劉文華，張 寒，趙瑛琦，孫憲法， 任慧英，張 燦，鄒 玲，劉宗柱

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；2.山東民和牧業(yè)股份有限公司，山東煙臺(tái) 265600；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東青島 266109)

抗生素促生長(zhǎng)劑(antibiotic growth promoter,AGP)在提高畜牧養(yǎng)殖效益的同時(shí)所引發(fā)的細(xì)菌耐藥性與藥物殘留的嚴(yán)重后果引起了全球的高度重視，歐盟于2006年下達(dá)了AGP禁用令，我國(guó)也于2020年7月全面禁止AGP的使用。然而，禁用AGP所帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)不容忽視。歐盟禁用AGP后，產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)、大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)、沙門(mén)氏菌(Salmonella)等引發(fā)的細(xì)菌性感染比例明顯升高，導(dǎo)致治療用抗生素大幅攀升[1]。因而，AGP替代品的開(kāi)發(fā)成為研究熱點(diǎn)。

在目前所研究的AGP替代品中，精油(essential oil,EO)因具有較好的抑菌活性而備受關(guān)注[2]。關(guān)于精油的篩選和抑菌研究已有較多報(bào)道，但多數(shù)聚焦于E.coli、Salmonella等革蘭氏陰性菌的研究[3-4]。大量研究結(jié)果表明，動(dòng)物的生產(chǎn)性能變化與腸道內(nèi)E.coli的變化并不密切相關(guān)，而是與C.perfringens的改變相關(guān)性更強(qiáng)[5]。C.perfringens作為條件致病菌，易受換料、環(huán)境改變等應(yīng)激因素影響從而引發(fā)動(dòng)物壞死性腸炎，應(yīng)當(dāng)作為AGP及其替代研究的主要目標(biāo)菌[6]。另一方面，高度疏水的精油，在集約化畜禽養(yǎng)殖中通過(guò)水線(xiàn)給予，必須使用合適的乳化劑來(lái)增強(qiáng)其水溶性；所使用的乳化劑是否會(huì)影響精油的抑菌活性，也是需要關(guān)注的問(wèn)題。本試驗(yàn)通過(guò)不同濃度吐溫(Tween)系列乳化劑與精油互作，以了解對(duì)精油抑菌效果的影響，為篩選精油作為新型抗菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 A型產(chǎn)氣莢膜梭菌(BNCC 125404)，北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；大腸埃希氏菌(ATCC 25922)，中國(guó)藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；鼠傷寒沙門(mén)菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)(ATCC 14028)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 牡荊油(vitex oil)(190603，99%)、柴胡油(radix bupleuri oil)(190708，99%)，江西鑫森產(chǎn)品；香茅醇(citronellol)(C804317，95%)、香葉醇(geraniol)(G810439，98%)、香茅醛(citronellal)(C805140，96%)、肉桂醇(cinnamyl alcohol)(C805195，98%)、香芹酚(carvacrol)(C804847，99%)、丁香酚(eugenol)(E809010，99%)、丁香羅勒油(clove basil oil)(B905691， 85%)、檸檬烯(limonene)(D887405，95%)、α-蒎烯(α-pinene)(P854547，98%)、肉桂醛(cinnamaldehyde)(C822622，98%)，上海麥克林生化試劑產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)(HB0109)、液體硫乙醇酸鹽(fluid thioglycollate medium，F(xiàn)T)(HB5190)、胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ)(tryptose sulfite cyloserine ager，TSC)(HB0253-9)、SS瓊脂培養(yǎng)基(HB4089)、LB肉湯(HB0128)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；無(wú)水乙醇(10009218)、吐溫20(Tween-20，T-20)(30189328)、吐溫40(Tween-40，T-40)(30189428)、吐溫60(Tween-60，T-60)(30189528)、吐溫80(Tween-80，T-80)(30189828)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(K0031608)，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜(HFsafe-1200LC A2)，中國(guó)上海力申科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(DHP-9162)，中國(guó)上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；振蕩培養(yǎng)箱(MQT-60R)，中國(guó)上海旻泉儀器有限公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀(ELx800)，美國(guó)BioTek公司產(chǎn)品；掃描電鏡(JSM-7500F)，日本HITACHI公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌液的準(zhǔn)備 將C.perfringens在TSC平板上復(fù)蘇，挑取平板單菌落接種含5 mL FT培養(yǎng)基的試管中，厭氧培養(yǎng)10 h，傾注平板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[7]，計(jì)算菌液濃度。將E.coli、Salmonella在SS瓊脂培養(yǎng)基平板上復(fù)蘇，挑取平板單菌落接種5 mL LB肉湯培養(yǎng)基，37℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10 h，菌液濃度測(cè)定同上。

1.2.2 牛津杯法抑菌試驗(yàn) 為初步了解牡荊油、香茅醇、香葉醇、香茅醛、柴胡油、肉桂醇、香芹酚、丁香酚、丁香羅勒油、檸檬烯、α-蒎烯、肉桂醛12種EO對(duì)C.perfringensE.coli和S.typhimurium的抑菌情況，首先進(jìn)行了牛津杯抑菌試驗(yàn)。將上述12種EO用20%乙醇稀釋至10 mg/mL的工作濃度，將E.coli和S.typhimurium用LB肉湯培養(yǎng)基、C.perfringens菌液用胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂基礎(chǔ) (TSC)稀釋至108CFU/mL，取100 μL涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)平板，將牛津杯均勻放置在NA板上，兩個(gè)牛津杯間隔40 mm，輕輕按壓固定，每個(gè)牛津杯加入200 μL 10 mg/mL的EO，每種EO設(shè)3個(gè)重復(fù)。同時(shí)設(shè)20%乙醇稀釋液對(duì)照。其中涂布E.coli和S.typhimurium的平板放置普通溫箱培養(yǎng)，涂布C.perfringens平板進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)16 h后測(cè)量抑菌圈直徑。牛津杯法藥敏結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>20 mm為極度敏感，直徑15 mm～20 mm為高度敏感，直徑10 mm～15 mm為中度敏感，直徑<9 mm為不敏感[8]。

1.2.3 EO的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定 為了測(cè)定不同濃度吐溫系列乳化劑對(duì)抑菌效果的影響，根據(jù)牛津杯抑菌試驗(yàn)結(jié)果，選擇抑菌效果較好的EO，用超純水將T-20、T-40、T-60、T-80分別稀釋成5%、7.5%和10% 3個(gè)濃度，EO分別與5%、7.5%和10%的3個(gè)濃度上述4種吐溫乳化劑互作并配制成10 mg/mL的儲(chǔ)備液，再分別用FT與LB肉湯將儲(chǔ)備液稀釋至8 mg/mL作為工作液；根據(jù)獸藥典配置濃度為1 mg/mL的土霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[9]，之后再分別用LB肉湯與FT稀釋至400 μg/mL作為工作液。菌液用相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋至106CFU/mL，采用二倍比微量稀釋法[10]測(cè)定不同乳化劑乳化EO對(duì)C.perfringens、E.coli、S.typhimurium的MIC，20%乙醇溶解的無(wú)乳化劑EO、同等劑量的吐溫系列乳化劑和土霉素分別作為對(duì)照。

1.2.4 不同濃度肉桂醛對(duì)C.perfringens生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響 根據(jù)吐溫系列乳化劑與EO互作對(duì)C.perfringens的MIC結(jié)果，選擇抑菌效果最好的吐溫乳化劑與肉桂醛互作檢測(cè)其對(duì)C.perfringens生長(zhǎng)曲線(xiàn)的影響。將肉桂醛用液體硫乙醇酸鹽(FT)稀釋至2MIC、MIC、1/2MIC、1/4MIC，再加入等體積106CFU/mL的C.perfringens菌液混合，使其終濃度為MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，同時(shí)設(shè)不加EO的菌液對(duì)照。然后每隔2 h測(cè)一次OD 600 nm值直至24 h，使用GraphPad Prism 8繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.5 掃描電鏡觀(guān)察肉桂醛處理的C.perfringens形態(tài) 將T-40乳化的肉桂醛稀釋至MIC，然后與106CFU/mL的C.perfringens菌液等體積混合，同時(shí)設(shè)不加EO的對(duì)照，孵育6 h，按照桿菌的掃描電鏡樣品制備方式處理菌液[11]，在掃描電鏡下觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)并拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的差異顯著性統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 牛津杯法測(cè)定的EO抑菌結(jié)果

由牛津杯抑菌試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)可知，測(cè)定的12種EO對(duì)測(cè)試的3種細(xì)菌表現(xiàn)出明顯不同的抑菌效果，其中有抑菌作用的EO對(duì)C.perfringens的抑菌效果顯著優(yōu)于對(duì)E.coli和S.typhimurium的作用(表1)。根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果綜合考慮選擇香芹酚、丁香羅勒油、檸檬烯、α-蒎烯、肉桂醛5種EO進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 不同精油對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門(mén)菌的抑菌圈直徑(mm)

2.2 5種EO的MIC測(cè)定結(jié)果

篩選的香芹酚、丁香羅勒油、檸檬烯、α-蒎烯、肉桂醛5種EO使用3個(gè)不同濃度的吐溫系列乳化劑乳化后對(duì)C.perfringens、E.coli、S.typhimurium3種細(xì)菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，較未使用乳化劑測(cè)定的MIC相比，3個(gè)不同濃度的 4種吐溫系列乳化劑與α-蒎烯、檸檬烯、丁香羅勒油和香芹酚4種EO互作后，所測(cè)定的3種細(xì)菌的MIC值均未出現(xiàn)明顯降低的趨勢(shì)，而使用10%的T-40與T-60乳化的肉桂醛較未使用乳化劑的肉桂醛相比，對(duì)C.perfringens的MIC顯著降低；3個(gè)不同濃度的 4種吐溫系列乳化劑與肉桂醛互作后沒(méi)有改變E.coli與S.typhimurium的MIC值。由表3可見(jiàn)，E.coli與S.typhimurium對(duì)4種吐溫系列乳化劑均不敏感(MIC>100 mg/mL)； 與未使用乳化劑測(cè)定的MIC相比，T-40雖然對(duì)C.perfringens有一定的抑菌作用(MIC為195 μg/mL)，但與肉桂醛互作后顯著提高了對(duì)C.perfringens的抑菌效果，MIC由125 μg/mL降低至7.81 μg/mL，幾乎與土霉素對(duì)C.perfringens的MIC值相當(dāng)(12.50 μg/mL)。所以后續(xù)試驗(yàn)選擇10%的T-40作為乳化劑，選擇肉桂醛作為抑菌EO。

表2 不同濃度的吐溫系列乳化劑乳化精油后對(duì)三種細(xì)菌的MIC測(cè)定結(jié)果(μg/mL)

表3 吐溫系列乳化劑與土霉素對(duì)三種菌的MIC測(cè)定結(jié)果(μg/mL)

2.3 不同濃度肉桂醛對(duì)C.perfringens生長(zhǎng)曲線(xiàn)影響的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)T-40乳化不同濃度的肉桂醛對(duì)C.perfringens的生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示，當(dāng)肉桂醛的濃度分別為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)延遲，濃度越高延遲時(shí)間越長(zhǎng)，所有組測(cè)定的4 h后的OD 600 nm值均明顯低于對(duì)照組，濃度為MIC的肉桂醛組OD 600 nm值基本保持不變。

Control.未經(jīng)肉桂醛處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌；1/8MIC.經(jīng)1/8MIC的肉桂醛處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌；1/4MIC.經(jīng)1/4MIC的肉桂醛處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌；1/2MIC.經(jīng)1/2MIC的肉桂醛處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌；MIC.經(jīng)MIC的肉桂醛處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌

2.4 掃描電鏡觀(guān)察細(xì)菌的形態(tài)變化

掃描電鏡觀(guān)察的正常C.perfringens菌體形態(tài)和7.81 μg/mL(MIC)的肉桂醛處理6 h的C.perfringens菌體形態(tài)如圖2所示。圖2A可見(jiàn)未經(jīng)處理的C.perfringens菌體形態(tài)完整，表面光滑；圖2B可見(jiàn)MIC水平肉桂醛處理的C.perfringens顯示菌體發(fā)生扭曲皺縮，表面有褶皺和裂痕。

A.未經(jīng)處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌形態(tài); B.MIC的肉桂醛處理的產(chǎn)氣莢膜梭菌形態(tài)

3 討論

本研究通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)測(cè)定了12種EO對(duì)C.perfringens、E.coli、S.typhimurium的抑菌作用，篩選出5種抑菌效果較好的EO。文獻(xiàn)報(bào)道生姜EO和胡椒EO對(duì)金黃色葡萄球菌、單核增生李斯特氏菌的抑菌效果優(yōu)于E.coli與S.typhimurium[12-13]，說(shuō)明革蘭氏陽(yáng)性菌對(duì)EO敏感可能是普遍現(xiàn)象。究其原因可能與細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)組成有關(guān)[14]，革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁主要由肽聚糖組成，這使得疏水分子很容易穿透細(xì)胞；革蘭陰性菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)多層，且外層主要由脂多糖構(gòu)成，不利于EO的結(jié)合與穿透，但EO的具體作用位點(diǎn)及作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。

Kaur G等[15]發(fā)現(xiàn)，吐溫可作為細(xì)胞通透性增強(qiáng)劑，增加膜流動(dòng)性以促進(jìn)膜破裂。文獻(xiàn)報(bào)道使用T-60配制檸檬烯對(duì)金黃色葡萄球菌和E.coli的抑菌作用比T-80作為乳化劑的抑菌效果更好[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示T-40與EO互作可明顯降低EO的MIC值，肉桂醛經(jīng)T-40乳化后對(duì)C.perfringens的MIC值為7.8 μg/mL，且對(duì)不同來(lái)源的C.perfringens的MIC值無(wú)明顯差異，該結(jié)果顯著低于其他研究報(bào)道的MIC值[17-18]。

生產(chǎn)實(shí)踐中，AGP或AGP替代品添加劑量均達(dá)不到其MIC。因而，在低于MIC時(shí)，EO對(duì)目標(biāo)菌的作用也是值得關(guān)注的問(wèn)題。生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定結(jié)果表明，1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC的肉桂醛濃度對(duì)C.perfringens的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用。對(duì)照組到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間為12 h，而肉桂醛處理組的生長(zhǎng)曲線(xiàn)明顯滯后，且呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，即肉桂醛濃度越高，細(xì)菌生長(zhǎng)到達(dá)平臺(tái)期的時(shí)間越滯后，當(dāng)肉桂醛以MIC濃度處理細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌OD 600 nm值基本保持不變。掃描電鏡可以直觀(guān)反映細(xì)菌的形態(tài)變化，預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將106CFU/mL的C.perfringens與EO等體積混合作用，其中作用6 h的MIC值的OD 600 nm值表現(xiàn)出明顯差異，因此本試驗(yàn)將EO與菌液孵育時(shí)間定為6 h進(jìn)行掃描電鏡觀(guān)察細(xì)菌形態(tài)，結(jié)果顯示MIC值的肉桂醛可造成C.perfringens形態(tài)的明顯改變。細(xì)菌細(xì)胞的這些變化可能是由于肉桂醛對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性和完整性的破壞引起的，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的滲漏。

本研究通過(guò)OD值比較和電鏡形態(tài)觀(guān)察證明了精油對(duì)細(xì)菌的破壞作用；通過(guò)精油和吐溫乳化劑的協(xié)同作用，篩選出了對(duì)C.perfringens抑菌效果良好的T-40乳化劑和肉桂醛精油，有望作為AGP替代品控制臨床因產(chǎn)氣莢膜梭菌過(guò)量增殖產(chǎn)生大量毒素而引發(fā)的壞死性腸炎。精油與乳化劑的具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。