郝蘊偉，翟雪潔，李才善，呼爾查，劉凱強，巴音查汗·蓋力克

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，新疆烏魯木齊 830052)

硬蜱(Hard ticks)是寄生于動物體表依靠吸食宿主血液的外寄生蟲(也是媒介生物)。革蜱(Dermacentorspp.)隸屬于硬蜱科，我國已記錄有13種，新疆地區(qū)有8種，邊緣革蜱(Dermacentormarginatus)是天山區(qū)域的優(yōu)勢種[1]，其主要分布于準噶爾界山和山間谷地。蜱蟲作為傳播媒介能夠對畜禽和公共健康造成很大危害，邊緣革蜱作為媒介蜱能夠攜帶多種蜱媒病原體。邊緣革蜱能給家畜或人類傳播的病原體主要有漢坦病毒[2]、巴貝斯蟲[3]、立克次體[4]、無漿體[5]、布魯氏菌和伯氏疏螺旋體[6]等。

蜱蟲大量吸食宿主血液，其消化血液過程中會對其自身造成氧化還原壓力。饑餓雌蜱在吸取宿主血液飽血脫落后，體重與原體重相比，有88倍～128倍[7-8]的差異。蜱蟲在吸取大量宿主血液后體內會發(fā)生一系列的代謝反應，而血液代謝的過程中可能會導致蜱蟲的活性氧分子過度生成和/或清除減少，最終導致蜱蟲體內活性氧類生成與抗氧化防御功能紊亂。生物機體的抗氧化物酶主要有細胞色素P450酶(cytochromeP450，CYP450)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、鐵蛋白(ferritin)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)[9]等。

谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase,GST)是GSH-Px中的一種，是一類具有促進多種親電子物質、氧化應激產物等與谷胱甘肽的巰基結合而發(fā)揮Ⅱ相解毒及抗氧化功能的多基因同工酶家族。GST廣泛分布于各種生物體內，能夠催化谷胱甘肽和其他有毒代謝產物之間的結合，增加其親水性，最終幫助有毒代謝物的排出，實現(xiàn)抗氧化應激[10]，在蜱蟲的抗氧化應激上發(fā)揮著重要作用。GST基因家族在蜱蟲中較為發(fā)達，研究發(fā)現(xiàn)，肩突硬蜱 (Ixodesscapularis)具有35種GST基因[11]。根據(jù)上述信息可以作出假設，GST可能在蜱類解毒代謝中發(fā)揮重要作用。

本研究以邊緣革蜱(Dermacentormarginatus)為研究對象，基于前期邊緣革蜱轉錄組測序數(shù)據(jù)[12]，結合森林革蜱(Dermacentorsilvarum)基因組數(shù)據(jù)[13]比對結果，篩選出與氧化應激相關的GST基因。利用生物信息學和分子生物學方法對邊緣革蜱GST基因進行分析，篩出邊緣革蜱GST(DmGST)功能基因，旨在了解DmGST基因生物學特性以及為后續(xù)研究抗邊緣革蜱疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蜱及實驗動物 本試驗所使用的邊緣革蜱為新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院寄生蟲實驗室培養(yǎng)的第2代(F2)純蜱。新西蘭大白兔、無菌Balb/c小白鼠購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心。

1.1.2 質粒與菌株 pGEX-4T-1、pET-28a載體由新疆農業(yè)大學動醫(yī)學院寄生蟲實驗室提供；pEASY-T1、pMD18-T Vector 北京全式金生物技術有限公司產品；大腸埃希氏菌DH5α、BL21(DE3)感受態(tài)細胞為Takara公司產品。

1.1.3 基因 邊緣革蜱轉錄組數(shù)據(jù)由新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院寄生蟲實驗室提供。

1.1.4 主要試劑 胰蛋白胨(HB8270)、酵母浸粉(HB8273)等，青島高科技工業(yè)園海博生物技術有限公司產品；血液/細胞/組織基因組DNA 提取試劑盒(DP304)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(增強型)(DP219)、RNA Easy Fast動物組織/細胞總RNA提取試劑盒(DP451)、FastKing RT Kit(With gDNase)(KR116)第一鏈合成試劑盒(去基因組)等，天根生化科技(北京)有限公司產品；質粒提取試劑盒(E.Z.N.A Plasmid Mini Kit I)，OMEGA試劑盒總代理經(jīng)銷商上海易匯生物科技有限公司產品。

1.1.5 主要儀器 單人凈化工作臺(SW-CJ-1D)，蘇州凈化設備有限公司實驗室產品；北利牌高速臺式冷凍離心機(GTR16-2)，北京時代北利離心機有限公司產品；雙穩(wěn)定時電泳儀電源(DYY-6C)，上海沛升儀器設備有限公司產品；伯樂凝膠成像分析系統(tǒng)(BIO-RAD Gel Doc XR +)、伯樂 PCR 儀(BIO-RAD T 100)，伯樂生命醫(yī)學產品(上海)有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 飼蜱試驗 通過將F2代邊緣革蜱接種于新西蘭大白兔左、右外耳使F2代雌蜱處于半飽血狀態(tài)時，收集至5 mL EP管中，進行總RNA提取。該試驗過程受新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院動物倫理委員會監(jiān)督。

1.2.2 總RNA的提取和第一鏈cDNA的合成 將人工飼養(yǎng)的F2代半飽血邊緣革蜱雌蜱液氮研磨，裝入無酶EP管，隨后加入500 μL Trizol，在渦旋儀上混勻，冰浴5 min；向上述EP管中加入500 μL氯仿，于渦旋儀中振蕩混勻，之后按照RNA提取試劑盒的說明書進行操作；將提取的總RNA使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒反轉錄為cDNA，以上步驟均在超凈臺中操作，獲取的邊緣革蜱cDNA樣品置于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計與目的基因擴增 基于邊緣革蜱轉錄組數(shù)據(jù)[12]使用Primer 5.0軟件設計6種GST基因的引物。GST基因的命名根據(jù)Friedman等對昆蟲GST基因的命名倡議進行[14]。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司代為合成。引物序列及PCR反應條件詳見表 1。

表1 DmGST引物信息

1.2.4 系統(tǒng)進化分析 將NCBI上Blast比對結果中便于分亞型的蛋白質序列下載歸檔至同一個文本文檔(.txt)中。將蛋白氨基酸序列文件導入CLUSTALX軟件，比對分析蛋白質序列，導出格式為.phy格式的文件。然后將其導入Prot Test軟件，分析進化樹最優(yōu)模型，最后使用phyML軟件構建系統(tǒng)進化樹，并使用iTOL(https://itol.embl.de)網(wǎng)頁制作進化樹模型。

1.2.5 同源性分析DmGST蛋白氨基酸序列的比對，使用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行蛋白序列同源性分析。

1.2.6DmGST序列生物學特性分析 使用在線軟件ExPASy中的Prot Param(http://web.Expasy.org/protparam/)分析DmGST氨基酸序列得出蛋白質的分子量、等電點、吸光值等理化性質；使用SignalP-5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測DmGST蛋白的信號肽；使用 TMHMM (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)預測DmGST蛋白質跨膜區(qū)。采用 Allertop (http://www.ddgpharmfac.net/AllerTOP) Online Available Server 服務器進行過敏性預測。

1.2.7 抗原表位預測 使用IEDB Analysis Resource(http://tools.iedb.org/bcell/)預測氨基酸序列的B細胞線性抗原表位；使用SWISS-MODEL(https:∥ swissmodel.expasy.org/)預測蛋白的三級空間模型，并將模型上傳到在線軟件Service(https://services.healthtech.dtu.dk/)中的dicotope-2.0預測蛋白的空間抗原。

1.2.8 原核表達載體構建及4種不同亞型GST表達 將回收的DmGST基因片段物分別連接到pEASY-T1克隆載體中，導入大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞，加入液體培養(yǎng)基，搖勻(上述步驟均在超凈臺內完成)。搖菌管傾斜放置于搖床培養(yǎng)，離心后留少量上清與沉淀混勻涂板，篩選陽性單菌落，收集菌液送上海生工進行測序。使用質粒小提試劑盒對4種不同亞型的菌液提取克隆質粒，對克隆質粒和空載質粒進行雙酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)，回收空載和目的片段，使用T4 DNA連接酶于16℃過夜連接，然后將重組質粒轉化至大腸埃希氏菌BL21(DE3)中，經(jīng)篩選后送測序。測序結果正確后進行擴大培養(yǎng)，OD280 nm值達0.6時，加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，16℃、誘導表達16 h。收集菌體，并進行超聲破碎，離心后收集沉淀、上清制樣進行SDS-PAGE電泳。采用His鎳柱純化試劑盒對上清液進行純化，將純化后的蛋白用millipore超濾離心管超濾脫鹽濃縮后進行免疫。以免疫不同蛋白的鼠血清(二免后14 d)作為一抗(1∶5 000)，以羊抗兔 HRP-IgG(1∶8 000)為二抗，進行Western blot鑒定。

2 結果

2.1 6種DmGST的基因的克隆

陽性菌液經(jīng)特異性引物PCR擴增，產物凝膠電泳圖可見，在每種DmGST在相應的位置有特異性條帶，該條帶大小與目的基因大小一致，結果如圖1。

M.DNA標準 DL 2 000；1,2,3,4,5,6.DmGSTE2，DmGSTE3，DmGSTK1，DmGSTM5，DmGSTM6，DmGSTZ2 基因擴增產物。

為證明成功克隆出了相應帶有DmGST基因的質粒，將陽性菌液測序結果與目的基因進行比對。

2.2 系統(tǒng)進化分析結果

DmGST基因通過建立系統(tǒng)進化樹將其分到不同的亞型。根據(jù)Friedman等[11]對昆蟲GST基因的命名倡議將篩選出的6種GST命名為DmGSTE2、DmGSTE3、DmGSTK1、DmGSTM5、DmGSTM6、DmGSTZ2。將6種GST命名后上傳NCBI，登錄號分別為：DmGSTE2(MW280833)、DmGSTE3(MW280834)、DmGSTK1(MW280835)、DmGSTM5(MW280836)、DmGSTM6(MW280837)、DmGSTZ2(MW280838)。

2.3 6種DmGST 推定蛋白的生物信息學分析

2.3.1 6種DmGST 理化性質預測分析 使用ExPASy蛋白組學分析軟件分析了邊緣革蜱GST基因編碼氨基酸序列的組成和理化性質，根據(jù)預測結果可知DmGSTE2、DmGSTE3、DmGSTK1、DmGSTM5、DmGSTM6、DmGSTZ2分子式(formula)分別為C1058H1635N259O305S6、C1139H1796N300O324S11、C1414H2283N457O392S9、C1209H1804N318O328S7、C476H755N127O129S5、C1106H1715N273O318S5；氨基酸數(shù)(number of amino acids)分別為 204、225、281、220、93、215；理論等電點(theoreticalpI)分別為4.95、7.55、9.67、6.92、6.72、5.34，說明DmGSTE3、DmGSTK1為堿性蛋白，其他為酸性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)(instability index)分別為 47.24、31.44、61.44、41.84、50.34、43.04，DmGSTE3低于閾值40，說明該蛋白質在溶液中性質穩(wěn)定，其他蛋白質在溶液中性質不穩(wěn)定；使用SignalP-5.0、TMHMM預測DmGST蛋白的信號肽、跨膜區(qū)，結果顯示僅DmGSTM6有信號肽和跨膜區(qū)。采用Allertop服務器預測GSTs基因編碼氨基酸的過敏性，結果顯示，6種蛋白均為非過敏原，該服務器依賴于自動交叉協(xié)方差變換的原理，即對不同長度的肽進行序列查詢，結果有較高的可信性。

2.3.2 6種DmGST氨基酸序列比對結果 6種DmGST基因通過Blast進行比對可以得知DmGSTE2與邊緣革蜱Epsilon基GST、DmGSTE3與變異革蜱Epsilon推定GST、DmGSTK1與肩突硬蜱Kappa基GST、DmGSTM5與微小扇頭蜱Mu基GST、DmGSTM6與邊緣革蜱Mu基GST、DmGSTZ2與肩突硬蜱馬來先乙酰乙酸異構酶同源性強。其中DmGSTE3同源性最高，為87.56%，DmGSTE2同源性最低，為55.56%。

M.Blue Plus Ⅱ Protein Marker。1,3,5,7.pET28a-DmGSTM5，pET28a-DmGSTZ2，pET28a-DmGSTE3，pET28a-DmGSTK1 載體破碎后沉淀；2,4,6,8.pET28a-DmGSTM5(28.01 ku)，pET28a-DmGSTZ2(28.56 ku)，pET28a-DmGSTE3(27.46 ku)，pET28a-DmGSTK1(28.67 ku)載體破碎后上清。

2.4 抗原性分析結果

抗原性預測并比對，結果顯示DmGSTE2、DmGSTM6、DmGSTZ2空間抗原表位完全重合在B細胞線性抗原表位中，一致性表現(xiàn)集中；DmGSTK1、DmGSTM5空間抗原表位重合在B細胞線性抗原表位之外，均在氨基酸序列的前端出現(xiàn)了不與B細胞線性抗原表位重疊的抗原位點；DmGSTE3空間抗原表位重合在B細胞線性抗原表位之外，在氨基酸序列的末端位置出現(xiàn)了不與B細胞線性抗原表位重疊的抗原位點，且通過多次建模分析空間位點時，均出現(xiàn)了A鏈與B鏈空間抗原表位不對稱情況。B細胞線性抗原性強弱順序可能為：DmGSTM5>DmGSTK1>DmGSTZ2>DmGSTE2>DmGSTM6>DmGSTE3；空間抗原性強弱順序可能為：DmGSTM5>DmGSTK1>DmGSTM6>DmGSTZ2>DmGSTE3>DmGSTE2。

2.5 4種不同亞型DmGST的蛋白表達與免疫印跡鑒定

將測序正確的重組菌經(jīng)IPTG誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE檢測結果顯示，pET28a-DmGSTM5、pET28a-DmGSTK1、pET28a-DmGSTZ2、pET28a-DmGSTE3重組蛋白大小與預期重組蛋白大小基本一致，并且蛋白主要表達在上清液中。純化后的蛋白濃度為1.8±0.3 μg/mL，條帶較單一，純化效果較好(圖7A)。Western blot檢測結果顯示，在預期位置出現(xiàn)特異性條帶(圖7B)，表明獲得了GST蛋白，且該蛋白能夠與相應蛋白免疫過的鼠血清發(fā)生反應。

3 討論

邊緣革蜱作為新疆革蜱的四大優(yōu)勢種之一[1]，其能通過吸血過程將攜帶的病原微生物輸送至宿主體內，引起宿主多種疾病，對畜牧業(yè)的發(fā)展帶來了重大危害。

消滅蜱蟲主要為人工除蜱、使用有機磷農藥噴灑滅蜱[15]，中西藥結合治療的同時給宿主動物體表涂抹廢舊機油[16]、接種抗蜱疫苗。接種抗蜱疫苗被認為是現(xiàn)今最有前景的滅蜱替代方法之一，在減少大量人力物力的同時，能夠避免產生動物性食品安全問題及環(huán)境污染。然而，截止到現(xiàn)在，還沒有一種抗原能超過針對微小牛蜱 (Boophilusmicroplus) 的Bm86疫苗[17]的效能。

M.Blue Plus Ⅱ Protein標準；1～4.pET28a-DmGSTM5，pET28a-DmGSTZ2，pET28a-DmGSTE3，pET28a-DmGSTK1 重組蛋白；5.陰性對照

此外，相關研究報道，蜱類控制時使用的蜱類保護性抗原被證實是有效的[18]。長角血蜱的rGST-Hl抗原對微小扇頭蜱和附加扇頭蜱具有交叉保護作用[19-20]。有研究表明，將蜱GSTs基因作為蜱類疫苗的潛在候選抗原，是因為GSTs基因的功能為降低蜱蟲的生長發(fā)育、成蜱繁殖力、產卵量和卵的孵化率，因此，能夠達成減少蜱蟲數(shù)量的目的[12,20-22]。

對核酸序列的擴增、克隆、測序、比對說明了從轉錄組數(shù)據(jù)中挑選出的這6種基因，不是殘基而是能夠對應表達蛋白的序列，且為邊緣革蜱GST家族蛋白對應的基因；根據(jù)系統(tǒng)進化分析，得出這6個基因歸類于Kappa基、Mu基、Zeta基、Epsilion基，同時對6種基因序列進行了上傳，為邊緣革蜱GST蛋白家族的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

該蛋白理化特性、空間結構、抗原性及抗原表位、過敏性進行的預測分析發(fā)現(xiàn)，DmGSTM5、DmGSTZ2、DmGSTE2、DmGSTM6為不穩(wěn)定的酸性蛋白；DmGSTK1為不穩(wěn)定的堿性蛋白，DmGSTE3為穩(wěn)定的堿性蛋白?？乖灶A測及抗原位點標記表明，GST蛋白抗原位點大多在蛋白模型外表面，這將更有利于其被宿主免疫系統(tǒng)識別和捕捉；對蛋白序列的過敏性預測結果表明邊緣革蜱6種GST不會致敏，作為外源性抗原，理論安全性較高。根據(jù)B細胞線性抗原表位與空間抗原表位分析結果來看，DmGSTM5抗原性可能最強，DmGSTK1次之。據(jù)研究文獻中RT-QPCR數(shù)據(jù)顯示Mu基GST與邊緣革蜱的攝食相關[12]，預測顯示DmGSTM6有信號肽有跨膜區(qū)，而核糖體是通過信號肽的功能而附著并合成分泌蛋白的，信號肽可使正在翻譯的核糖體附著到糙面型內質網(wǎng)膜(rER膜)上，試驗后期可以將Mu基作為候選抗原進行研究，進行抗蜱疫苗的開發(fā)，也可與其他候選抗原聯(lián)合研發(fā)混合疫苗。

本試驗進行了6種DmGST基因的克隆，成功對6種DmGST基因分亞型。構建了4種表達載體，并對其進行了表達、純化及驗證。預測了6種推定蛋白的理化性質、空間結構、抗原性和過敏性。該研究為邊緣革蜱GST家族氧化應激因子的解毒酶GST特性研究，以及蛋白作為抗蜱疫苗候選抗原研究奠定了基礎。相同家族蛋白的不同亞基在邊緣革蜱蟲體內表達量、引起何種抗體表達、免疫效果異同以及混合免疫效果尚未可知，有待后續(xù)的研究去發(fā)現(xiàn)。