錢金涵，朱亭帆，金文杰,3*

(1.揚州大學教育部禽類預防醫(yī)學重點實驗室，江蘇揚州 225009；2.揚州大學江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，江蘇揚州 225009；3.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009)

禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)是一種分節(jié)段的雙股RNA病毒，屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)[1]。它最初因為雙鏈核酸結構被誤認為痘病毒，后來通過電子顯微鏡鑒定該病毒為呼腸孤病毒。該病毒在1954年由Fahey和Crawley首次從患有慢性呼吸道疾病的雞身上分離出來。隨后，多個國家報告從患有關節(jié)炎或者腱鞘炎以及腸道病變的雞中分離出呼腸孤病毒。經試驗感染雞后，該呼腸孤病毒可引起關節(jié)炎和腱鞘炎。除此之外，Olson還描述了另一種發(fā)生在關節(jié)的滑膜、導致形成血管翳的病變，非常類似于人類風濕性關節(jié)炎的病變。此后還有研究人員發(fā)現呼腸孤病毒在試驗感染雞時也會引起心肌炎和肝炎。1985年，王錫堃等發(fā)現了我國第1例雞病毒性關節(jié)炎病例；2001年，吳寶成等從患病番鴨中分離出7個呼腸孤病毒株，是我國首次分離出的DRV毒株；2002年，王光鋒等首次從表現為出血性壞死的病鵝肝臟中分離得到GRV毒株。由上述報道可見，該病毒引起的疾病發(fā)病率不斷上升且出現了多樣化的臨床疾病形式，表明ARV的影響越來越大，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的損失。因此，對ARV快速有效的檢測就顯得尤為重要，本文就目前國內外禽類呼腸孤病毒檢測方法做一綜述，為該病毒的進一步深入研究和疾病的有效防控提供參考。

1 ARV的分離與鑒定

從病料中進行病毒的分離培養(yǎng)和鑒定是診斷病毒感染的一般方法，該病毒分離的最好方法是將病料接種到可孵育的雞胚或細胞培養(yǎng)物中。雞胚孵化6 d后，通過卵黃囊接種雞胚(最好來自SPF雞群)，呼腸孤病毒通常在接種后5 d或6 d內會使得胚胎致死，胚胎出現出血性肝臟壞死病變。隨后用呼腸孤病毒接種雞胚原代肝細胞可在細胞薄片上形成合胞體，感染細胞在幾天后脫落到培養(yǎng)基中。如果細胞被蘇木精和伊紅染色，可見嗜酸性核內包涵體。若病毒在組織中滴度比較低，則可能需要傳代2到3次才能看到效果。呼腸孤病毒經負染色或免疫熒光(IF)染色后電鏡均可識別。

但是從組織中分離和鑒定呼腸孤病毒是耗時的，所以需要其他更快速的方法。例如，肌腱冷凍切片直接IF染色被用來檢測感染后的病毒。Liu H J等[2]使用單克隆抗體免疫過氧化物酶染色法檢測石蠟包埋組織中的呼腸孤病毒。然而，這些方法可能只在感染的早期階段效果突出。

2 分子生物學檢測方法

目前有很多文獻報道了在感染組織中檢測鑒定ARV的方法，這些方法相對快速和敏感，然后以此為基礎再進行有針對性的病毒分離。

2.1 斑點雜交

斑點雜交(Dot-blot hybridisation)是指將待測的DNA變性后點加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜、NC膜)上，用已標記的探針進行雜交，洗膜(除去未結合的探針)，放射自顯影判斷是否有雜交及其雜交強度。Yin H S等[3]利用對應于ARV的S4基因組片段放射性探針斑點雜交檢測ARV，對于經過純化的病毒RNA最低檢測量可達0.2 ng，可以作為檢測ARV感染的有力診斷工具。但是，使用和檢測放射性標記的探針對于大多數診斷試驗室可能并不現實。Liu H J等[4]使用非放射性探針，用標有地高辛的探針進行檢測的方法已經消除了這一缺陷，并且最低檢測量可達0.78 ng。劉赫[5]建立的地高辛標記的ARV核酸探針檢測方法只與ARV雜交結果為陽性，最低可檢出50 pg/μL的核酸，并且將探針長期保存在-20℃的冰箱中仍能檢測出陽性核酸樣品，表明該方法具有較好的特異性、敏感性和穩(wěn)定性，操作簡便，可大批量檢測病料樣本，適合進行ARV的臨床診斷和流行病學調查。因此，利用非放射性探針是一種可靠和快速的ARV感染診斷方法。

2.2 PCR

聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，因其特異性強、靈敏度高、簡便快速、樣本純度要求低等特點，被廣泛應用于ARV的檢測。Xie Z等[6]根據ARV基因組S1基因序列，設計一對特異性引物可擴增出片段長度為532 bp的產物，最低檢測濃度可達1 pg。廖敏等[7]根據已發(fā)表的ARV S1133株S1基因序列，設計合成了一對可將反轉錄和PCR反應在一個PCR反應管中一次性完成的引物，該方法最低可檢測到0.16 ng的ARV RNA，此方法更加方便簡潔，省去了繁瑣的步驟。Lee L H等[8]將PCR與限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術結合，為ARV分離株的鑒定提供一種簡便、快速的方法。

2.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR方法具有較高的敏感性和特異性，且操作相對快速和簡單，因此成為了臨床診斷ARV感染的一種常規(guī)方法。Ke G M等[9]根據ARV S1133株的σA基因序列設計了1對引物，可擴增長度為241 bp的片段，采用Ligut Cycler SYBR Green-based real-time reverse transcription-PCR(real-time LC RT-PCR)技術，建立了實時熒光定量PCR檢測方法，該方法比常規(guī)RT-PCR靈敏度高1000倍。Mor S K等[10]建立了一種基于Taqman的實時熒光定量PCR (RT-qPCR)方法用于早期檢測火雞呼腸孤病毒。從火雞呼腸孤病毒基因組S4段的保守區(qū)設計引物探針，該檢測方法具有特異性。該方法的檢測范圍為108～101copies /reaction，靈敏度高。批內、批間變異系數最高分別為0.08和0.06，具有良好重復性。這種新方法對檢測火雞腸道和關節(jié)炎呼腸孤病毒有一定的應用價值。Zhang S等[11]建立了基于Taqman的實時熒光定量PCR檢測NDRV感染的方法，利用NDRV基因組內的保守區(qū)域，設計了特異性引物和探針，該方法的檢測下限為10 copies/μL。通過與其他鴨病毒性病原體的交叉檢驗，未觀察到交叉反應，證實該檢測方法對NDRV具有高度特異性。批內、批間變異系數均小于2.91%，具有良好重復性。RT-qPCR和常規(guī)PCR檢測了120份來自不同地區(qū)的NDRV感染樣本，結果顯示陽性檢出率分別為94.17%和84.17%，實時熒光定量PCR檢測方法的檢出率比常規(guī)PCR法高10%。云濤等[12]根據NDRV S3基因保守序列設計1對特異性引物和1條MGB熒光探針，建立了一種檢測NDRV的一步法MGB熒光定量RT-PCR方法，最小檢出量為10 copies/μL，組內和組間變異系數均小于2%。但是RT-qPCR需要特殊的設備、昂貴的用品和熟練的工作人員，因此這種技術目前還不能被廣泛應用。

2.4 套式PCR

套式PCR(nested-PCR)使用2對PCR引物擴增完整的片段，第1對PCR引物擴增片段和普通PCR相似，第2對引物稱為套式引物結合在第1次PCR產物內部，使得第2次PCR擴增片段短于第1次擴增。套式PCR檢測ARV的應用在靈敏度和特異性方面都比現有的免疫學技術有很大的改進。此外，套式PCR減少或消除了不需要的產物，同時提高了敏感性。Liu H等[13]根據ARV S1133株S1基因序列，設計了2套引物分別擴增長度為738 bp和342 bp建立了一套nested-PCR方法，為ARV的檢測提供了一種靈敏、準確的檢測和鑒別方法。

2.5 納米PCR

納米PCR技術是一種新型的PCR技術，其原理是把固相納米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。由于納米流體相對于普通流體具有更強的熱導性，所以會更快地到達目標溫度，減少在非目標溫度的停留時間，縮短整個體系達到溫度平衡所用的時間，從而減少非特異性擴增、提高特異性擴增產量[14-15]。鄭麗等[16]針對ARV S3基因的保守區(qū)域設計1對特異性引物，建立了ARV納米PCR檢測方法，從ARV核酸樣品可檢測到約332 bp的特異性目的條帶。該納米PCR方法能檢測到的最低核酸質量濃度為56 pg/μL，其靈敏度是普通PCR的10倍。

2.6 重組酶聚合酶擴增技術

重組酶聚合酶擴增(RPA)技術是一種發(fā)展迅速的核酸擴增方法，被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。常規(guī)PCR必須經過變性、退火、延伸三個步驟，而RPA反應的最適溫度在37℃～42℃之間，無需變性，不需要溫控設備，在常溫下即可進行，可以真正實現便攜式的快速核酸檢測，一般可在10 min之內獲得擴增產物。Ma L等[17]根據S1基因設計了一套特定引物來擴增S1基因的保守核苷酸序列，建立了RT-RPA檢測ARV的方法。通過對86例臨床樣本的檢測，驗證了RT-RPA法的可行性。臨床標本采用RT-qPCR檢測進行比較，RT-RPA檢測結果與RT-qPCR的符合率為96.5%?；谔结樀腞T-RPA檢測方法簡單、方便、靈敏度高、特異性好，在資源有限的情況下將成為檢測ARV的另一種診斷方法。Wang W等[18]根據S3基因設計了特異性引物，建立了RT-PRA檢測方法，該方法具有良好的重復性，最低能夠檢測出3.48×10-6ng/μL的標準質粒，該方法比常規(guī)RT-PCR方法檢測靈敏度高10倍左右。此外，擴增產物無需凝膠電泳，通過添加SYBR GreenⅠ即可在紫外燈下觀察，方便便捷。

2.7 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增(LAMP)技術是一種新型的核酸擴增方法，它在等溫條件下以高特異性、高效率和快速擴增DNA，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶(BstDNA polymerase)的作用下，60℃～65℃恒溫擴增，15 min～60 min左右即可實現109倍～1010倍的核酸擴增，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強、反應時間短、不需要特殊的儀器、產物易檢測等特點[19]。Li Z等[20]根據ARV主要外殼蛋白基因σB基因建立了一種RT-LAMP檢測方法，檢測靈敏度較高，最低檢測限度可達200 fg，該方法對自然感染和試驗感染的檢測均比常規(guī)RT-PCR靈敏。于可響等[21]根據ARV S3基因的6個保守區(qū)域設計了4條LAMP引物，建立了RT-LAMP檢測方法，該方法對病毒RNA的最低檢出量為0.1 pg，是常規(guī)RT-PCR方法的100倍，且該方法具有良好的特異性。臨床應用結果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為98%，而且對儀器的要求低，適于基層實驗室和現場檢測。蔡躍佳等[22]將RT-LAMP技術與熒光染料鈣黃綠素結合，建立鈣黃綠素可視化RT-LAMP快速檢測方法，能通過顏色變化觀察反應結果。但是LAMP技術容易由于氣溶膠而會出現假陽性問題，需要在操作時格外注意。為了解決污染問題，李璐瑤[23]根據ARV M1基因設計了一套特異性LAMP擴增引物，建立了ARV檢測的UDG-LAMP體系。該方法特異性好，僅能對ARV進行擴增；靈敏度高，最低檢測限為3×102copies/μL，是PCR方法的100倍；防攜帶污染作用明顯。在臨床樣品檢測中，該方法的陽性檢出量比RT-PCR方法高16.7%。

2.8 交叉引物恒溫擴增技術

2.9 生物活性擴增探針法

生物活性擴增探針法(BAP)這項新技術結合了巢式PCR和磁珠為基礎的DNA探針系統(tǒng)，大大提高了靈敏度和特異性。Li S K等[25]對不同ARV基因型和血清型的ARV S2基因進行對比，通過對2對RT-PCR引物、6對套式PCR引物和1對磁性探針進行檢測，尋找最特異的引物用于ARV檢測，建立了RT-PCR、套式PCR和磁探針雜交的最佳條件。建立的BAP檢測法最低檢測靈敏度為5 copies/μL，批內、批間變異系數分別為1.3%和1.7%，具有良好的穩(wěn)定性。由于該方法勞動強度小、特異性高、靈敏度高，可能是ARV檢測乃至大規(guī)模篩查的最佳選擇。

3 免疫學檢測方法

3.1 瓊脂凝膠免疫擴散試驗

3.2 間接免疫熒光檢測

間接免疫熒光試驗(IFA)是用特異性抗體與標本中相應抗原反應后，再用熒光素標記的二抗與抗原-抗體復合物中第一抗體結合，洗滌后在熒光顯微鏡下觀察特異性熒光，以檢測未知抗原或抗體。Adair B等[26]在AGID試驗與IFA試驗對抗血清稀釋度的比較中發(fā)現IFA試驗具有更高的敏感性。雖然IFA檢測可能比AGID更敏感，但易產生非特異性熒光，出現假陽性問題。

3.3 血清中和試驗

血清中和(SN)試驗是經典的血清學檢測方法。Kawamura H等[29]通過SN試驗將77個ARV分離株分為5個血清型。而Wood G等[27]認為ARV至少有11種血清型。SN試驗比AGID和IFA試驗更具有特異性和敏感性，但也有成本昂貴和速度緩慢的缺點[26]。

3.4 蛋白質印跡法

蛋白質印跡法(Western blot)是將電泳分離后的細胞或組織中蛋白質從凝膠轉移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特異性抗體檢測某特定抗原的一種蛋白質檢測技術，現已廣泛應用于基因在蛋白水平的表達研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個方面。Endo-Munoz L B[30]將含有2種ARV(RAM-1和74/2)混合物的抗原進行Western blot，其中16種不同的ARV的抗血清均有陽性反應。陽性反應表現為硝基纖維素膜上出現了以下一種或多種多肽的條帶，145 ku和132 ku多肽，79 ku和73 ku多肽，42 ku多肽。同時145 ku和132 ku大小處的多肽在不同毒株檢測過程中都能觀察到。因此，在145 ku和132 ku處是否有條帶被作為判斷抗血清中是否含有ARV抗體的標準。此外，Western blot在7種接觸性抗血清中檢測到6種抗體，而免疫熒光只能檢測到3種，結果證實了Western blot比免疫熒光更敏感。Western blot檢測結果重復性好，是一種可靠、特異、靈敏的檢測ARV抗體的方法。Western blot可作為驗證試驗，篩選出免疫熒光未明確陽性或陰性的SPF血清。而且接觸性抗血清的檢測結果表明，為保證自然感染ARV的雞抗血清中低水平抗體的檢測，應將Western blot作為常規(guī)檢測手段。

3.5 酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗(ELISA)指將可溶性的抗原或抗體結合到聚苯乙烯等固相載體上，利用抗原抗體特異性結合進行免疫反應的定性和定量檢測方法。Liu H等[31]建立了一種以誘導中和抗體的σC、σB蛋白為包被抗原的ELISA檢測方法，并與血清中和試驗和常規(guī)ELISA試驗進行了比較。結果表明，σC-σB-ELISA與血清中和試驗結果的符合程度遠高于常規(guī)ELISA。Yun T等[32]通過在大腸桿菌中克隆并表達了NDRV的外衣殼(σC)，建立了檢測方法。通過與其他鴨病毒病原體的交叉檢驗，證實了σC-ELISA方法的特異性。與Western blot做比較，σC-ELISA的敏感性和特異性分別為92.6%和88.9%，兩種檢測方法與Western blot的一致性較好。該方法是一種特異性強、靈敏度高的檢測方法，可用于NDRV感染的血清學調查和NDRV抗體滴度監(jiān)測。

疫苗免疫與病毒感染的區(qū)別也是重要的。Xie Z等[33]將ARV的σNS和P17兩個非結構基因克隆到載體PGEX4T-1中表達蛋白質并進行純化作為抗原。采用σNS-ELISA、P17-ELISA和σNS-P17-ELISA 3種ELISA方法和AGID方法對感染ARV的SPF雛雞血清進行檢測。感染ARV的陽性血清中σNS、P17和σNS-P17 3種檢測方法陽性率分別為88.9%、61.1%和88.9%，而AGID檢測陽性率為55.6%。免疫疫苗雞血清中σNS、P17和σNS-P17的3種方法陽性檢出率分別為6.7%、0%和6.7%，然而AGID方法檢測出率為60.6%。結果表明，利用非結構蛋白特異性ELISA技術可以區(qū)分ARV疫苗免疫和ARV感染。

4 展望

近年來，ARV引起的疾病發(fā)病率不斷上升且出現了不斷多樣化的臨床疾病形式，表明ARV的影響越來越大，給養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的損失。由于ARV的嚴重危害，眾多研究人員已經開發(fā)出多種ARV實驗室診斷方法，以便在現場條件下進行早期診斷。對于病原檢測，ARV病原的分離與鑒定、分子生物學檢測方法在診斷中發(fā)揮重要作用，尤其是PCR、qPCR、LAMP等分子生物學技術更在禽感染ARV的早期即可檢測到病毒核酸，在ARV的早期檢測中具有重要作用；免疫學方面，用免疫學方法檢測抗體可以了解ARV感染、發(fā)生、發(fā)展的進程，即有AGID、IFA、SN、Western blot、ELISA的方法用于ARV檢測，利用非結構蛋白特異性ELISA技術還可以區(qū)分ARV疫苗免疫和ARV感染。總之，ARV的實驗室檢測方法多種多樣，各有優(yōu)缺點。ARV在家禽中引起的相關疾病的判定仍然存在諸多問題。雖然呼腸孤病毒普遍存在，但疾病相對較少發(fā)生，因此在組織中簡單檢測到病毒或血清抗體，可能不能認定呼腸孤病毒是疾病的原因。因此，需要進行更多的研究來了解呼腸孤病毒不同毒株致病性的基礎以及可能導致呼腸孤病毒致病的誘因。但是，隨著免疫學與分子生物學技術的不斷發(fā)展，更多簡單快速的技術將被開發(fā)出并應用于ARV的防控。