisfragrans)屬于鱗毛蕨科(Dryopteridaceae)鱗毛蕨屬(Dryopteris)，為多年生蕨類(lèi)，揉碎略有香味，故有香鱗毛蕨之稱(chēng)，在中國(guó)以黑龍江省為主要生長(zhǎng)區(qū)域[14-16]。香鱗毛蕨生境特殊，火山噴發(fā)后形成的熔巖臺(tái)地或巖漿縫隙中多見(jiàn)其生長(zhǎng)。作為藥用植物其活性成分分離鑒定為萜類(lèi)化合物、黃酮類(lèi)化合物和間苯三酚類(lèi)等。從香鱗毛蕨中提取得到的一種倍半萜Albicanol已被證明具有抗衰老和抗氧化活性，且香鱗毛蕨具有的抑菌活性與間苯三酚類(lèi)物質(zhì)相關(guān)[17-20]。

在香鱗毛蕨萜類(lèi)代謝的研究中，已對(duì)其倍半萜，三萜合成途徑中的主要關(guān)鍵酶法尼基焦磷酸合酶DfFPPS、角鯊烯合酶DfSQS[21]基因進(jìn)行了克隆及功能奠定?？紤]到MEP途徑在單萜、二萜合成的重要作用，本研究克隆得到了香鱗毛蕨2條DfDXS的cDNA全長(zhǎng)，分別命名為DfDXS1和DfDXS2，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用qRT-PCR檢測(cè)DfDXS基因不同脅迫處理下的表達(dá)模式，為深入研究香鱗毛蕨DfDXS基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)，進(jìn)一步了解香鱗毛蕨萜類(lèi)化合物的合成機(jī)理，也為探索香鱗毛蕨的抗逆機(jī)制提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

植物材料采用的是人工快繁培育的香鱗毛蕨孢子體幼苗，培養(yǎng)溫度條件設(shè)置為22 ℃，相對(duì)濕度50%，光周期條件(光照/黑暗)為16 h/8 h[22]。

待香鱗毛蕨長(zhǎng)至幼苗期時(shí)，用流水將幼苗葉片表面輕輕沖洗并吸干水分。激素處理實(shí)驗(yàn)組分別對(duì)葉片噴灑100 μmol·L-1水楊酸(SA)、10 μmol·L-1脫落酸(ABA)、100 μmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)和500 μmol·L-1乙烯利(Eth)；非生物脅迫實(shí)驗(yàn)組分別進(jìn)行20%聚乙二醇(PEG)模擬干旱，200 mmol·L-1NaCl整株澆灌，42 ℃高溫 (HT)和4 ℃低溫(LT)處理，對(duì)照組噴施蒸餾水。所采取濃度為前期試驗(yàn)得出。在處理0、0.5、1、3、6、12、24和48時(shí)分別取樣，樣品剪成1 cm小段裝袋，液氮速凍保存并放入-80 ℃的冰箱備用，每次樣品處理包含至少3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成對(duì)實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的香鱗毛蕨孢子體葉片采用Trizol法提取獲得RNA(擎科，中國(guó)哈爾濱)，參考說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。以總RNA為模板，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊，中國(guó)南京)，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA合成。

1.2.2DfDXS基因克隆及生物信息學(xué)分析根據(jù)香鱗毛蕨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地Blast篩選，獲得2條DfDXS基因，在NCBI網(wǎng)址中利用Blastp對(duì)其它物種的DXS蛋白氨基酸序列檢索，比對(duì)結(jié)果顯示出較高的相似性，于是分別將其命名為DfDXS1、DfDXS2。設(shè)計(jì)正、反向引物 (表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR模板為反轉(zhuǎn)錄獲得的香鱗毛蕨cDNA，體系為模板cDNA 1 μL，正、反向引物各1 μL，2×Taq酶緩沖液10 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序設(shè)置：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃15 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán)；4 ℃保溫。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并按照說(shuō)明書(shū)純化回收特異性條帶，隨后連接到克隆載體pEASY-T18并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌落及菌液PCR檢測(cè)后送往哈爾濱睿博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

表1 引物序列

通過(guò)ExPASy-ProtParamtool在線(xiàn)分析DfDXS氨基酸序列，獲得其組成成分及理化性質(zhì)；利用在線(xiàn)軟件(表2)預(yù)測(cè)DfDXS蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位及保守基序 (Motif)。

表2 生物信息學(xué)分析網(wǎng)址

運(yùn)用NCBI的Blastp工具，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)中DfDXS基因同其他植物的DXS基因的同源氨基酸序列，使用DNAMAN對(duì)下載的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)。利用MEGA7.0 軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用鄰位相連算法(Neigh borjoining)分析DfDXS1、2與其他植物DXS的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，Bootstrap值設(shè)置為1 000。

1.2.3DfDXS的表達(dá)分析使用PrimerPremier6.0軟件設(shè)計(jì)DfDXS基因的qRT-PCR特異引物，內(nèi)參基因?yàn)镈f18sRNA，所用引物序列詳見(jiàn)表1。qRT-PCR體系為SYBR Green熒光染料10 μL，上下游引物各0.8 μL，cDNA1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL，反應(yīng)程序參考試劑說(shuō)明書(shū)(諾唯贊，中國(guó)南京)。PCR反應(yīng)系統(tǒng)為Mx-3000p Real-Time PCR System，采用2-ΔΔCt法計(jì)算DfDXS基因相對(duì)表達(dá)量，反應(yīng)體系及程序參考試劑說(shuō)明書(shū)，每個(gè)樣品重復(fù)3次。數(shù)據(jù)使用Excel 2016和DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析統(tǒng)計(jì)。引物為哈爾濱擎科生物技術(shù)有限公司合成。

2 結(jié)果與分析

2.1 香鱗毛蕨DfDXS基因克隆及序列分析

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室香鱗毛蕨孢子體葉片的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)Blastp找到2條DfDXS基因序列，分別命名為DfDXS1和DfDXS2，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)在2 000 bp左右出現(xiàn)特異片段，與預(yù)期大小基本一致(圖1)。DfDXS1基因長(zhǎng)2 139 bp，編碼712個(gè)氨基酸；DfDXS2基因長(zhǎng)2 160 bp，編碼719個(gè)氨基酸。

M.DL2000；1.DfDXS1；2.DfDXS2

2.2 DfDXS蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)分析

經(jīng)ExPASy在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)分析，DfDXS1蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為76.49 kD，DfDXS2蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為76.74 kD。理論等電點(diǎn)分別為6.64和6.62，是弱酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為89.92和90.00，屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；脂肪族系數(shù)為41.34和35.39，總平均親水系數(shù)為-0.050和-0.029，預(yù)測(cè)該蛋白是親水蛋白。利用Softberry 在線(xiàn)程序預(yù)測(cè)DfDXS蛋白亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示其位于葉綠體。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示DfDXS蛋白具有PLNO2582活性位點(diǎn)，為1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶的特征序列，證明香鱗毛蕨DfDXS蛋白結(jié)構(gòu)完整。

使用NPS@ server在線(xiàn)預(yù)測(cè)DfDXS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)近似，均為alpha-beta型(圖2，A)。為進(jìn)一步了解預(yù)測(cè)DfDXS的蛋白特性，使用SWISS-MODEL分析系統(tǒng)在線(xiàn)預(yù)測(cè)構(gòu)建三維模型(圖2，B)，氨基酸序列相似性分別為82.62%和82.95%，低聚糖狀態(tài)下為同源二聚體。

A.二級(jí)結(jié)構(gòu)；B.三級(jí)結(jié)構(gòu)；藍(lán)色表示α-螺旋，紅色表示β-折疊，綠色表示β-轉(zhuǎn)角，紫色表示無(wú)規(guī)則卷曲

2.3 DfDXS蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化和序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)Blastp對(duì)香鱗毛蕨DfDXS1和DfDXS2編碼氨基酸進(jìn)行同源比對(duì)，并利用MEGA7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，香鱗毛蕨DXS與銀杏(Ginkgobiloba)DXS、北美喬柏(Thujaplicata)DXS1、馬尾松(Pinusmassoniana)DXS1等聚在一支，親緣關(guān)系較近，與蒼術(shù)(Atractylodeslancea)等植物的DXS關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。

右側(cè)Motif 1-10表示香鱗毛蕨DfDXS基因編碼氨基酸的保守基序，Motif圖下方標(biāo)尺表示蛋白長(zhǎng)度

DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對(duì)(圖4)顯示，DfDXS1、DfDXS2蛋白質(zhì)與銀杏，北美喬柏、馬尾松、歐洲云杉和江南卷柏的DXS蛋白質(zhì)相似性均在82%以上，與馬尾DXS1蛋白質(zhì)的相似性達(dá)到86.69%。結(jié)構(gòu)域分析顯示DfDXS1、2蛋白具有典型的轉(zhuǎn)酮醇酶保守域，包含焦磷酸硫胺素結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域在內(nèi)。

紅線(xiàn)為焦磷酸硫胺素結(jié)合位點(diǎn)，藍(lán)線(xiàn)為轉(zhuǎn)酮醇酶結(jié)構(gòu)域

MEME在線(xiàn)網(wǎng)站進(jìn)行Motif功能分析，DfDXS蛋白含有10個(gè)Motif，除Motif9外長(zhǎng)度均為50 aa。Motif1、2中含有二磷酸硫胺結(jié)合位點(diǎn)(Transket_pyr)，Motif3、4、5、7、8與1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXP_synthase_N)功能行使相關(guān)，Motif6、10含有轉(zhuǎn)酮酶C-末端結(jié)構(gòu)域(Transketolase_C)，Motif9長(zhǎng)度為46 aa，屬于Choline_bind_3，與膽堿結(jié)合相關(guān)。

2.4 激素處理下香鱗毛蕨DfDXS基因的表達(dá)

利用qRT-PCR分析外源激素SA、ABA、MeJA和Eth處理下香鱗毛蕨葉片中DfDXS的表達(dá)模式。結(jié)果(圖5)表明，SA處理下，香鱗毛蕨葉片中DfDXS1、2表達(dá)總趨勢(shì)為先升高后降低，分別在處理1和3 h達(dá)到峰值，約為0 h的4.5和2.6倍。在ABA處理下，DfDXS1和DfDXS2的表達(dá)情況有所不同，DfDXS1除在1 h其相對(duì)表達(dá)量有所升高外，均低于0 h；DfDXS2則為下降趨勢(shì)。DfDXS1、2對(duì)MeJA 處理響應(yīng)強(qiáng)烈，相對(duì)表達(dá)都表現(xiàn)為先升高后降低，且表達(dá)量顯著高于對(duì)照。值得注意的是，DfDXS2對(duì)MeJA的響應(yīng)高且晚于DfDXS1。MeJA處理1 h時(shí)DfDXS1達(dá)到峰值，約為對(duì)照的6.7倍；DfDXS2于6 h時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照的12倍。Eth處理下，DfDXS1除3 h高于對(duì)照，其他時(shí)間點(diǎn)相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照；而DfDXS2相對(duì)表達(dá)量在Eth所有處理時(shí)間下均明顯下調(diào)且顯著低于對(duì)照。

處理內(nèi)不同小寫(xiě)字母表示處理時(shí)間之間在0.05水平存在顯著性差異，下同

2.5 非生物脅迫下香鱗毛蕨DfDXS基因的表達(dá)

在PEG、NaCl、高溫(HT)和低溫(LT)處理下，對(duì)香鱗毛蕨葉片中DfDXS表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果如圖6所示，PEG模擬干旱處理，DfDXS1除3 h相對(duì)表達(dá)量略低于對(duì)照外，其他處理時(shí)間均高于對(duì)照，最高的表達(dá)量約為0 h的18.6倍；DfDXS2在1、3 h相對(duì)表達(dá)較低，其余處理時(shí)間均高于對(duì)照。DfDXS對(duì)NaCl模擬的鹽脅迫處理響應(yīng)不明顯，在3 h時(shí)DfDXS1的表達(dá)水平略有上升，NaCl抑制DfDXS2基因的表達(dá)。高溫處理下，DfDXS1和DfDXS2均在0.5 h相對(duì)表達(dá)水平最高，分別為0 h的5和19倍，隨后表達(dá)量下降。低溫處理下DfDXS1和DfDXS2的相對(duì)表達(dá)水平呈先升高后降低的趨勢(shì)，1 h似乎是DfDXS面對(duì)冷脅迫的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，相對(duì)表達(dá)水平驟降后提高。本研究結(jié)果顯示，非生物脅迫處理下DfDXS1和DfDXS2的表達(dá)水平產(chǎn)生了顯著變化，且DfDXS2對(duì)溫度變化的響應(yīng)高于DfDXS1。

圖6 不同非生物脅迫處理香鱗毛蕨葉片中DfDXS1(A)和DfDXS2(B)的相對(duì)表達(dá)

3 討 論

DXS是MEP途徑下游產(chǎn)物的關(guān)鍵調(diào)控位點(diǎn)，在光合色素葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的合成，植物抗病和抗逆等方面發(fā)揮著重要作用[23-25]。DXS基因家族已被廣泛研究，于多種植物中得到鑒定，但香鱗毛蕨DXS基因的生物學(xué)作用尚待研究。本研究克隆并鑒定了香鱗毛蕨中DfDXS1、DfDXS2，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析。結(jié)構(gòu)域分析顯示DfDXS蛋白具有典型且完整的轉(zhuǎn)酮醇酶保守域，證實(shí)DfDXS1、DfDXS2屬于香鱗毛蕨DXS基因家族。在線(xiàn)預(yù)測(cè)DfDXS蛋白亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其位于葉綠體，這與番茄(Lycopersiconesculentum)葉片DXS蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致[26]。根據(jù)已有報(bào)道，DXS基因家族根據(jù)功能可分為三個(gè)分支，Ⅰ型DXS主要作為管家基因，如參與葉綠素的合成；Ⅱ型DXS主要負(fù)責(zé)植物次生代謝產(chǎn)物的積累；Ⅲ型DXS在細(xì)胞中表達(dá)水平較低，主要參與含量水平較低的MEP途徑衍生物的合成[27]。綜合多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，DfDXS蛋白與馬尾松PmDXS1(UIB01902.1)、銀杏GbDXS1(AAS89341.1)相似性較高。因此DfDXS1、2可能屬Ⅰ型DXS，和葉綠素等光合作用涉及的萜類(lèi)物質(zhì)合成相關(guān)。激素和環(huán)境因子能夠影響植物DXS基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)中外源噴施SA、ABA、MeJA、Eth四種激素，觀察香鱗毛蕨DXS基因的表達(dá)模式。在SA處理下，香鱗毛蕨葉片中DfDXS1、DfDXS2相對(duì)表達(dá)量升高，分別在1 h和3 h達(dá)到峰值，隨后降低，這與煙草NtDXS2的表達(dá)模式相似[28]。SA是一種重要的信號(hào)分子，可以增強(qiáng)植物對(duì)生物性病原的抵抗作用。并有研究表明SA調(diào)控植物次生代謝物的生物合成，經(jīng)SA處理24 h后的光果甘草三萜物質(zhì)甘草酸苷的產(chǎn)量較對(duì)照組提高了4.1倍[29]。ABA被定義為一種逆境植物激素，ABA對(duì)DfDXS1、DfDXS2基因表達(dá)有一定的抑制作用，但在丹參毛狀根中ABA處理提高了DXS的轉(zhuǎn)錄水平[30]，說(shuō)明DXS基因在不同植物不同部位行使著不同的功能。已有研究表明MeJA可提高萜類(lèi)物質(zhì)青蒿素含量及相關(guān)基因表達(dá)[31]，DfDXS對(duì)MeJA處理響應(yīng)強(qiáng)烈，其相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照，這與銀杏GbDXS等對(duì)MeJA的表達(dá)模式相似[32]。DfDXS1對(duì)外源MeJA處理響應(yīng)更快，DfDXS2的相對(duì)表達(dá)水平更高。關(guān)于DfDXS與外源激素和萜類(lèi)合成三者之間的關(guān)系仍需要進(jìn)一步探索。

干旱、鹽分和極端溫度等各種非生物壓力對(duì)植物的持續(xù)生長(zhǎng)構(gòu)成了威脅，植物對(duì)外界不同程度脅迫產(chǎn)生的防御作用同樣是影響萜類(lèi)物質(zhì)合成的主要因素[33-34]。有研究表明，MEP途徑可能有助于抵御干旱，利用其中間體和產(chǎn)物異戊二烯以某種方式緩解[35]。本研究中，在PEG模擬的干旱處理下香鱗毛蕨DfDXS的相對(duì)表達(dá)量總體上調(diào)，DfDXS1在12 h達(dá)到最高表達(dá)量約為0 h的18.6倍。然而水分虧缺狀態(tài)下的兩種番茄(Solanumchilense、Solanumlycopersicum)SlDXS的表達(dá)趨勢(shì)與此相反，干旱處理下的云杉(Piceaglauca) DXS活性也降低約50%[36-37]。這可能與香鱗毛蕨的特殊生境相關(guān)，長(zhǎng)期進(jìn)化下對(duì)干旱的耐受力增強(qiáng)。除此之外高溫、低溫對(duì)DfDXS誘導(dǎo)表達(dá)量上調(diào)，外界溫度變化1 h似乎是香鱗毛蕨DfDXS抵御逆境的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，或許通過(guò)增加次生代謝產(chǎn)物的數(shù)量，從而抵御不良因素對(duì)香鱗毛蕨所造成的傷害，推測(cè)其在應(yīng)激條件的調(diào)節(jié)中起重要作用[38-39]。對(duì)于DfDXS基因如何參與調(diào)控香鱗毛蕨抗逆等功能仍需進(jìn)一步深入研究。

綜上，DfDXS1、DfDXS2對(duì)激素、溫度等脅迫處理的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)不同程度的變化，說(shuō)明DfDXS可能在萜類(lèi)物質(zhì)合成與抗逆機(jī)制中發(fā)揮作用。這為后續(xù)進(jìn)一步研究提高香鱗毛蕨萜類(lèi)活性物質(zhì)產(chǎn)量以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。