蔡文凱，蔡水淋綜述 郝宗杰審校

1.廈門健康工程與創(chuàng)新研究院，福建 廈門 361013；

2.福建省水產研究所，福建 廈門 361000；

3.武漢蘭丁云醫(yī)學檢驗實驗室，湖北 武漢 430000

傳染性疾病DNA/RNA檢測是現(xiàn)代臨床診斷醫(yī)學領域中一個重要問題，核酸擴增是分子診斷的關鍵步驟。國家衛(wèi)生健康委發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案》指出：核酸檢測是判斷患者有無2019-nCoV感染的直接證據，也是傳染性疾病預后的重要指標[1]。目前，聚合酶鏈反應(PCR)技術因其特異性強、靈敏度高成為最常見的核酸檢測方法。但因其檢測過程繁瑣、需要專業(yè)人員操作和設備昂貴等因素，限制了基層核酸檢測的運用[2]。自20世紀90年代，科研人員一直致力于研發(fā)更簡易高效核酸檢測方法，同時擺脫循環(huán)加熱儀器約束。核酸恒溫擴增技術不需要溫度的轉換，擴增實質是模板RNA/DNA持續(xù)處于單鏈/單鏈缺口狀態(tài)，即可完成基因片段的置換擴增[3]。這一特點簡化了儀器需求，同時也縮短50%以上反應時間，所以在急診等快速診斷場景中具有巨大的應用價值，如今也成為分子診斷行業(yè)發(fā)展中的熱點。加之，恒溫擴增技術與酸堿指示劑或側流層析試紙條技術結合等簡化了檢測結果判讀，使得核酸的即時檢驗能夠真正地實現(xiàn)。

恒溫核酸擴增技術是在恒定溫度下采用非熱變性方法解開DNA雙鏈并完成核酸擴增的技術，支持在同一個管中完成核酸擴增和結果判讀全部檢測過程，具有簡便、快速、靈敏度高等優(yōu)點。主流恒溫核酸擴增技術包括：依賴核酸序列擴增技術(NASΒA)、滾環(huán)擴增技術(RCA)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴擴增(HDA)、重組酶聚合酶擴增(RPA)、環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)。這些技術逐漸用于臨床診斷、食品安全、轉基因農業(yè)等領域。本文將介紹上述恒溫擴增技術的原理及其在分子診斷的應用，并重點闡述優(yōu)化恒溫擴增技術的策略。

1 恒溫擴增技術

恒溫擴增技術和PCR擴增技術的實質都是引物與單鏈模板DNA結合后，延伸擴增目的片段，因此核酸擴增反應的第一步都是將非單鏈的起始序列進行處理變成單鏈DNA模板。本文按DNA模板變性方式分為兩大類，一類為依靠高溫變性，例如NASΒA和SDA技術，雖然反應過程中溫度恒定，但是初始階段需要95℃預變性過程；另一類依靠解旋酶或者甜菜堿等非高溫手段使DNA模板變性，核酸擴增反應全程處于單一溫度，徹底擺脫熱循環(huán)儀的制約，如RCA，HAD，RPA和LAMP等。6種恒溫擴增技術比較見表1。

表1 6種恒溫擴增技術的比較

1.1 依賴核酸序列擴增技術(NASΒA)1991年Compton模擬病毒RNA的逆轉錄復制方式，發(fā)明了依賴核酸序列擴增技術(nucleic acid sequence-based amplification，NASΒA)[4]。該項技術的原理是由一對含有T7 RNA聚合酶序列引物介導，三種酶(RNase H，AMV逆轉錄酶和T7 RNA聚合酶)共同作用單鏈RNA進行擴增，將反轉錄過程直接合并到擴增反應。NASΒA反應包含了兩個階段(非循環(huán)相和循環(huán)相)，如圖1所示。其中非循環(huán)相(step 1～5)，起始由模板單鏈RNA合成RNA-DNA復合體，再轉化成含有T7 RNA聚合酶序列的雙鏈DNA。循環(huán)相(step 6～10)雙鏈DNA在T7RNA聚合酶作用下生成單鏈RNA進入循環(huán)相，進入反轉錄、降解、反轉錄，如此循環(huán)反復，單鏈RNA模板在2 h內最多可擴增1012倍。NASΒA擴增技術特別適用于RNA病毒的檢測，例如艾滋病病毒、丙肝肝炎病毒，細菌和腸道病毒。美國FDA批準NASΒA數(shù)字化芯片技術用于艾滋病毒RNA的快速檢測[5]。中國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局將NASΒA方法設為早期篩查禽流感病毒標準方法之一(GΒ/T19440-2004)。韓國Kainos公司也研發(fā)全自動便攜式NASΒA檢測儀，使得NASΒA更適于疫情現(xiàn)場快速診斷。

圖1 六種恒溫擴增技術示意圖

1.2鏈置換擴增術(SDA)1992年Walke提出鏈置換擴增技術(strand displacement amplification，SDA)，這標志著一種全新機制DNA擴增技術的誕生。鏈置換擴增(SDA)反應體系關鍵性酶是HincⅡ酶和exo-klenow酶。SDA擴增反應涉及“切口-延伸-置換”循環(huán)往復的過程。鏈置換擴增(SDA)原理如圖示，帶有nickase酶切位點引物結合到單鏈DNA模板后，延伸后被內切酶酶切后生成3'端nickase缺口。另一組引物會在此缺口處發(fā)生新鏈聚合反應，產生新DNA鏈同時置換出舊模板DNA鏈。舊鏈重新進入SDA循環(huán)不斷重復，最終使得目標基因大量擴增。當前SDA擴增技術主要用于傳染病病原體定性檢測，不僅擴增DNA病毒，也可以擴增RNA病毒。趙錦等[6]采用等溫鏈置換擴增檢測體系擴增了登革熱病毒DENV，擴增產物用納米金側流層析試紙條技術檢測，檢測敏感度為10 fmol/L。GIUFFRIDA等[7]將SDA檢測技術和微流控芯片技術結合，成功檢測出microRNA和DNA靶序列。

1.3 滾環(huán)擴增技術(RCA)滾環(huán)擴增技術RCA(rolling circle amplification，RCA)是模擬自然界中環(huán)狀DNA生物滾環(huán)復制方式而建立的一種體外核酸恒溫擴增方法。RCA擴增技術關鍵是構建一個完整的單鏈環(huán)狀DNA和只能與單鏈環(huán)鏈DNA發(fā)生鏈置換擴增反應的phi29 DNA聚合酶[8]。滾環(huán)擴增技術(RCA)原理如圖1所示，線狀DNA引物與單鏈DNA模板互補結合，然后T4 DNA連接酶作用下形成閉合單鏈環(huán)狀DNA模板，最后phi29 DNA聚合酶不斷延伸生成DNA新鏈并置換出舊鏈。被置換下來的舊鏈重新進入循環(huán)過程，因此在1 h內完成106～109核酸擴增。RCA擴增技術在病原微生物檢測、腫瘤早期篩查、DNA及RNA的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、蛋白質的檢測等方面都有著廣泛的應用前景[9]。TENG等[10]利用RCA技術建立一種特異靈敏的快速檢水樣中副溶血性弧菌技術，檢測限達到1 CFU/mL。WANG等[11]利用RCA技術檢測血液中腫瘤標記物MiR-21的異常表達。

1.4 解旋酶依賴擴增(HDA)2004年，Vincent模擬自然界中DNA復制過程發(fā)明了解旋酶依賴擴增技術(helicase-dependent amplification，HDA)。HDA反應步驟與PCR相似，均包括DNA鏈解旋、退火及延伸等步驟，兩者最大的區(qū)別是HDA反應用單鏈結合蛋白酶和解旋酶替代PCR升溫解旋雙鏈過程，因此HAD是一種徹底的等溫擴增技術。解旋酶依賴擴增(HDA)原理如圖1所示。Helicase解旋酶解開模板DNA雙鏈，再由單鏈結合蛋白酶(SSΒ)維持單鏈狀態(tài)，引物結合到單鏈DNA模板上延伸擴增形成新雙鏈。反復循環(huán)擴增實現(xiàn)靶DNA量的指數(shù)增加，在60～90 min內完成擴增109～1012倍[12]。HAD具有靈敏度高、特異好等特點，在臨床診斷運用方面有諸多報道，包括了麻疹病毒、副溶血性弧菌、沙門菌等病原體微生物的快速診斷[13]。王曉等[14]對比了HDA擴增技術和qPCR檢測手段，結果表明HDA擴增技術靈敏度比qPCR高10～100倍。

1.5 重組酶聚合酶擴增(RPA)2006年，NiallArmes第一次描述重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)。這種恒溫擴增技術主要依賴于三種酶：單鏈核酸結合重組酶、單鏈DNA結合蛋白和鏈置換DNA聚合酶。擴增循環(huán)步驟如圖所示：重組酶和引物結合形成重組酶-引物復合物，結合到模板雙鏈DNA形成D-loop結構D-loop一條單鏈與引物雜交啟動DNA擴增，引發(fā)鏈交換反應。同時母鏈開始分離并最終形成兩個雙鏈體，將作為下一個周期的模板。RPA反應速率非常快，一般可在10 min擴增1012倍[15]。RPA技術在POCT有廣泛運用，在病毒診斷、細菌檢測、SNP檢測、食品安全檢測、基因突變等方面的應用進展均有相關綜述[16-17]。ROHRMAN等[16]應用RPA-LFD技術快速檢測干血漬中HIV病毒。KIM等[17]應用RPA方法在10 min內就可以直接特異地檢測到雞蛋和雞肉中沙門氏菌，靈敏度是實時熒光定量PCR方法的100倍。

1.6 環(huán)介導恒溫擴增(LAMP)2000年，Notomi建立了環(huán)介導恒溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification，LAMP)。該技術以其簡單、快速、特異性強、價格低廉等優(yōu)勢，已經成為市場最成熟的恒溫擴增技術。2002年，NAGAMINE等[18]引入環(huán)引物，大大加速了整個鏈置換反應過程，使得整個擴增反應縮短到30 min。技術核心原理是在65℃附近DNA雙鏈處于動態(tài)平衡，即任何一個引物向雙鏈DNA進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會發(fā)生鏈置換反應自動解離變成單鏈。環(huán)介導恒溫擴增技術分兩個階段：起始階段F3引物首先和模板結合并延伸，同時置換出互補單鏈，頸引物自我堿基配對形成莖環(huán)狀結構；擴增循環(huán)階段以莖環(huán)狀結構為模板，啟動鏈置換合成多環(huán)花椰菜結構DNA片段，可在1 h內積累109個拷貝。LAMP技術已經廣泛檢測各種病原體檢測，相關國家行業(yè)安全標準多達20余條，如快速檢測志賀氏菌(SN-T2754.3-2011)等。目前也報道基于LAMP方法的新冠肺炎病毒檢測方法，HUANG等[19]利用RT-LAMP法將新冠RNA病毒逆轉錄和核酸擴增同步進行，快速檢測時間僅為30 min。設計了多重RT-LAMP引物可同時檢測了ORF1ab基因、E基因和N基因三個基因，使用臨床樣本驗證特異性可達100%。日本榮研化學株式會研發(fā)了商品化LAMP檢測試劑盒，檢測結果與PCR一致。

2 優(yōu)化策略

恒溫擴增技術作為一類新型核酸分子診斷技術，有著共同技術通?。捍蠖嗪銣財U增技術是多種酶復合反應體系，而酶處于非最適反應溫度時，酶活力將下降甚至引起負面效果，例如限制性內切酶會發(fā)生引起非特異性切割、聚合酶堿基錯配延伸概率增高等[20]；其次恒溫核酸擴增反應沒有溫度變化，局部復雜結構DNA雙鏈并未完全打開，或者重復序列也會形成發(fā)夾結構，又或者引物與互補片段在低溫情況下錯誤配對等，某些情況下的反應體系里引物之間形成非特異性互補，最后造成假陽性的結果；再者樣本來源復雜，鼻咽拭子或血漿等樣本往往含有擴增反應抑制物，這會降低擴增靈敏度、特異性和準確性差。本文從大分子擁擠效應、核酸結構、酶穩(wěn)定性和其他技術聯(lián)用等策略優(yōu)化恒溫擴增反應體系，以提高核酸擴增反應效率、特異性和靈敏性。

2.1 擁擠試劑擁擠試劑模擬了自然狀態(tài)下細胞的高度擁擠狀態(tài)，擁擠試劑提高了酶促反應速率，加快了酶反應速度[21]。在恒溫核酸擴增中，常用的擁擠試劑包括聚乙二醇、多聚蔗糖等。MOTRé等[22]在HDA反應中額外添加5%多聚蔗糖400，可以縮短一半的反應時間。SASAKI等[23]發(fā)現(xiàn)RCA擴增產物與聚乙二醇添加量成正比，其機制可能是聚乙二醇有助于探針和模板結合，從而顯著提高聚合酶活性。鐘文濤等[24]認為擁擠試劑環(huán)境影響了蛋白質空間結構，通過非折疊狀態(tài)變?yōu)檎郫B狀態(tài)來增強酶的穩(wěn)定性，降低蛋白酶反應的自由能提高酶活性。

2.2 模板結構恒溫條件容易導致單鏈DNA形成局部二級結構(或發(fā)夾結構)，引物自身二聚體和非特異性擴增，因此如何使雙螺旋解鏈DNA變性成單鏈模板，成為提高特異性擴增的關鍵因素之一。甜菜堿可幫助DNA聚合酶順利通過DNA某些復雜二級結構(如高GC區(qū)域)，防止DNA聚合酶的從模板中解離。LUO等[25]發(fā)現(xiàn)引物如果沒有經過嚴格篩選，RPA技術中很容易出現(xiàn)非特異性擴增。但是在RPA反應體系中添加0.8 mol/L甜菜堿，可以提高RPA檢測的靈敏性和準確性，從而有效檢測到臨床血漿樣本中的乙型肝炎病毒。單鏈結合蛋白(SSΒs)非特異性與單鏈DNA結合，使模板處于單鏈狀態(tài)防止單鏈形成二級結構，并且保護單鏈部分不被核酸酶降解。ZHOU等[26]研究CRISPR-SDA恒溫擴增技術時，發(fā)現(xiàn)缺少SSΒ蛋白，引物的3'末端很難結合到dsDNA，從而影響下一步擴增實驗。MIKAWA等[27]在RAC擴增中添加SSΒ蛋白，不僅加速反應速率并且減少背景信號。

2.3 酶穩(wěn)定性核酸檢測過程中必須減少樣本中內源抑制物的干擾作用。這些內源抑制物(包括血紅素，蛋白酶等)可以抑制了酶活性和破壞酶結構，最終造成擴增產物少或假陰性。牛血清白蛋白(ΒSA)因富含賴氨酸，可通過疏水鍵相互作用力消除了多酚類化合物，以降低了抑制物的干擾作用。WALKER等[28]研究認為牛血清白蛋白通過可與酚類化合物和多糖結合，避免聚合酶失活，優(yōu)化SDA反應體系。LIN等[29]研究了不同濃度的ΒSA在數(shù)字LAMP的優(yōu)化作用，結果表明1 mg/mLΒSA可以達到最佳的檢測效果；他認為ΒSA通過保護酶的穩(wěn)定性降低引物二聚體形成，最終提高反應特異性。海藻糖通過抗氧化、熱、干燥、脫水等不利外界因素來保護酶的穩(wěn)定性，最終顯著地提高酶的熱穩(wěn)定性和活性。WAN等[30]利用LAMP技術檢測沙門氏菌時，不僅發(fā)現(xiàn)添加5.0%海藻糖可以縮短將近20%的反應時間。此外，海藻酸酶是凍干反應混合物的酶穩(wěn)定劑，李美霞等[31]結果表明海藻糖作為保護劑機理：海藻糖與蛋白酶表面殘余水分子結合，使蛋白酶構象更穩(wěn)定。

2.4 與其他技術結合恒溫擴增技術與CRISPR-Cas系統(tǒng)結合。CRISPR蛋白具有特異性地精確定任何雙鏈DNA序列，具有高特異性。目前CRISPR/Cas系統(tǒng)主要技術平臺是DETECTR技術(Cas12a)和SHERLOCK技術(Cas13a)[32]，這兩種CRISPR技術均可與RAP擴增技術結合，先通過RAP技術將核酸目標進行預擴增，再用CRISPR技術進行檢測。該技術已經成功檢測出如病毒檢測(ZIKA)和病毒亞型區(qū)分(HPV)，達到信號擴增為目標序列初始濃度的104倍效果。恒溫擴增技術與電化學生物傳感器結合：與傳統(tǒng)檢測(化學發(fā)光，電泳檢測、免疫試紙條法)方法相比較，與恒溫擴增技術結合所構建的生物傳感器測速度快、靈敏度高，低背景，甚至達到單分子檢測水平。YANG等[33]利用SDA恒溫擴增技術和電化學信號放大技術實現(xiàn)了對microRNA超靈敏檢測，最低檢測限達到0.64 fmol/L?；诩{米材料的電化學生物傳感器大大提高了檢測的靈敏度，也提高了傳感器的特異性和重現(xiàn)性。謝順碧[34]通過電化學的方法間接追蹤LAMP中產生的磷酸根離子(Pi)實現(xiàn)家蠶微孢子蟲PTP1基因的高靈敏檢測，其檢測限達17 fg/μL。

3 展望

恒溫核酸擴增技術具有擴增快、操作簡便、檢測簡便、無需專用設備等優(yōu)點，檢測成本較低，有望在基層醫(yī)療及POCT中得到廣泛運用，是目前新冠肺炎核酸快速檢測中最具潛力的檢測手段之一，特別是LAMP技術已逐漸應用于檢測中。除上述恒溫擴增技術存在假陽性缺陷的情況下，仍有一些問題亟待解決。首先恒溫核酸擴增技術的結果一般都是定性，無法準確定量檢測。有些文獻提出用標準曲線來定量，但是因為鏈置換酶具有指數(shù)擴增，很難得到滿意的定量結果；其次不同公司的恒溫核酸擴增檢測體系和設備不具有兼容性，影響了技術大規(guī)模推廣和應用；而且恒溫核酸擴增技術對核酸模板要求較低，并不需要將待測樣本完全將核酸純化。因此不少研究人員嘗試用粗提取核酸樣本或者免提取核酸直接擴增樣本?？偠灾?，恒溫核酸擴增技術是一類具有突破性的、快速而簡單的核酸診斷工具。經過持續(xù)優(yōu)化和改善，恒溫擴增技術必定和PCR技術一樣成為新冠肺炎核酸不可缺少的檢測方法。