汪 猛，邱文超，秦凱健

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院，上海 200434；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

腫瘤病因病機(jī)復(fù)雜，并且存在異常細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、免疫逃逸、血管生成、能量代謝失衡等多種生物學(xué)特征[1]。雖然近年來診斷和治療方面都取得了一定進(jìn)步，但由于其發(fā)病率高、預(yù)后差[2]，仍然對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅。白術(shù)、莪術(shù)是臨證常用的抗腫瘤中藥，在治療腫瘤的組方配伍中均有較高的使用頻率[3]。白術(shù)健脾燥濕，莪術(shù)化瘀散結(jié)，兩藥配伍，攻補(bǔ)兼施。得益于攻堅(jiān)而不傷正的特點(diǎn)，該藥對(duì)廣泛應(yīng)用于多種腫瘤見痰瘀互結(jié)證者[4]。

單味中藥、藥對(duì)以及中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，是中醫(yī)藥研究的特色和難點(diǎn)，單一成分、單一靶點(diǎn)的研究有較大局限。近年來，隨著計(jì)算機(jī)、組學(xué)、大數(shù)據(jù)等技術(shù)方法的進(jìn)步，及多學(xué)科滲透交叉，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。該方法可以從多成分、多靶點(diǎn)、多途徑研究中藥的作用機(jī)制，拓展了中醫(yī)藥研究的思路[5]。本研究擬基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法，挖掘白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤的作用機(jī)制，為進(jìn)一步藥理研究提供參考。

1 方法

1.1 白術(shù)、莪術(shù)成分和靶點(diǎn)的收集 基于TCMSP[6]、TCMIP[7]數(shù)據(jù)庫，分別以“白術(shù)”“莪術(shù)”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得白術(shù)和莪術(shù)的化學(xué)成分。利用PubChem[8]檢索藥物成分的名稱和SMILES編碼，基于Seaware（P-Value＜0.01）分析平臺(tái)[9]、STITCH（interaction score>0.40）[10]和Swiss Target Prediction（probability>0.50）[11]數(shù)據(jù)庫，獲取白術(shù)和莪術(shù)的作用靶點(diǎn)。

1.2 腫瘤疾病靶點(diǎn)的收集 基于GeneCards[12]、DisGeNET[13]、NCBI-gene（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫，以“cancer”“tumor”“carcinoma”等為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，匯總、去重后，獲得腫瘤疾病的靶點(diǎn)。

1.3 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤靶點(diǎn)及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的獲取 由于白術(shù)、莪術(shù)成分的靶點(diǎn)信息來源不統(tǒng)一，因此將所獲靶點(diǎn)在Uniprot[14]數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索，物種設(shè)置為“human hsa（人）”，對(duì)收集、篩選得到的靶點(diǎn)名稱進(jìn)行統(tǒng)一。采用R（version 3.6.1）軟件（https://www.r-project.org/）對(duì)藥物成分的靶點(diǎn)和疾病的靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲取白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤作用的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)，基于Metascape[15]數(shù)據(jù)庫TRRUST模塊，分析靶點(diǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，預(yù)測(cè)白術(shù)、莪術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控潛能。

1.4 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING[16]數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)蛋白互作關(guān)系。將白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)成分和抗腫瘤靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1[17]，構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape cytoHubba模塊分析靶點(diǎn)蛋白在網(wǎng)絡(luò)中的度值（Degree Value），度值排名靠前的靶點(diǎn)為網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)；基于Cytoscape構(gòu)建藥物成分-腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并利用已獲得的核心靶點(diǎn)以及前述Seaware、STITCH和Swiss Target Prediction平臺(tái)提供的藥物成分-靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步獲得核心藥物成分-腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 富集分析 將白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)導(dǎo)入Enrichr[18]數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)與疾病關(guān)系的參數(shù)，通過R語言對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，獲得白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)作用的腫瘤類型。

基于DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析[19-20]，其中GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）3個(gè)模塊。通過R語言對(duì)富集分析結(jié)果P值排名前20的條目進(jìn)行可視化處理。

1.6 分子對(duì)接 通過PubChem[8]獲取白術(shù)、莪術(shù)藥物成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，通過Protein Data Bank平臺(tái)[21]獲取白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)。運(yùn)用Molecular Operating Environment（MOE）[22]軟件進(jìn)行分子對(duì)接，模擬藥物成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白間的相互作用，并計(jì)算結(jié)合強(qiáng)度。

1.7 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度分析 基于TIMER數(shù)據(jù)庫Gene模塊[23-24]，對(duì)白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)在腫瘤組織中的表達(dá)水平與不同免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析，獲取偏相關(guān)系數(shù)（partial correlation coefficients）及統(tǒng)計(jì)學(xué)P值。

1.8 靶點(diǎn)在腫瘤組織的基因表達(dá)情況 基于GEPIA2數(shù)據(jù)庫[25]，獲取患者腫瘤組織的基因表達(dá)情況，分析靶點(diǎn)在各類腫瘤中的基因相對(duì)表達(dá)水平，繪制基因表達(dá)量示意圖，顏色越深代表相應(yīng)的表達(dá)水平越高。同時(shí)，基于The Cancer Genome Atlas（TCGA，https://www.cancer.gov/tcga）數(shù)據(jù)庫，獲取腫瘤組織和癌旁組織Fregments Per Kilobase per Million（FPKM）格式的RNAseq數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，用以分析白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)在患者腫瘤組織和癌旁組織的差異表達(dá)情況。

1.9 核心靶點(diǎn)的臨床預(yù)后價(jià)值 基于TCGA數(shù)據(jù)庫（https://www.cancer.gov/tcga）下載臨床患者腫瘤組織和癌旁組織的RNAseq數(shù)據(jù)（FPKM格式）且進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化，用以分析臨床預(yù)后。Nomogram分析[26]整合臨床病理分期和多個(gè)核心靶點(diǎn)作為預(yù)測(cè)指標(biāo)，基于多因素COX回歸模型，繪制有刻度的線段，用以探討核心靶點(diǎn)表達(dá)情況對(duì)腫瘤患者1年、3年及5年生存率的影響程度。受試者工作特性（receiver operating characteristic，ROC）分析用以探討核心靶點(diǎn)的預(yù)后判斷效能，ROC曲線下面積（Area Under Curve，AUC）提示預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，AUC越接近1，即曲線下面積越大，說明預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率越高[27]?；贕EPIA 2[25]數(shù)據(jù)庫，采用Kaplan-Meier生存曲線分析法，探討核心靶點(diǎn)表達(dá)水平與腫瘤患者總生存期、無病生存期的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)的潛在抗腫瘤靶點(diǎn) 經(jīng)篩選整理，共獲取240個(gè)藥物成分，其中白術(shù)62個(gè)，莪術(shù)188個(gè)，包含10個(gè)共同成分；藥物成分作用的潛在靶點(diǎn)379個(gè)，其中白術(shù)265個(gè)，莪術(shù)211個(gè)，有97個(gè)共同靶點(diǎn)；腫瘤疾病相關(guān)靶點(diǎn)31 490個(gè)。藥物成分靶點(diǎn)與腫瘤疾病靶點(diǎn)映射取交集得到192個(gè)共同靶點(diǎn)，即白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)發(fā)揮抗腫瘤作用的潛在靶點(diǎn)。（見圖1）

圖1 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)與腫瘤疾病靶點(diǎn)的交集

2.2 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤潛在靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)包含192個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 419條連線。（見圖2）進(jìn)一步獲得核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，顯示白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤的核心靶點(diǎn)包括AKT1、VEGFA、GRM3、GRM4等，圖中節(jié)點(diǎn)由黃色漸變?yōu)榧t色，提示度值（Degree Value）結(jié)果逐漸增大，靶點(diǎn)的重要性可以參考度值進(jìn)行判斷。（見圖3、表1）

圖2 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

表1 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)的度值（前20）

2.3 白術(shù)、莪術(shù)成分-腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 白術(shù)、莪術(shù)成分-腫瘤靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)包含247個(gè)節(jié)點(diǎn)和549條連線。（見圖4）藥物成分-核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中包含41個(gè)節(jié)點(diǎn)和63條連線，其中節(jié)點(diǎn)代表白術(shù)、莪術(shù)的藥物成分或腫瘤疾病靶點(diǎn)，紅色代表白術(shù)的成分，紫色代表莪術(shù)的成分，亮黃色代表白術(shù)和莪術(shù)的共同成分，土黃色代表白術(shù)的靶點(diǎn)，藍(lán)色代表莪術(shù)的靶點(diǎn)，綠色代表白術(shù)和莪術(shù)的共同作用靶點(diǎn)；連線代表該成分可作用于相應(yīng)的靶點(diǎn)。（見圖5、表2）

表2 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤主要成分

圖4 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

圖5 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)作用的腫瘤類型 采用富集分析方法，獲得P＜0.05的疾病種類條目，并分析其中的腫瘤疾病類型，對(duì)排名前20的條目作圖展示，即白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)作用的腫瘤類型，包括乳腺癌、肝癌、前列腺癌、腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等。圖中每條橫柱后的數(shù)字是白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)作用靶點(diǎn)富集在該疾病的數(shù)量。（見圖6）

圖6 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)作用的腫瘤疾病類型

2.5 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)GO和KEGG富集分析 對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行功能注釋及通路富集分析，對(duì)P＜0.05且排名在前20的條目繪圖展示，結(jié)果表明白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤作用涉及多個(gè)生物途徑和通路。

GO富集分析結(jié)果包括組蛋白H3脫乙酰、調(diào)控血壓、調(diào)控凋亡、離子型谷氨酸受體信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)分解、炎癥反應(yīng)、缺氧應(yīng)答等生物過程，細(xì)胞質(zhì)膜、胞漿、核漿、組蛋白脫乙酰酶復(fù)合物、AMPA谷氨酸受體復(fù)合物等細(xì)胞成分，以及谷氨酸受體活性、離子型谷氨酸受體活性、Ⅲ組代謝型谷氨酸受體活性、AMPA谷氨酸受體活性等分子功能。圖中圓點(diǎn)越大，表明富集到的靶點(diǎn)數(shù)目越多，圓點(diǎn)的顏色由綠變紅，表明P值越小。（見圖7～9）

圖7 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤作用靶點(diǎn)GO 生物過程富集分析

圖8 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤作用靶點(diǎn)GO 細(xì)胞成分富集分析

圖9 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤作用靶點(diǎn)GO 分子功能富集分析

KEGG富集分析結(jié)果表明白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤機(jī)制涉及cAMP信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、PPAR信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、胰島素抵抗、細(xì)胞凋亡、脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)節(jié)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)、精氨酸生物合成等。（見圖10）

圖10 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤作用靶點(diǎn)KEGG 富集分析

2.6 白術(shù)、莪術(shù)成分-靶點(diǎn)蛋白分子對(duì)接 基于蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析和Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫，獲得度值排名靠前的核心作用靶點(diǎn)及其晶體結(jié)構(gòu)，包括AKT1（PDB-ID 6HHG）、VEGFA（PDB-ID 5T89）、GRM3（PDB-ID 5CNM）等。將蛋白晶體中的原有配體重新與蛋白對(duì)接，以RMSD值為參考標(biāo)準(zhǔn)判斷對(duì)接的方式是否發(fā)生改變。若配體的平均RMSD值＜2?，則說明方法具有可行性，對(duì)接參數(shù)可靠。MOE分子對(duì)接結(jié)果表明AKT1與L-苯丙氨酸（L-Phenylalanine）具有較強(qiáng)的結(jié)合作用，模擬計(jì)算其結(jié)合自由能為-57.625 kcal/mol。該方法下VEGFA、GRM3的蛋白靶點(diǎn)中，配體平均RMSD值＞2?，因此，運(yùn)用軟件中Flexible Alignment模塊，考察靶點(diǎn)蛋白與相應(yīng)化合物的結(jié)合模式，篩查出較優(yōu)的擬合結(jié)果。其中，VEGFA與球松素（Pinostrobin）、VEGFA與西托糖苷（Sitogluside）、GRM3與谷氨酸（Glutamic acid）分別模擬分子對(duì)接，結(jié)合自由能依次為-13.017、-34.228、-141.838 kcal/mol。通常結(jié)合自由能＜0提示化合物能夠與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合，結(jié)果表明，所分析的化合物及相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白有不同強(qiáng)度的結(jié)合潛力。（見圖11、表3）

圖11 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接模擬圖

表3 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接的結(jié)合能

2.7 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤核心靶點(diǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子 轉(zhuǎn)錄因子是一種對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄有激活或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白，可以調(diào)控下游靶基因和信號(hào)通路?；诎仔g(shù)、莪術(shù)抗腫瘤核心靶點(diǎn)預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子包括RELA、NFKB1、STAT3、TP53、SP1等，并依據(jù)Metascape TRRUST平臺(tái)計(jì)算結(jié)果lgP排序。分析結(jié)果提示白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)可能通過調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響核心靶點(diǎn)的表達(dá)，發(fā)揮抗腫瘤作用。（見圖12、表4）

圖12 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤核心靶點(diǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

表4 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤核心靶點(diǎn)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果

2.8 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度相關(guān)性 基于TIMER平臺(tái)，對(duì)核心靶點(diǎn)AKT1、VEGFA、GRM3的基因表達(dá)水平與不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果提示AKT1表達(dá)水平與結(jié)腸腺癌腫瘤純度相關(guān)，VEGFA表達(dá)水平與乳腺浸潤(rùn)癌、肝細(xì)胞肝癌腫瘤純度相關(guān)。分析表明，在結(jié)腸腺癌、乳腺浸潤(rùn)癌、肝細(xì)胞肝癌患者的臨床樣本中，AKT1、VEGFA、GRM3的表達(dá)水平與至少1種免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度相關(guān)（P＜0.05），如B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞等。其中BRCA、COAD、LIHC分別表示乳腺浸潤(rùn)癌（breast invasive carcinoma）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma）、肝細(xì)胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma）。（見圖13～15、表5）

表5 核心靶點(diǎn)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（√表示P＜0.05）

圖13 AKT1 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

圖14 VEGFA 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

圖15 GRM3 表達(dá)水平與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.9 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)在腫瘤組織中的表達(dá)情況 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)（前20）在不同腫瘤組織中的表達(dá)量有差異，其中AKT1、VEGFA等基因的表達(dá)量相對(duì)較高，GRM3、GRM4等基因的表達(dá)量相對(duì)較低，圖中右側(cè)數(shù)字代表相對(duì)表達(dá)水平，即顏色越深，數(shù)字越大，表達(dá)水平越高。（見圖16）

圖16 白術(shù)、莪術(shù)抗腫瘤核心靶點(diǎn)（前20）在不同腫瘤組織中的相對(duì)表達(dá)水平

對(duì)白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)AKT1、VEGFA、GRM3在腫瘤組織和癌旁組織的表達(dá)差異進(jìn)行比較分析，圖中Tumor組為腫瘤組織，Normal組為癌旁組織。在乳腺浸潤(rùn)癌（BRCA）病例中，AKT1、VEGFA在Tumor組表達(dá)高于Norma l組（P＜0.001），GRM3在Tumor組表達(dá)低于Normal組（P＜0.001）。在結(jié)腸腺癌（COAD）病例中，VEGFA在Tumor組表達(dá)高于Normal組（P＜0.001）。在肝細(xì)胞肝癌（LIHC）病例中，VEGFA在Tumor組表達(dá)高于Normal組（P＜0.001），GRM3在Tumor組表達(dá)高于Normal組（P=0.006）。（見圖17）

圖17 AKT1、VEGFA、GRM3 在腫瘤組織和癌旁組織中的表達(dá)差異

2.10 白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)的臨床預(yù)后價(jià)值 TCGA患者臨床數(shù)據(jù)的Nomogram分析結(jié)果提示，除了腫瘤的病理分期（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期），白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)AKT1、VEGFA、GRM3的表達(dá)水平對(duì)乳腺浸潤(rùn)癌、結(jié)腸腺癌、肝細(xì)胞肝癌患者的1年、3年、5年生存率也均有不同程度的影響。在乳腺浸潤(rùn)癌患者中，VEGFA的表達(dá)水平對(duì)臨床結(jié)局的貢獻(xiàn)較大，其次為GRM3、AKT1；在結(jié)腸腺癌患者中，AKT1的表達(dá)水平對(duì)臨床結(jié)局的貢獻(xiàn)較大，其次為GRM3、VEGFA；在肝細(xì)胞肝癌患者中，GRM3的表達(dá)水平對(duì)臨床結(jié)局的貢獻(xiàn)較大，其次為AKT1、VEGFA。（見圖18～20）

圖18 Nomogram 分析AKT1、VEGFA、GRM3 表達(dá)水平對(duì)乳腺浸潤(rùn)癌患者預(yù)后的影響

圖19 Nomogram 分析AKT1、VEGFA、GRM3 表達(dá)水平對(duì)結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的影響

圖20 Nomogram 分析AKT1、VEGFA、GRM3 表達(dá)水平對(duì)肝細(xì)胞肝癌患者預(yù)后的影響

為進(jìn)一步了解核心靶點(diǎn)表達(dá)水平預(yù)測(cè)腫瘤患者臨床結(jié)局的效能，筆者進(jìn)行了ROC曲線分析。結(jié)果提示白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)表達(dá)水平用于判斷腫瘤患者預(yù)后的曲線下面積（AUC）均＞0.5。在預(yù)測(cè)乳腺浸潤(rùn)癌患者臨床結(jié)局時(shí)，AKT1表達(dá)水平的預(yù)測(cè)能力有一定準(zhǔn)確性（AUC=0.796），其次為VEGFA、GRM3。在預(yù)測(cè)結(jié)腸腺癌患者臨床結(jié)局時(shí)，VEGFA表達(dá)水平的預(yù)測(cè)能力有較高準(zhǔn)確性（AUC=0.965），其次為GRM3、AKT1。在預(yù)測(cè)肝細(xì)胞肝癌患者臨床結(jié)局時(shí)，VEGFA表達(dá)水平的預(yù)測(cè)能力有一定準(zhǔn)確性（AUC=0.731），其次為GRM3、AKT1。（見圖21）

圖21 AKT1、VEGFA、GRM3 表達(dá)水平預(yù)測(cè)患者臨床結(jié)局的ROC 曲線分析

鑒于腫瘤組織VEGFA表達(dá)水平在前述預(yù)測(cè)臨床預(yù)后結(jié)局中的重要性，筆者進(jìn)一步探討了TCGA腫瘤患者的臨床預(yù)后情況。結(jié)合生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA的表達(dá)與結(jié)腸腺癌患者的無病生存期及肝細(xì)胞肝癌患者的總生存期、無病生存期有相關(guān)性，且VEGFA表達(dá)水平高者，預(yù)后較差，但VEGFA的表達(dá)與乳腺浸潤(rùn)癌患者的總生存期、無病生存期無明顯相關(guān)性。（見圖22）

圖22 VEGFA 表達(dá)水平在腫瘤患者總生存期和無病生存期中的預(yù)后價(jià)值

3 討論

繆希雍《本草經(jīng)疏》[28]言：“若夫婦人、小兒氣血兩虛，脾胃素弱，而無積滯者，用之（莪術(shù)）反能損真氣”，還指出“當(dāng)與健脾開胃、補(bǔ)益元?dú)馑幫谩?。因此，白術(shù)配伍莪術(shù)的運(yùn)用也見于諸多臨床名家的報(bào)道，如陸拯[29]采用白術(shù)反佐莪術(shù)取其健脾消癥的作用；朱南孫應(yīng)用該配伍燥濕除痰而通經(jīng)消積，消補(bǔ)相伍，用于治療經(jīng)閉、卵巢囊腫、子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜異位癥等疾病[30]；李乾構(gòu)取兩藥健脾行氣活血、消積散結(jié)除痞，用于治療萎縮性胃炎等疾病[31]。腫瘤患者可因情志、飲食、外邪等多種因素導(dǎo)致氣滯血瘀痰凝之證[32-33]，白術(shù)配伍莪術(shù)對(duì)上述病因病機(jī)有較強(qiáng)的針對(duì)性。有研究[34]報(bào)道，白術(shù)可以調(diào)節(jié)腸胃功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，其活性成分對(duì)多種腫瘤有抑制作用。莪術(shù)具有行氣破血、消積止痛的功效，其中莪術(shù)油制劑、莪術(shù)醇等均可直接殺傷腫瘤細(xì)胞。此外，莪術(shù)還有調(diào)節(jié)免疫、抑制血管生成、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等作用[35]。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)研究方法，通過對(duì)白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)的分析，提示該藥對(duì)可應(yīng)用于治療乳腺癌、肝癌、前列腺癌、腸癌、肺癌、胃癌、膀胱癌等多種腫瘤疾病。富集分析結(jié)果表明，白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤的潛在作用機(jī)制涉及凋亡、炎癥反應(yīng)、缺氧應(yīng)答以及cAMP、Rap1、雌激素、甲狀腺激素、PPAR、HIF-1信號(hào)通路等。這些機(jī)制與腫瘤的發(fā)生發(fā)展均有密切聯(lián)系，且多種機(jī)制之間又相互影響。如缺氧是腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)之一，缺氧誘導(dǎo)因子（HIFs）及其關(guān)聯(lián)機(jī)制協(xié)助細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，而HIF-1作為信號(hào)樞紐，影響了多種腫瘤轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)分子的活性[36]。Ras和Rap1協(xié)同啟動(dòng)和維持ERK信號(hào)，ERK在多種惡性腫瘤中被激活，是重要的治療靶點(diǎn)[37]。雌激素信號(hào)通路及其關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)劑之間相互干擾，可以改變?nèi)橄倌[瘤細(xì)胞的代謝，并促使細(xì)胞適應(yīng)灌注不良、短暫的營(yíng)養(yǎng)剝奪和酸度的增加等環(huán)境，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥[38]。

營(yíng)養(yǎng)支持可以改善腫瘤患者的營(yíng)養(yǎng)狀況，但也會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，調(diào)整某些氨基酸的用量或比例，可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)[39]。一些補(bǔ)益中藥氨基酸含量豐富，有學(xué)者通過對(duì)四君子湯、四物湯、八珍湯的研究，指出氨基酸是補(bǔ)益或扶正中藥治療虛證的物質(zhì)基礎(chǔ)[40]。白術(shù)含有多種氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、精氨酸等，也包括多種人體必需氨基酸，如苯丙氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等[41]。分子對(duì)接結(jié)果提示白術(shù)所含苯丙氨酸、谷氨酸可以分別與核心靶點(diǎn)AKT1、GRM3結(jié)合，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果提示白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤靶點(diǎn)包括多個(gè)谷氨酸受體，富集分析也提示作用機(jī)制涉及谷氨酸受體信號(hào)通路。苯丙氨酸可以顯著增加胰腺α-淀粉酶、胰蛋白酶等消化酶的合成和釋放[42]，且有研究[43]表明，胰腺腺泡細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成主要由PI3K-AKT-mTOR途徑介導(dǎo)。此外，苯丙氨酸能夠優(yōu)化腸道菌群[44]，白術(shù)可調(diào)節(jié)腸易激綜合征小鼠的苯丙氨酸代謝通路等[45]。不同的腫瘤中有不同亞型的谷氨酸受體表達(dá)，激活或阻斷谷氨酸受體可影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或遷移[46]。有研究發(fā)現(xiàn)，代謝型谷氨酸受體3（GRM3）可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[47]。白術(shù)所含有的其他氨基酸對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有重要影響，如有研究發(fā)現(xiàn)谷氨酸和天冬氨酸可以抑制人肝癌細(xì)胞增殖，且聯(lián)合使用可增強(qiáng)其抗增殖活性，并抑制AKT的磷酸化[48]。還有數(shù)據(jù)表明，在非超重人群中，基線膳食谷氨酸攝入量與較低的大腸癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[49]。

富集分析結(jié)果還提示白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)通過VEGF信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用，分子對(duì)接結(jié)果提示莪術(shù)所含成分球松素、西托糖苷均與相應(yīng)靶點(diǎn)VEGFA有結(jié)合潛能。VEGFA介導(dǎo)血管生成[50]，莪術(shù)具有調(diào)控VEGF的作用[51]，球松素、西托糖苷均具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理活性[52-53]，球松素查爾酮能夠抑制VEGF誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移[54]。西托糖苷亞麻酸酯、西托糖苷亞油酸酯、西托糖苷棕櫚酸酯等均可激活異位種植乳腺腫瘤組織中的Caspase-3、Caspase-9，下調(diào)VEGF、BCL-2、BCL-XL，抑制PI3K/AKT/NF-κB通路，延緩腫瘤的生長(zhǎng)[55]。

基于白術(shù)、莪術(shù)作用疾病譜的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，筆者選取乳腺癌、肝癌、腸癌做進(jìn)一步臨床意義分析?；赥CGA臨床病例的分析結(jié)果提示，白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤核心靶點(diǎn)AKT1、VEGFA、GRM3的表達(dá)水平對(duì)乳腺浸潤(rùn)癌、結(jié)腸腺癌、肝細(xì)胞肝癌這3種腫瘤患者的預(yù)后均有不同程度的影響。其中，VEGFA在這3種腫瘤組織中的表達(dá)均異常升高，且VEGFA表達(dá)水平高者，結(jié)腸腺癌、肝細(xì)胞肝癌等腫瘤患者的預(yù)后也相對(duì)較差。研究結(jié)果提示白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)具有通過調(diào)控相關(guān)靶點(diǎn)影響腫瘤患者預(yù)后的潛在價(jià)值。

分析結(jié)果還提示，白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)可能通過調(diào)控NFKB1、STAT3、TP53等轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抗腫瘤作用。其中，NF-κB信號(hào)通路的異常激活與癌變過程密切相關(guān)[56]；STAT3的持續(xù)激活是多種實(shí)體瘤中常見的促炎致癌特征[57]；TP53是一種腫瘤抑制因子，激活后可進(jìn)一步參與凋亡和衰老、細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷修復(fù)等多個(gè)生物學(xué)過程[58]。

腫瘤細(xì)胞通常具有十到數(shù)千個(gè)突變，且即使在相同組織類型的腫瘤中，大多數(shù)突變也是不同的[59]。這種不穩(wěn)定性也導(dǎo)致免疫治療成為較熱門的研究方向。如近年來PD-1/PD-L1抗體藥物的應(yīng)用即日趨廣泛。免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度分析結(jié)果提示，白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)有干預(yù)免疫細(xì)胞及炎性反應(yīng)、改善腫瘤微環(huán)境進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用的潛能。有研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)主要成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ能夠顯著提升細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，還能有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗原呈遞，與免疫檢查點(diǎn)抑制劑PD-1聯(lián)合應(yīng)用能夠起到協(xié)同增效的作用[60]。

以上分析表明，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法，可以挖掘白術(shù)、莪術(shù)藥對(duì)抗腫瘤的潛在作用機(jī)制。結(jié)果也提示，該藥對(duì)是通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同起效的方式發(fā)揮抗腫瘤作用的，且相關(guān)靶點(diǎn)有一定的臨床預(yù)后意義，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供了思路。