黃準(zhǔn)成，趙 靜，呂文發(fā)*，王 軍*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)教育部國際合作聯(lián)合重點實驗室，吉林長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點實驗室，吉林長春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118)

外泌體(exosome,exos)是一種膜狀30 nm～200 nm大小的細(xì)胞囊泡，多存在于血液、腦脊液和組織液等體液中，含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA(MicroRNA)/mRNA(messenger RNA)和細(xì)胞因子等生物分子，參與細(xì)胞間的信號傳遞，在許多生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用[1]。在妊娠、免疫反應(yīng)、癌癥、心血管疾病和中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病等生理和病理中，由外泌體遞送的生物分子可有效地改變受體細(xì)胞的生物學(xué)反應(yīng)，促進(jìn)或抑制生理和病理過程[2]。近年來有關(guān)外泌體參與雄性生殖的研究，多集中于雄性器官來源外泌體在精子發(fā)生和睪酮合成過程及干細(xì)胞來源外泌體對陰莖狀態(tài)和精液冷凍的作用等方面[3-6]。本文總結(jié)了來自生殖器官和干細(xì)胞的外泌體對雄性生殖功能的影響，旨在為全面理解外泌體對雄性生殖的調(diào)控及機制提供參考。

1 外泌體的生物發(fā)生過程

外泌體的產(chǎn)生涉及質(zhì)膜的雙重內(nèi)陷和含有腔內(nèi)囊泡的細(xì)胞內(nèi)多泡體(multivesicular bodies,MVBs)的形成，主要過程是細(xì)胞內(nèi)吞蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA等生物信息物質(zhì)形成內(nèi)吞小泡，內(nèi)吞小泡相互融合形成早期內(nèi)體。在內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)中的ESCRT-0、ESCRT-Ⅰ和ESCRT-Ⅱ等蛋白的催化作用下，質(zhì)膜內(nèi)陷以出芽的方式形成小泡，再通過 ESCRT-Ⅲ進(jìn)行剪切，使早期內(nèi)體與質(zhì)膜分離形成MVBs[7]。MVBs通過(ras-associated binding family guanosine triphosphatases,Rab GTPase)家族蛋白(ras-related protein Rab-27A,Rab27a)和(ras-related protein Rab-27B,Rab27b)促進(jìn)靶向位點與其突觸結(jié)合蛋白4進(jìn)行結(jié)合，通過胞吐作用釋放外泌體到細(xì)胞外基質(zhì)[8]。除此之外,Rab GTPase家族其他相關(guān)蛋白腫瘤易感基因101蛋白、凋亡相關(guān)基因2-相互作用蛋白X、磷脂、四肽、神經(jīng)酰胺、鞘磷脂酶和可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體復(fù)合蛋白也參與外泌體的生物發(fā)生過程[9]。

2 生殖器官外泌體對雄性生殖的影響

2.1 前列腺外泌體對雄性生殖的影響

前列腺小體是前列腺上皮細(xì)胞腺泡腔分泌的細(xì)胞囊泡，是精液外泌體主要成分，在精子活力、精子獲能和頂體反應(yīng)等多種精子生理功能中發(fā)揮著重要作用。Arienti等[10]發(fā)現(xiàn)，前列腺小體可以在酸性環(huán)境中進(jìn)入人精子，改變精子質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)使質(zhì)膜的流動性降低。前列腺小體富含的Ca2+、Zn2+和Mg2+等二價陽離子通過pH依賴性融合機制，調(diào)節(jié)精子周圍離子的濃度，進(jìn)而影響精子的鞭毛活性[11]。前列腺小體還可提供鈣離子通道激活所需的鈣離子信號因子來影響精子活力[12]。除此之外，前列腺小體的蛋白具有抗氧化、抗菌和凝血等作用，其中凝血作用能防止精子與雌性生殖道內(nèi)血液接觸，通過抑制單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞吞噬作用來保護精子免受雌性生殖道中的免疫排斥[13]。在受精過程中，前列腺小體可為剝離或修飾覆蓋精子表面的糖蛋白、磷脂雙分子層中的雙向運動來改變精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和精子獲能等過程提供環(huán)磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)[14]。前列腺小體還能將膽固醇和鞘磷脂轉(zhuǎn)移到精子質(zhì)膜上以防止過早的頂體反應(yīng)[15]。這些研究表明，前列腺小體通過將脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及金屬陽離子作用到精子質(zhì)膜和鞭毛中，進(jìn)而影響精子質(zhì)膜流動性和精子活力，并為受精過程提供能量。

2.2 附睪外泌體對雄性生殖的影響

在睪丸中產(chǎn)生的精子并不具備受精能力，需要在附睪微環(huán)境作用下獲得運動和受精的能力。附睪小體是一種在附睪腔內(nèi)發(fā)現(xiàn)的由附睪上皮釋放的外泌體。研究發(fā)現(xiàn)，附睪具有兩個不同的附睪小體亞群，其中一個群體富含與活精子相互作用的運動相關(guān)蛋白1(motility-related protein1,MRP1,又稱CD9)和其他四肽蛋白二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase 4,DPP4,又稱,CD26)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma glutamyl transpeptidase,GGT,又稱CD224)[16]。CD9是附睪小體的主要蛋白質(zhì)，它與精子結(jié)合能影響精子功能。精子在附睪成熟過程中，富含CD9的附睪小體能將脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到精子膜中，改變精子質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)，使質(zhì)膜的流動性降低[17]。據(jù)報道，參與精卵相互作用的蛋白(bovine sperm 25 ku protein,P25b)、膠質(zhì)瘤發(fā)病機制相關(guān)蛋白1(glioma pathogenesis related 1 like protein 1,GliPr1L1)、巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)和醛糖還原酶(aldo-keto reductase 1 member B1,AKR1B1)在CD9附睪小體中高表達(dá)[18]。附睪小體與精子相互作用，其中MIF轉(zhuǎn)移到精子鞭毛外層致密纖維，并在精子在附睪成熟期間調(diào)節(jié)精子活力[19]。此外，富含精子結(jié)合蛋白1(epididymal sperm binding protein 1,ELSPBP1)的附睪小體亞群可將ELSPBP1與膽綠素還原酶(biliverdin reductase A，BLVRA)結(jié)合，通過NADPH將膽綠素還原為膽紅素，膽紅素利用活性氧在Zn2+存在下再生成膽綠素，通過這一過程保護活精子免受氧化應(yīng)激損傷[20]。附睪小體中的谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase 5,GPX5)能保護精子免受氧化應(yīng)激的損傷，并在附睪內(nèi)保護精子DNA完整性[21]。附睪小體含有將煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)轉(zhuǎn)化為煙酰胺腺嘌呤二磷酸氫化物(nicotinamide adenine diphosphate hydride,NADH)且將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖的多元醇途徑相關(guān)的酶，為精子提供能量[22]。綜上所述，附睪小體可通過減少氧化應(yīng)激來保護精子，也能為精子提供能量。

附睪小體中還含有由糖基-磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)連接的生殖調(diào)節(jié)蛋白，主要參與精子與透明帶的結(jié)合。例如，精子黏附分子1(sperm adhesion molecule1,SPAM1，也稱為PH-20)和GliPriL1，通過GPI與精子結(jié)合，增加精子通過卵母細(xì)胞周圍卵丘層的穿透力，從而參與精子與透明帶的相互作用[23-24]。透明帶(zona pellucida,ZP)家族蛋白中的透明帶3受體(zona pellucida 3 receptor,ZP3R)和透明帶結(jié)合蛋白2(zona pellucida binding protein 2,ZPBP2)也在小鼠附睪小體中表達(dá)，ZP蛋白通過影響與透明帶的相互作用來影響精子受精[25]。這些研究表明，附睪小體蛋白質(zhì)可通過影響精子與透明帶的結(jié)合，影響精子受精。

2.3 睪丸外泌體對雄性生殖的影響

睪丸主要含有支持細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和精原干細(xì)胞等細(xì)胞，各個細(xì)胞之間相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，支持細(xì)胞外泌體在促進(jìn)精原干細(xì)胞分化和影響間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌等方面具有重要作用。支持細(xì)胞分泌的外泌體含有miRNA-486，其可從支持細(xì)胞轉(zhuǎn)移到精原干細(xì)胞，并通過直接靶向人第10號染色體缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN),促進(jìn)精原干細(xì)胞分化[26]。支持細(xì)胞外泌體還可通過降低活性氧(ROS)的累積來緩解電磁場誘導(dǎo)的小鼠精原干細(xì)胞氧化應(yīng)激[27]。Liang等[4]發(fā)現(xiàn)，未成熟的支持細(xì)胞外泌體可通過miRNA-145-5p直接靶向抑制睪丸間質(zhì)細(xì)胞中類固醇生成因子1(functional analysis of steroidogenic factor 1,SF-1)的表達(dá)，誘導(dǎo)脂滴積聚，最終抑制睪酮的合成。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)，促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)可通過睪丸支持細(xì)胞外泌體途徑促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成(未發(fā)表數(shù)據(jù))。綜上，支持細(xì)胞可通過外泌體途徑調(diào)控精原干細(xì)胞的分化和氧化應(yīng)激及間質(zhì)細(xì)胞睪酮的合成。

3 干細(xì)胞外泌體與雄性生殖

干細(xì)胞具有多能性，負(fù)責(zé)機體的生長、體內(nèi)平衡和老化或受損組織的修復(fù)等生理過程，是機體內(nèi)部修復(fù)系統(tǒng)的組成部分[28]。干細(xì)胞來源的外泌體與干細(xì)胞有相同的治療和再生功能，在恢復(fù)雄性生殖潛能上具有重要作用。

3.1 脂肪組織干細(xì)胞外泌體對雄性生殖的影響

脂肪組織干細(xì)胞外泌體(exosomes from adipose derived stem cell,ADSC-exos)可減輕海綿體神經(jīng)的損傷，恢復(fù)陰莖勃起功能[29-30]。Chen等[29]證明ADSC-exos可通過增加內(nèi)皮標(biāo)志物血小板/內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(platelet/endothelial cell adhesion molecule-1,PECAM-1,又稱CD31)、平滑肌標(biāo)志物和抗凋亡蛋白 B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2) 的表達(dá)，降低凋亡細(xì)胞因子的表達(dá)以及增加大鼠海綿體中平滑肌與膠原蛋白的比率來緩解2型糖尿病大鼠勃起功能障礙。Li等[30]證實ADSC-exos治療可增加陰莖背神經(jīng)和主要骨盆神經(jīng)節(jié)中的神經(jīng)元一氧化氮合酶和血管內(nèi)皮生長因子(endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)，從而在一定程度上改善勃起功能。這些研究可為陰莖勃起障礙的治療提供新的思路。

精液冷凍會降低精子質(zhì)量，最終影響受精能力，因此減少冷凍精子受損和修復(fù)受損的精子是提高解凍后精子活力的關(guān)鍵。ADSC-exos在冷凍保存過程中具有保護精子和修復(fù)受損精子的功能，Ahmad等發(fā)現(xiàn)，ADSC-exos能提高比格犬冷凍精液的精子活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性，促進(jìn)精子中與質(zhì)膜修復(fù)相關(guān)的基因膜聯(lián)蛋白1(annexin 1,ANX1)、纖維連接蛋白1(fibronectin 1,FN1)和囊泡融合蛋白(dysferlin,DYSF)和線粒體活性氧調(diào)節(jié)劑1基因表達(dá)[31]。

3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對雄性生殖的影響

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell,MSCs)具有多能性和低免疫原性，參與組織修復(fù)以及遷移到受損部位后的再生等能力，其分泌的外泌體對海綿狀神經(jīng)損傷大鼠模型勃起功能有治療作用。Ouyang等[32]發(fā)現(xiàn)，MSC-exos 治療增強了海綿體內(nèi)的平滑肌和神經(jīng)元一氧化氮合酶含量，并提高了海綿體內(nèi)平滑肌與膠原蛋白的比例。此外，MSC-exos處理可導(dǎo)致體內(nèi)和體外培養(yǎng)的海綿體平滑肌細(xì)胞活力增加和促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteine proteases-3，caspase-3)表達(dá)降低。海綿體內(nèi)注射MSC-exos可促進(jìn)陰莖中海綿竇內(nèi)皮形成，減少組織氧化應(yīng)激損傷，從而改善動脈粥樣硬化、外傷和手術(shù)引起的勃起功能障礙[33]。Li等[30]證明，在雙側(cè)海綿體神經(jīng)損傷的小鼠中使用MSC-exos治療可增加平均海綿體內(nèi)壓/平均動脈壓比值，并改善勃起功能。此外，MSC-exos 還可通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又稱AKT) 信號通路來改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的睪丸生精功能障礙[34]。在大鼠新鮮精液中添加MSC-exos能增加冷凍精子的抗氧化能力和精子活力，減少由冷凍引起的精子細(xì)胞凋亡和壞死[35]。這些研究表明MSC-exos具有與ADSC-exos相近的功能，都具有恢復(fù)陰莖勃起和提高精子抗凍能力的作用。

3.3 其他來源外泌體對雄性生殖的影響

尿源干細(xì)胞(exosomes from urine-derived stem cells,USC-exos)治療36d后非梗阻性無精子癥(nonobstructive azoospermia,NOA)小鼠恢復(fù)了精子發(fā)生，并且精子發(fā)生相關(guān)基因八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(octamer binding transcription factor 4,OTC4又稱Pou5f1)、魚精蛋白1(protamine1,Prm1)、聯(lián)會復(fù)合體蛋白3(synaptonemal complex protein-3,SYCP3)和無精癥缺失基因(azoospermialike，DAZL)表達(dá)量增加[36]。白消安誘導(dǎo)的NOA大鼠睪丸中注射羊水來源的外泌體能促進(jìn)精子的生成[37]。

4 展望

雄性生殖器官的外泌體對精子至關(guān)重要，干細(xì)胞來源的外泌體也可通過旁分泌方式參與調(diào)控陰莖和睪丸的生理和病理過程及保護精子。目前外泌體在雄性生殖中的許多具體功能和機制還有待進(jìn)一步研究，例如雄性生殖器官外泌體中還含有大量生物分子，其與精子發(fā)生等生理過程的關(guān)系尚不清楚；不同來源外泌體是否能提高凍融精子的受精能力?？傊饷隗w對雄性生殖功能有重要調(diào)控作用，揭示這些作用及機制對提高雄性生殖功能具有重要意義。