王園，鞠立逵

（蘭州理工大學(xué)，甘肅 蘭州 730050）

目前，我國(guó)生物制藥行業(yè)最大的瓶頸就是如何從多樣化的發(fā)酵液中提取出高純度的微生物活性物質(zhì)，由于發(fā)酵液中具有超多成分不明且極其復(fù)雜的微生物生理活性物質(zhì)，并且具有很多次級(jí)代謝物質(zhì)，所以在進(jìn)行微生物制藥時(shí)，發(fā)酵液的分離純化過(guò)程是最重要的環(huán)節(jié)，也可以稱(chēng)作發(fā)酵液的后處理，而我國(guó)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的科研證明分離純化的過(guò)程所需要的費(fèi)用成本極高，所以實(shí)現(xiàn)微生物分離純化的經(jīng)濟(jì)性與有效性成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。近年來(lái)，我國(guó)有眾多學(xué)者探討了微生物的分離純化技術(shù)，文獻(xiàn)[1]通過(guò)PDA 培養(yǎng)基劃線(xiàn)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了霉變微生物的精準(zhǔn)及快速分離純化；文獻(xiàn)[2]通過(guò)硫酸銨分級(jí)分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了耐熱性較好的尖孢鐮刀菌M1 的有效分離純化；文獻(xiàn)[3]通過(guò)多種技術(shù)組合的方法，實(shí)現(xiàn)了噬菌體的有效分離純化；文獻(xiàn)[4]通過(guò)膜分離技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了甘草酸提取液的低成本分離純化；文獻(xiàn)[5]研究了尿素包合技術(shù)、分子蒸餾技術(shù)等時(shí)下常見(jiàn)的α-亞麻酸分離純化技術(shù)，并總結(jié)了相關(guān)原理和優(yōu)缺點(diǎn)，為后續(xù)科研提供參考。但是上述幾種方法進(jìn)行分離純化的效果不佳。本文借閱相關(guān)參考資料，通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂對(duì)微生物制藥分離純化技術(shù)進(jìn)行了深入分析。

1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器設(shè)備

大孔吸附樹(shù)脂[6]是近年來(lái)發(fā)展十分迅速的有機(jī)吸附劑，它的結(jié)構(gòu)特別，為大孔網(wǎng)狀，并且此樹(shù)脂中沒(méi)有交換基因，所以深受食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的喜愛(ài)。所以本文利用大孔吸附樹(shù)脂于蘭州理工大學(xué)的生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了8 種微生物藥品的分離純化實(shí)驗(yàn)，本次實(shí)驗(yàn)選取的這8 種微生物藥品包括：頭孢氨芐、金擔(dān)子素A 和莫能菌素為代表的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素、多肽類(lèi)抗生素和聚醚類(lèi)抗生素，本次實(shí)驗(yàn)中分別按順序標(biāo)記為A、B、C；由羅紅霉素、柔紅霉素和卡那霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、蒽環(huán)類(lèi)抗生素和氨基糖苷類(lèi)抗生素，本次實(shí)驗(yàn)中分別按順序標(biāo)記為D、E、F；還有由SMTP-3 以及青霉素為代表的含氮雜環(huán)類(lèi)抗生素和多烯類(lèi)抗生素，本次試驗(yàn)中分別按順序標(biāo)記為G、H。

本次實(shí)驗(yàn)所用到的儀器包括：電子天平AG245；恒溫振蕩器KO2525S；高效液相色譜儀AGILENT1260；高效液相色譜（HPLC）；真空烘箱DN50；超聲波清洗器KQ-250DE；層析柱25×200 mm；50 mL 和100 mL 的具塞錐形瓶；50 mL 和100 mL 的燒杯；10 mL 的高型稱(chēng)量瓶；15 mL 的扁形稱(chēng)量瓶。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法及過(guò)程

實(shí)驗(yàn)前將這8 種微生物藥物分別準(zhǔn)確稱(chēng)取55 mL的濃度為10 mg/ mL 的發(fā)酵液，放入KO2525S 恒溫振蕩器中震蕩6 h，震蕩完畢再靜置1 h。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始首先需要在各微生物發(fā)酵液[7]的不同發(fā)酵階段分別加入大孔吸附樹(shù)脂，大孔吸附樹(shù)脂的多次添加是為了實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液的純化。發(fā)酵起始階段于滅菌前的培養(yǎng)基內(nèi)直接添加大孔吸附樹(shù)脂[8]，由于各微生物藥物的性質(zhì)不同，不可以使用相同的大孔吸附樹(shù)脂及洗脫劑進(jìn)行分離純化，那么本次選取的8 種微生物藥物中實(shí)際添加大孔吸附樹(shù)脂情況如表1所示。

表1 大孔吸附樹(shù)脂實(shí)際添加情況Tab.1 Actual addition of macroporous adsorption resin

發(fā)酵初始階段加入大孔吸附樹(shù)脂，可以確定這8 類(lèi)藥物分離純化出的活性物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外的分布情況。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行24 h，再以同樣的方法在各培養(yǎng)基中再次添加大孔吸附樹(shù)脂[9]，此次添加可以提升藥物純化后產(chǎn)物的穩(wěn)定性，并且可以提高純化產(chǎn)量。當(dāng)發(fā)酵終止后，以相同方法直接于培養(yǎng)基的上清液中分別加入不同的大孔吸附樹(shù)脂，添加完畢后攪拌溶液并放置12 h，然后對(duì)此溶液進(jìn)行提取操作，獲得提取液。由于各活性物質(zhì)的性質(zhì)不同，同樣不可以使用相同的溶劑對(duì)提取液進(jìn)行洗脫，表2 為各活性物質(zhì)中添加去雜質(zhì)溶劑和洗脫劑的實(shí)際情況。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)多次加入大孔吸附樹(shù)脂，來(lái)獲取各微生物藥物的提取液；再根據(jù)提取液中各活性物質(zhì)的實(shí)際情況，分別用表2所示不同的去雜質(zhì)溶劑和洗脫劑，進(jìn)行梯度洗脫；最后將洗脫液進(jìn)行真空濃縮，通過(guò)制備性HPLC 純化獲取微生物單品。

表2 去雜質(zhì)溶劑和洗脫劑實(shí)際添加情況Tab.2 Actual addition of de impurity solvent and eluent

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

為了在微生物制藥分離純化實(shí)驗(yàn)中，使大孔吸附樹(shù)脂提取效果達(dá)到最佳，首先需要討論出提取時(shí)間與提取溫度對(duì)提取量的影響，然后基于最佳提取時(shí)間和提取溫度分析大孔吸附樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附與解吸效果，并獲取微生物藥品的活性物質(zhì)純度。以本次實(shí)驗(yàn)中的聚醚類(lèi)抗生素分離純化獲取腐霉素為例。

2.1 提取量與提取時(shí)間的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄了不同提取時(shí)間與腐霉素提取量的關(guān)系，如圖1所示。

圖1 提取時(shí)間對(duì)腐霉素提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction amount of Pythium

從圖1 可以看出，隨著提取時(shí)間的增長(zhǎng)，腐霉素的提取量也逐漸變多，但是提取量增加的程度逐漸變緩。這是因?yàn)榇罂孜綐?shù)脂的作用機(jī)理是物理性吸附，其本質(zhì)是發(fā)酵液中的物質(zhì)表面分子的高度不同且受力不等，大孔吸附樹(shù)脂的多孔性結(jié)構(gòu)就可以對(duì)此物質(zhì)進(jìn)行篩選，形成了表面的吸附現(xiàn)象，但隨著吸附物質(zhì)容量的增加，孔表的疏水性逐漸降低，所以隨著時(shí)間的增加，大孔吸附樹(shù)脂對(duì)腐霉素的提取能力逐漸降低，腐霉素提取量的增長(zhǎng)程度逐漸變緩。而且由于大孔吸附樹(shù)脂的物理吸附及篩選原理，使其分離純化效果較其他方法穩(wěn)定性更高、提取速度更快、提取容量更大等。但是當(dāng)提取時(shí)間增加到150 min 時(shí)，由于大孔吸附樹(shù)脂的吸附能力已達(dá)到完全，所以腐霉素的提取量不會(huì)再隨時(shí)間變化而變化。由此可以證明，采取大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行微生物制藥分離純化時(shí)，將提取時(shí)間控制在150 min 效果最好。

2.2 提取量與提取溫度的關(guān)系

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄了不同提取溫度下提取量的變化，如圖2所示。

由圖2 可知，在0～30℃的溫度下進(jìn)行腐霉素的提取，提取的含量會(huì)隨著溫度升高而增加，并且提取量增加的程度逐漸急劇上升。這是由于大孔吸附樹(shù)脂孔表的疏水性隨溫度提高而增加，所以隨著溫度的提高，大孔吸附樹(shù)脂對(duì)腐霉素的提取能力逐漸提升，腐霉素提取量的增長(zhǎng)程度逐漸變陡；當(dāng)溫度控制在30～40℃時(shí)，孔表的疏水性已經(jīng)到達(dá)最大值，此時(shí)大孔吸附樹(shù)脂的提取能力也最佳，所以此時(shí)腐霉素提取量不會(huì)隨著溫度的提高而變化；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，在40℃以上時(shí)，孔表的疏水性受高溫影響而下降，此時(shí)大孔吸附樹(shù)脂的提取能力也降低，所以此時(shí)腐霉素提取量隨溫度的提高而減少。由此可以證明，在利用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行微生物制藥分離純化時(shí)，提取溫度控制在30～40℃范圍內(nèi)提取效果最佳。

2.3 大孔吸附樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附與解吸效果

本次實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[10]，設(shè)計(jì)大孔樹(shù)脂的吸附率、吸附量、解吸率、解析量的公式如式（1）～（4）所示。

式中fx（%）——大孔吸附樹(shù)脂的吸附率數(shù)據(jù)；

Cxy——聚醚類(lèi)抗生素的原始發(fā)酵液濃度數(shù)據(jù)；

Cxc——聚醚類(lèi)抗生素的發(fā)酵液分離純化后的殘液濃度數(shù)據(jù)；

Lx——大孔吸附樹(shù)脂的吸附量數(shù)據(jù)；

vm——實(shí)驗(yàn)使用的聚醚類(lèi)抗生素的溶液體積；

m——實(shí)驗(yàn)消耗的大孔吸附樹(shù)脂的干重質(zhì)量數(shù)據(jù)；

fj（%）——解吸率數(shù)據(jù)；

Lj——解吸量數(shù)據(jù)；

Cjy——實(shí)驗(yàn)使用的解吸液中聚醚類(lèi)抗生素濃度；

vj——實(shí)驗(yàn)使用的解吸液總體積。

本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)濕法裝柱技術(shù)，將樹(shù)脂床體積為50 mL 的大孔吸附樹(shù)脂裝入層析柱，然后以5 BV/h的流速，處理12 倍樹(shù)脂床體積（12 BV）的物料液，每吸附1 倍樹(shù)脂床體積的物料液，就將此時(shí)的流出液收集起來(lái)，然后利用公式（1）、（2）測(cè)算出里面的腐霉素濃度，那么流出液的腐霉素濃度與上樣液的體積變化如圖3所示。

圖3 大孔吸附樹(shù)脂的動(dòng)態(tài)吸附效果Fig.3 Dynamic adsorption effect of macroporous adsorption resin

由圖3 可知，大孔吸附樹(shù)脂在吸附此濃度的聚醚類(lèi)抗生素發(fā)酵液時(shí)，當(dāng)樹(shù)床體積為2 BV 時(shí)開(kāi)始發(fā)生泄漏現(xiàn)象，并且當(dāng)樹(shù)脂吸附12 BV 時(shí)就處于飽和狀態(tài)，流出液中的腐霉素濃度曲線(xiàn)在6 BV 前上升較快，7 BV 開(kāi)始上升較為平緩，這說(shuō)明了吸附柱中大孔吸附樹(shù)脂被吸附腐霉素濃度是從上到下遞增的，大孔樹(shù)脂的吸附性能必須在飽和狀態(tài)下才可以完全發(fā)揮。吸附試驗(yàn)之后，需要用蒸餾水進(jìn)行清洗去雜質(zhì)，然后再分別用1 BV、2 BV、3 BV、4 BV、5 BV、6 BV 的50%甲醇溶液進(jìn)行洗脫，然后利用公式（3）、（4）測(cè)算出每次流出液中洗脫出的腐霉素容量，那么流出液洗脫出的腐霉素質(zhì)量與洗脫劑總?cè)萘康年P(guān)系如圖4所示。洗脫率較高，所以在進(jìn)行基于大孔吸附樹(shù)脂的微生物制藥分離純化實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要使用100% 的甲醇溶液作為洗脫劑。但表3 中這5 種濃度的甲醇洗脫劑，其獲取的腐霉素純度均較高，最高可達(dá)98.99%，所以基于大孔吸附樹(shù)脂的微生物制藥分離純化技術(shù)，可以獲得純度較高的活性物質(zhì)。

圖4 大孔吸附樹(shù)脂的洗脫曲線(xiàn)圖Fig.4 Elution curve of macroporous adsorption resin

表3 大孔樹(shù)脂分離純化效果Tab.3 Separation and purification effect of macroporous resin

由圖4 可知，隨著甲醇洗脫劑的容量增加，腐霉素的解析量也隨之提高，洗脫劑體積在4 BV 以前，洗脫出的腐霉素質(zhì)量幾乎呈直線(xiàn)上升狀態(tài)，當(dāng)洗脫劑體積大于4 BV 時(shí)，洗脫出的腐霉素質(zhì)量已經(jīng)不變，這種情況下增加洗脫劑容量毫無(wú)意義，所以基于對(duì)成本費(fèi)用的考慮，本次實(shí)驗(yàn)使用4 BV 的洗脫劑就可以將腐霉素全部洗脫出來(lái)。

2.4 腐霉素的提取純度

不只是提取時(shí)間與提取溫度會(huì)影響大孔樹(shù)脂的分離純化效果，還存在上樣速度、上樣濃度等影響條件，但只要采取合適的上樣條件，就會(huì)對(duì)大孔樹(shù)脂的分離純化效果有利。本次實(shí)驗(yàn)基于上次討論的相關(guān)實(shí)驗(yàn)條件下，按照文中1.2 的試驗(yàn)方法及過(guò)程獲取到510 mL 聚醚類(lèi)抗生素提取物，并且此提取物中腐霉素含量是45.5mg/mL，上樣濃度是329 mg/mL，上樣質(zhì)量是49.8g，先進(jìn)行水洗去雜質(zhì)操作后，再利用4 BV 的10%、30%、50%、80%、100%的甲醇洗脫劑分別進(jìn)行洗脫操作，各梯度以5 BV/h 的速度進(jìn)行洗脫，然后將洗脫得到的溶液進(jìn)行真空濃縮回收并凍干后，測(cè)算里面腐霉素的含量，結(jié)果如表3所示。

考慮微生物藥品分離純化的經(jīng)濟(jì)性以及環(huán)保性，本次實(shí)驗(yàn)選取無(wú)副作用且殘留較少的甲醇溶液，作為實(shí)驗(yàn)洗脫劑。由表3 可知，10%、30%與80%的甲醇溶液的洗脫率較低，而50%與100%的甲醇溶液

3 結(jié)束語(yǔ)

據(jù)相關(guān)資料統(tǒng)計(jì)，微生物制藥工程中發(fā)酵液的分離純化所需費(fèi)用非常高，促進(jìn)微生物制藥的經(jīng)濟(jì)性發(fā)展至關(guān)重要。而大孔吸附樹(shù)脂誕生后，由于其成本低、易再生等特點(diǎn)，在生物制藥的分離純化工程中被廣泛使用。并且通過(guò)本文微生物藥品分離純化實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，驗(yàn)證了大孔吸附樹(shù)脂提取活性物質(zhì)的經(jīng)濟(jì)性與高效性，使用4 BV 的洗脫劑就可以將腐霉素全部洗脫出來(lái)，進(jìn)行基于大孔吸附樹(shù)脂的微生物制藥分離純化實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要使用100% 的甲醇溶液作為洗脫劑?；诖罂孜綐?shù)脂的微生物制藥分離純化技術(shù)，可以獲得純度較高的活性物質(zhì)。