邱茜茜，戚南山，李 易，李 娟，廖申權(quán)，呂敏娜，蔡海明，林栩慧，胡俊菁，肖文婉，張健騑，張 旭，孫銘飛*

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所，嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510640)

雞球蟲病(Avian coccidiosis)是由頂復(fù)門(Apicomplexa)孢子綱(Sporozoasida)艾美耳科(Eimeriidae)艾美耳屬(Eimeria)的多種球蟲引起雞的一種腸道原蟲病，球蟲主要寄生于雞的腸上皮細(xì)胞內(nèi)，初次在禽類腸道發(fā)現(xiàn)距今已有100多年歷史，其對雞的危害十分嚴(yán)重。雞球蟲病在世界各地均有發(fā)生每年造成的全球經(jīng)濟(jì)損失超過35億美元[1]。雞感染球蟲后會表現(xiàn)出血性、壞死性腸炎和血痢等癥狀[2]。同時，球蟲的亞臨床感染也十分常見，多影響食物轉(zhuǎn)化率、平均日增重和出欄時間等關(guān)鍵生產(chǎn)參數(shù)。

目前雞球蟲病的防控主要依賴化學(xué)抗球蟲藥、活卵囊疫苗和飼養(yǎng)管理等策略。隨著抗雞球蟲病藥物的大量使用，耐藥蟲株日漸增多，藥物殘留等弊端也日益明顯，大大限制了抗雞球蟲病藥物的應(yīng)用[3]。免疫預(yù)防在后抗生素時代逐漸成為控制雞球蟲病的替代方法。目前的抗雞球蟲病疫苗主要以強(qiáng)毒或減毒活卵囊疫苗為主，但二者都存在一定的缺陷[4]，強(qiáng)毒活卵囊疫苗不適當(dāng)?shù)氖褂每赡軙?dǎo)致球蟲病暴發(fā)或?qū)⑿碌膹?qiáng)毒球蟲蟲株引入養(yǎng)殖場，而弱毒活卵囊疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)；此外，所有活卵囊疫苗的應(yīng)用都屬于感染性免疫，存在影響免疫雞體腸道健康的潛在危機(jī)。因此，新一代安全高效的球蟲防控策略亟待改善。

隨著各種基因工程技術(shù)的發(fā)展，疫苗研究的方向正逐漸從傳統(tǒng)滅活苗和弱毒苗向基因工程疫苗過渡。目前正在研發(fā)或已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的基因重組疫苗主要包括核酸疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和合成肽疫苗等[5]。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因重組疫苗具有安全、穩(wěn)定、高效、易于制備等特點(diǎn)。在本綜述中，總結(jié)了現(xiàn)有的抗雞球蟲病措施，探索了可用于重組抗雞球蟲病疫苗的候選方案。

1 當(dāng)前抗雞球蟲病主要措施

1.1 抗雞球蟲病藥物

大量研究表明，藥物仍是防治球蟲病的主要措施與手段。當(dāng)前抗雞球蟲病藥物(表1)包括聚醚類離子載體抗生素、化學(xué)合成藥[3]及中草藥。

表1 常用抗球蟲藥

聚醚類離子載體抗生素由放線菌(Actinomaduraspp.)或鏈霉菌(Streptomycesspp.)發(fā)酵產(chǎn)生，主要作用于球蟲無性繁殖與有性繁殖階段，通過干擾球蟲細(xì)胞內(nèi)陽離子的正常交換，破壞細(xì)胞內(nèi)外滲透壓，致使細(xì)胞死亡。由于其具有廣譜抗雞球蟲病作用，被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)雞業(yè)。

化學(xué)合成類抗雞球蟲病藥主要通過抑制球蟲線粒體呼吸作用、干擾球蟲二氫葉酸的合成或競爭性抑制硫胺攝取等方式來阻滯球蟲的正常發(fā)育。

近年來，球蟲對聚醚類抗生素和化學(xué)藥物的耐藥愈發(fā)普遍。研究發(fā)現(xiàn)，我國各地的柔嫩艾美耳球蟲對聚醚離子載體類抗生素和化學(xué)抗雞球蟲病藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性[6]。黃儀娟[7]等通過對分離得到的6株雞艾美耳球蟲蟲株進(jìn)行耐藥性試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)6株蟲株均呈現(xiàn)中度或重度耐藥。

盡管抗雞球蟲病藥物在雞球蟲病的防控中發(fā)揮著巨大作用，但不可避免的耐藥性問題以及當(dāng)前全面減抗替抗背景下對抗雞球蟲病藥物使用的限制，消費(fèi)者對食品中化學(xué)殘留物的擔(dān)憂，阻礙了大多數(shù)抗雞球蟲病新藥的開發(fā)。

1.2 活卵囊疫苗

艾美耳球蟲活卵囊疫苗由未減毒或減毒的艾美耳球蟲蟲株研制而成，可以有效替代化學(xué)藥物用于預(yù)防雞球蟲病，雞在攝入和循環(huán)受控劑量的疫苗卵囊后，可以獲得堅(jiān)強(qiáng)的免疫保護(hù)[8]。由于疫苗株的生產(chǎn)需要通過在雞中獨(dú)立傳代多次，抗雞球蟲病疫苗在家禽業(yè)的應(yīng)用受到了很大限制。對于生產(chǎn)能力的高要求，也意味著疫苗成本遠(yuǎn)高于抗雞球蟲病藥[5]。

活卵囊疫苗也存在一定的缺陷。接種疫苗有引入新蟲株的風(fēng)險(xiǎn)；活卵囊會引起雞輕微腸道病變，影響飼料轉(zhuǎn)化率；由于球蟲卵囊較大，易沉積，添加懸浮劑后若不混勻，極易造成免疫不均，影響免疫效果。在免疫期間禁止使用抗球蟲藥，飼料中也不能含有抗球蟲藥物。以上因素的存在限制了球蟲疫苗在養(yǎng)殖戶中的廣泛應(yīng)用。

1.3 基因重組疫苗

基因重組疫苗主要有核酸疫苗、亞單位疫苗和活載體疫苗等 。核酸疫苗是將含有編碼抗原基因序列的質(zhì)粒載體，通過肌肉注射或用基因槍等導(dǎo)入宿主體內(nèi)，被宿主的組織細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞或其他炎性細(xì)胞攝取，抗原蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，從而達(dá)到防治疾病的目的[9]。亞單位疫苗是通過基因重組技術(shù)，調(diào)取病原微生物保護(hù)性抗原基因并導(dǎo)入表達(dá)系統(tǒng)，在其高效表達(dá)后提取保護(hù)性抗原，加入佐劑制成的重組亞單位疫苗[10]。CoxAbic是第一個商業(yè)化的球蟲病亞單位疫苗。由從巨型艾美耳球蟲(E.maxima)分離到的親和純化的配子母細(xì)胞抗原(affinity purified sexual stage (gametocyte) antigens,APGA)組成[11]。接種蛋雞后其抗球蟲作用可通過蛋垂直傳播給下一代?；钶d體疫苗主要是利用分子生物學(xué)手段，將目的抗原的編碼基因?qū)爰?xì)菌或病毒活載體，隨著重組菌(毒)株在宿主體內(nèi)增殖，目的基因大量表達(dá)，從而誘發(fā)相應(yīng)的免疫保護(hù)應(yīng)答[12]。自20世紀(jì)80年代有關(guān)于重組疫苗開發(fā)的報(bào)道以來，多個研究小組已經(jīng)嘗試和試驗(yàn)了多種候選抗原。據(jù)報(bào)道，在免疫球蟲抗原重組蛋白、重組球蟲抗原DNA疫苗及聯(lián)合病毒活載體的球蟲抗原疫苗的小規(guī)模試驗(yàn)中，球蟲卵囊計(jì)數(shù)或腸道損傷評分降低了30%～90%，或者在飼料轉(zhuǎn)化率或相對增重率方面得到了改善[13]。

2 抗雞球蟲病基因重組疫苗研究進(jìn)展

當(dāng)前抗雞球蟲病基因重組疫苗的研究主要集中于抗原蛋白的選擇與細(xì)胞因子佐劑的聯(lián)合使用。同時，艾美耳球蟲復(fù)雜的抗原多樣性對基因重組疫苗的研制造成了一定的阻礙，選擇合適的抗原是開發(fā)新型基因重組疫苗的關(guān)鍵。

2.1 候選抗原蛋白分子研究進(jìn)展

在宿主與蟲體互作中發(fā)揮重要作用的蛋白被確定為抗雞球蟲病疫苗候選蛋白，這是由于這些蛋白在球蟲入侵與增殖過程中自然暴露，因此可以作為宿主免疫應(yīng)答的靶標(biāo)[10]。

研究最廣泛的是微線體蛋白，微線體位于頂復(fù)門寄生蟲頂端，可分泌頂膜抗原(apical membrane antigen,AMAs)、微線體蛋白(microneme proteins,MICs)等，對寄生蟲的滑行運(yùn)動與黏附宿主細(xì)胞以及進(jìn)出受感染細(xì)胞至關(guān)重要[14]。MICs在入侵早期分泌，幫助寄生蟲附著于宿主細(xì)胞，為入侵創(chuàng)造平臺[15]。對柔嫩艾美耳球蟲的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AMAs蛋白在子孢子階段和裂殖子階段均存在。研究發(fā)現(xiàn)AMA1是子孢子入侵宿主的關(guān)鍵蛋白，是形成蟲體與宿主細(xì)胞間環(huán)形運(yùn)動結(jié)合體(moving junction,MJ)不可缺少的一部分[16]。

SO7蛋白又稱RB1或GX3262，位于子孢子折光體上，作為重組蛋白、核酸疫苗或以鼠傷寒沙門氏菌為載體時，可誘導(dǎo)部分保護(hù)性免疫。研究發(fā)現(xiàn)柔嫩艾美耳蟲重組折光體蛋白EtSO7能有效誘導(dǎo)免疫雞產(chǎn)生細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)，對盲腸感染球蟲的雞有明顯的保護(hù)作用[17]。

TA4蛋白位于柔嫩艾美耳球蟲子孢子表面，研究發(fā)現(xiàn)抗TA4抗原的單克隆抗體會對雞球蟲子孢子入侵細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，表明TA4抗原可能在球蟲入侵宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用[18]。近年來大量研究也證實(shí)，以 TA4 基因編碼的蛋白免疫雞只，能夠收到良好的抗球蟲效果。IMP1定位于子孢子細(xì)胞膜，現(xiàn)已作為候選抗原被廣泛研究。近年來，IMP1蛋白被先后確定為巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲的疫苗候選分子[19-20]。3-1E蛋白是研究最多的抗雞球蟲病亞單位疫苗抗原。其主要與肌動蛋白單體結(jié)合，延緩肌動蛋白聚合作用，同時也在弓形蟲的滑行運(yùn)動中發(fā)揮重要作用。它還是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)5、11和12的配體，這些受體在許多胞內(nèi)病原微生物(如弓形蟲)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]，這表明3-1E蛋白可作為一種新的黏膜佐劑。研究發(fā)現(xiàn)免疫艾美耳球蟲3-1E蛋白增強(qiáng)了小鼠對急性靜脈病毒感染的抵抗力[22]。將艾美耳球蟲3-1E蛋白、產(chǎn)氣莢膜梭菌NetB蛋白與Montanide IMS佐劑聯(lián)合應(yīng)用，在巨型艾美耳球蟲和產(chǎn)氣莢膜梭菌共感染動物試驗(yàn)中，增強(qiáng)了對于壞死性腸炎的抵抗效果[23]。

乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)作為無氧糖酵解途徑的末端酶，對寄生蟲在宿主體內(nèi)的生命活動有較大影響。研究表明，每種球蟲僅有一種LDH，因此常被用以鑒別艾美耳球蟲蟲種。分析柔嫩艾美耳球蟲(E.tenella)、巨型艾美耳球蟲(E.maxima)和堆型艾美耳球蟲(E.acervulina)的LDH氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其同源性為66%～80%，且其蛋白表達(dá)水平在球蟲發(fā)育各階段無明顯差異，具有作為疫苗候選抗原的潛力[24]。

2.2 細(xì)胞因子佐劑研究進(jìn)展

細(xì)胞因子具有廣泛的生物學(xué)活性，在調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，由抗原或其他刺激劑誘導(dǎo)多種細(xì)胞產(chǎn)生。大量研究表明將細(xì)胞因子作為佐劑與球蟲疫苗聯(lián)合使用，可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞活性，增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)力和機(jī)體的免疫水平。通過將球蟲保護(hù)性抗原與相應(yīng)細(xì)胞因子連接構(gòu)建表達(dá)載體，可以有效改善基因重組疫苗的缺點(diǎn)。

白介素(IL-2、IL- 12、IL-18)、干擾素(IFN-α、IFN-γ)和腫瘤生長因子(tumor growth factor,TGF)b4等被廣泛用作基因重組疫苗的佐劑。在加入IFN-α和淋巴細(xì)胞趨化因子后，感染堆型艾美耳球蟲雞的飼料轉(zhuǎn)化率得到了顯著提高，而IL-1β、IL-8、IL-15、IFN-γ、TGFb4和淋巴細(xì)胞趨化因子則可降低球蟲的復(fù)制。細(xì)胞因子的劑量和類型也會影響局部免疫反應(yīng)的質(zhì)量。研究表明，聯(lián)合注射pcDNA3.1-IL-2重組質(zhì)粒對雞球蟲疫苗免疫具有增效作用[25]。近年來，IL-2被證實(shí)可與多種艾美耳球蟲抗原相結(jié)合，如TA4、SO7以及堆型艾美耳球蟲抗原cSZ-2，表明IL-2的聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)基因重組疫苗誘導(dǎo)的免疫保護(hù)效果。

2.3 抗原多樣性

了解球蟲基因組遺傳多樣性的程度與研究其野外生存和進(jìn)化能力高度相關(guān)。在外界選擇壓力的變化下，適應(yīng)的速度對球蟲的生存至關(guān)重要，常受到遺傳多樣性的影響。Emily等[26]對248條來源于堆型、巨型和柔嫩艾美耳球蟲的ITS1-5.8S-ITS2序列的固定系數(shù)(FST)進(jìn)行了比較，結(jié)果表明其存在顯著的種內(nèi)多樣性，其中柔嫩艾美耳球蟲可能存在地域差異。艾美耳球蟲的遺傳多樣性和復(fù)雜的生命周期使基因重組疫苗的研制成為一項(xiàng)艱巨的任務(wù)[27]。

迄今為止，各界學(xué)者僅對少數(shù)艾美耳球蟲的候選疫苗抗原進(jìn)行了詳細(xì)的序列分析以確定其多樣性。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巨型艾美耳球蟲頂膜抗原EmAMA1作為DNA疫苗或細(xì)菌載體重組蛋白疫苗進(jìn)行免疫時，可誘導(dǎo)強(qiáng)大的同源免疫保護(hù)作用[19]。此外，對來自中國、埃及、德國、印度、日本、利比亞、尼日利亞、英國、美國和委內(nèi)瑞拉的56份柔嫩艾美耳球蟲現(xiàn)場樣本的EtAMA1編碼序列分析顯示，該樣本存在中度多態(tài)性，與柔嫩艾美耳球蟲的全基因組多樣性形成鮮明對比[28]，說明AMA1是一種良好的候選疫苗抗原。李靈娟[29]通過分析從毒害和堆型艾美耳球蟲中克隆到的NA4和3-1E抗原基因，發(fā)現(xiàn)NA4抗原與柔嫩艾美耳球蟲的TA4抗原之間基因序列的同源性達(dá)91.4%，氨基酸序列的同源性為86%；3-1E抗原在柔嫩艾美耳球蟲和堆型艾美耳球蟲之間的基因序列同源性達(dá)99.8%，氨基酸序列的同源性為99.4%，動物交叉免疫保護(hù)試驗(yàn)證明兩種抗原對4種艾美耳球蟲均有部分交叉免疫保護(hù)作用，說明這2種抗原有可能作為艾美耳球蟲交叉免疫保護(hù)性DNA疫苗的候選抗原。

抗原多樣性會影響針對頂復(fù)門原蟲如惡性瘧原蟲的實(shí)驗(yàn)性疫苗的效力。由抗原多樣性導(dǎo)致的免疫逃避在堆型、巨型、和緩以及柔嫩艾美耳球蟲中均有發(fā)現(xiàn)。因此，詳細(xì)了解編碼候選疫苗抗原的基因多樣性是選擇最優(yōu)候選疫苗抗原的關(guān)鍵。

3 影響免疫效果的因素

3.1 免疫途徑

由于免疫途徑不同，參與免疫應(yīng)答的效應(yīng)細(xì)胞也不同，可能會對疫苗的免疫保護(hù)效果造成一定影響。免疫途徑的選擇應(yīng)考慮多方面的因素，如接種部位細(xì)胞呈遞抗原的能力、細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率、抗原基因的體內(nèi)表達(dá)水平和宿主易感性等?；蛑亟M疫苗的免疫途徑主要有注射、口服、點(diǎn)眼滴鼻、噴霧、電穿孔和基因槍技術(shù)等。研究發(fā)現(xiàn)，核酸疫苗腿部肌肉注射的效果最優(yōu)，且抗雞球蟲病指數(shù)最高[30]，說明肌肉注射是一種簡單有效的免疫途徑。若以志賀氏菌、沙門氏菌、李斯特氏菌作為球蟲基因重組疫苗的載體，可采用口服免疫、鼻內(nèi)滴注或鼻腔噴霧等方法提高粘膜免疫應(yīng)答，但存在一定局限性。

3.2 免疫劑量

免疫應(yīng)答強(qiáng)度和免疫保護(hù)力與免疫劑量有關(guān)。周賽等[31]將柔嫩艾美耳球蟲Mic4-N端蛋白在重組酵母中表達(dá)，與AbISCO?-100佐劑結(jié)合后進(jìn)行動物試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)10 μg蛋白+50 μg佐劑組CD4+T、CD8+T淋巴細(xì)胞百分率顯著升高，增重顯著升高，腸道病變計(jì)分、糞便OPG值顯著降低，證明免疫劑量是影響抗球蟲效果的因素之一。趙勝杰[32]制備了針對多種艾美耳球蟲的混合DNA疫苗，其中柔嫩艾美耳球蟲的最佳免疫劑量為10 μg，而另外3種球蟲的最佳免疫劑量均為25 μg，說明對于不同種的艾美耳球蟲，疫苗的最佳免疫劑量也不相同。

3.3 免疫次數(shù)

由于基因重組疫苗在體內(nèi)表達(dá)量低、持續(xù)時間長的特點(diǎn)，免疫次數(shù)對免疫效果有很大影響。李祥瑞等[33]將含有生長激素基因的質(zhì)粒導(dǎo)入小鼠表皮細(xì)胞后，88%的被免小鼠產(chǎn)生了抗體，二次加強(qiáng)免疫后抗體水平明顯提高。顧有方等[34]研究了GC02雞球蟲病疫苗的免疫保護(hù)效果。結(jié)果顯示，二次免疫的效果最優(yōu)，可有效控制雞球蟲病的發(fā)生，且能明顯促進(jìn)雛雞的生長。說明在初次免疫后，再次或多次加強(qiáng)免疫，可有效提高體液免疫或細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。

4 展 望

近年來，隨著公眾對食品安全的重視以及病原耐藥性的問題，疫苗已代替藥物成為球蟲病防控的流行趨勢。相較于活卵囊疫苗，基因重組疫苗制作成本更低，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平保護(hù)性免疫，已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。不同發(fā)育階段的球蟲，其抗原組成與免疫原性也不同，因此，將不同球蟲保護(hù)性抗原基因連接到表達(dá)載體中，構(gòu)建多價(jià)多表位基因重組疫苗將是未來基因重組疫苗研究的趨勢。此外，利用細(xì)胞因子構(gòu)建免疫調(diào)節(jié)型基因重組疫苗可以提高抗原呈遞效率，增強(qiáng)免疫效果，具有較好的應(yīng)用前景。