王玲玲，杜蘇蘭，侯天牧，雷連成,3，易提林，袁漢文,4*，張付賢,4*

(1.長江大學動物科學學院，湖北荊州 434023；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434023；3.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林長春 130062；4.澇漬災害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點實驗室，湖北荊州 434023)

類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、鄰單胞菌屬(PlesiomonasHabs and Schubert，1962)的唯一種，屬于革蘭氏陰性、氧化酶陽性、兼性厭氧型細菌，最初由Ferguson等從人類糞便中分離得到，歸于腸桿菌科，后由于其與宋內(nèi)志賀氏菌有共同抗原，命名為類志賀鄰單胞菌[1-2]。長期以來，鄰單胞菌被認為是弧菌科的一部分，但現(xiàn)在它已被重新歸類為腸桿菌科成員[3]。類志賀鄰單胞菌是一種人-獸-魚共患病病原，人類主要通過接觸受污染的水傳播，會導致敗血癥、腦膜炎、嚴重的痢疾樣腹瀉和食物中毒等疾病，因此，該菌引起的疾病受到公共衛(wèi)生和水產(chǎn)養(yǎng)殖領域的高度關注[4-5]。

框鏡鯉(Cyprinuscarpio)屬于鯉屬(Cyprinus)、鯉科(Cyprinidae)，是歐洲鯉魚的一個變種，由德國鏡鯉經(jīng)過精心選育而來，是我國東北地區(qū)池塘養(yǎng)殖戶馴養(yǎng)和養(yǎng)殖魚的主要品種[6]?？蜱R鯉與普通鯉魚相比，具有肉質(zhì)鮮美、易于馴養(yǎng)、生長速度快等優(yōu)點，但是容易生病，抵抗力較差[7]，大規(guī)模的細菌感染給漁民造成一定的經(jīng)濟損失，已發(fā)現(xiàn)框鏡鯉會感染嗜水氣單胞菌[8]和維氏氣單胞菌[9]，但是由類志賀鄰單胞菌引起框鏡鯉患病的病例尚未見報道。

水產(chǎn)類病害主要以抗生素治療為主，而不能精準施治或過度使用抗生素，會導致耐藥菌株的產(chǎn)生，為臨床治療帶來困難，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成食品安全等潛在隱患[10]。所以迫切需要找到替代傳統(tǒng)漁類藥物的方法，以克服這些缺點。中草藥具有無毒、低抗等優(yōu)點，其本身及其次級代謝產(chǎn)物具有大量的生物活性分子，具有來源廣泛、價格低廉、易于獲取等特點，與傳統(tǒng)漁業(yè)用藥和疫苗不同，其作為漁用藥物已被廣泛研究，是新型漁藥研發(fā)的熱點方向[11]。

目前針對框鏡鯉的細菌性疾病研究較少，為了更好地預防和治療類志賀鄰單胞菌引起的框鏡鯉患病，本研究通過生理生化分析和分子鑒定對分離株QPB1進行鑒定，結合分離株QPB1的藥物敏感性、所攜帶的耐藥基因，篩選出有效的抗生素及中藥，為本次養(yǎng)殖場暴發(fā)疫情的精準施治提供建議，為該菌所致疾病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物 患病框鏡鯉由湖北荊州某水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)提供，病魚體重1.0 kg～1.5 kg。

1.1.2 主要試劑 革蘭氏染色劑、胰蛋白胨大豆瓊脂(tryptone soy agar，TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(tryptone soy broth，TSB)，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片、細菌微量生化管，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；2×PCR Mix酶、DNA Marker DL 2000 ，北京聚合美生物科技有限公司產(chǎn)品；細菌基因組提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；引物合成及測序委托生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(SW-CJ-2FD)，中國蘇州安泰空氣技術有限公司產(chǎn)品；冰箱2℃～4℃，美的集團股份有限公司產(chǎn)品；微量加樣器(2.5 μL，10 μL，20 μL，100 μL，200 μL)，艾本德中國有限公司產(chǎn)品；電子天平(ME204)，瑞士梅特勒公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)搖床(ZQZY-78CN)，上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋(YM50FC)，中國上海三申醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；旋渦混合儀(QL-902)，海門市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；梯度PCR儀(T100)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(JS-1800)，上海培清科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀(POWER 600H+HS 120+MINI VE1600)，萊普特科學儀器(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 類志賀鄰單胞菌的分離鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離 檢查記錄患病框鏡鯉的外觀癥狀，用750 mL/L酒精擦拭病魚體表進行消毒；無菌條件下解剖，觀察內(nèi)部組織器官是否有病變；接種環(huán)于體表潰瘍深處、患病組織內(nèi)部取樣，劃線接種于TSA瓊脂培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)16 h；挑取單菌落進行純化培養(yǎng)，觀察菌落特性，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 分離株的生理生化鑒定 從體表潰瘍深處劃線的平板上分離到大小均一的單菌落，命名為QPB1，對分離株進行革蘭氏染色后鏡檢。將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，挑取單菌落，涂在試紙上，在30 s之內(nèi)變?yōu)樗{色或藍紫色為強陽性，2 min內(nèi)不變色為陰性。挑取單菌落，接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，采用37℃、180 r/min的條件搖床過夜培養(yǎng)12 h，取10 μL菌液加入細菌微量生化管中，37℃培養(yǎng)24 h或48 h后進行生理生化分析。

1.2.1.3 16S rRNA鑒定 搖床培養(yǎng)后的菌液用細菌基因組提取試劑盒提取細菌基因組，使用通用引物27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT擴增QPB1的16S rRNA基因，PCR產(chǎn)物切膠回收送上海生工生物工程有限公司武漢測序部進行測序；測序結果在NCBI上進行Blast對測序結果比對分析；選取同源性較高的序列，利用MEGA 11軟件進行多序列比對，采用N-J鄰接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.1.4 特異性PCR檢測 通過對類志賀鄰單胞菌的23S rRNA基因進行特異性擴增，分別檢測類志賀鄰單胞菌在框鏡鯉的腸、腎、鰓、肝、脾中的分布情況，以恒溫培養(yǎng)16 h后長出的單菌落為檢測模板。參考文獻[12]委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司設計合成特異性引物，其序列為PS-F:TCCGAATACCGTAGAGTGCTATCC;PS-R:CTCCCCTAGCCCAATAACACCTAAA，條帶大小為284 bp，反應體系 (20 μL)：模板1 μL，2×PCR mix 10 μL，上、下游引物各1 μL、ddH2O 7 μL；PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，31個循環(huán)；72℃延伸10 min。反應后用5 μL產(chǎn)物使用10 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳，恒壓120 V電泳25 min。

1.2.2 抗生素藥物篩選

1.2.2.1 藥敏試驗 采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴散法，參照杭州微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定QPB1的耐藥性。用無菌棉簽蘸取菌液，均勻涂布整個TSA培養(yǎng)基表面。待培養(yǎng)基表面稍干后，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，置于37℃下16 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.2.2 QPB1耐藥基因檢測 參考文獻[13-15]設計合成四環(huán)素類、磺胺類和MLS(macrolides-lincosamids-streptogramins)類藥物耐藥基因引物序列(表1)，由上海生工生物工程有限公司合成。反應體系(20 μL)：模板1 μL，2×PCR mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL；四環(huán)素類耐藥基因擴增程序為：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 60 s，復性56℃ 60 s，延伸72℃ 60 s，循環(huán)數(shù)為33；最后延伸72℃ 10 min；磺胺類和MLS類耐藥基因擴增程序為：預變性94℃ 5 min；變性94℃ 30 s，復性56℃ 30 s，延伸72℃ 60 s，循環(huán)數(shù)為33；最后延伸72℃ 10 min。

1.2.3 中藥抑菌的篩選

1.2.3.1 中藥敏感試驗 選擇黃芩、蘇子、獨活、款冬花、桑皮、川貝母、天竹黃、大黃、荊芥、半夏、黃連、僵蠶、炙白附子、茯苓、羌活、桔梗、明雄黃、朱砂、枳殼、連翹、板藍根、魚腥草、全蝎、野菊花、薄荷、五味子、金銀花、五倍子、秦皮、首烏藤、丁香、蒲公英、桑白皮、板藍根、地榆、檳榔、大青葉、羅漢果、三七、烏梅共39種中藥材，參考文獻中的方法[16]，取中藥粉末2 g，加入40 mL水浸泡1 h后煎煮，沸騰后轉文火繼續(xù)煎煮2 h，后用4層紗布過濾，過濾后的藥渣繼續(xù)加入40 mL水，按上述方法進行煎煮過濾。將2次過濾的藥液濃縮為2 mL，最終濃度為1 g/mL。高壓滅菌后，放于4℃保存。

使用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在LB平板培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基上放置4個牛津杯，1個孔放入100 μL的無菌水作為空白對照，其余3個孔加入100 μL制備好的中藥藥液，于37℃培養(yǎng)16 h，測量抑菌圈直徑。

1.2.3.2 測定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC) 取無菌 96孔板，每孔中加入100 μL的TSB培養(yǎng)基，第1孔中加入100 μL的中藥藥液(終濃度 500 μg/mL)，從第2孔開始將前一孔中取出100 μL至下一孔，共設10個梯度(500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、15.625 μg/mL、7.812 5 μg/mL、3.906 25 μg/mL、3.906 25/2 μg/mL、3.906 25/4 μg/mL)，從第10孔中吸出 100 μL棄去，第11孔不加藥物，再向各孔中加入 5 μL制備好的菌懸液，第12孔不加菌和藥物，每種中藥3個重復，無菌水做空白對照。37℃培養(yǎng)24 h，以肉眼觀察到?jīng)]有渾濁的一列為最小抑菌濃度，繼續(xù)培養(yǎng)，以37℃培養(yǎng)48 h后未見渾濁的孔濃度為最小殺菌濃度。

表1 耐藥基因引物序列

2 結果

2.1 患病框鏡鯉臨床癥狀

自然發(fā)病框鏡鯉表現(xiàn)為浮頭和游動無力，反應變慢并伴有攝食減少，體表出現(xiàn)潰爛和少量出血(圖1A)，鰓絲泛白(圖1B)，腹腔中有積液。

A.體表潰爛;B.鰓絲泛白

2.2 生理生化鑒定結果

2.2.1 細菌分離結果 從體表潰瘍處劃線平板上對優(yōu)勢菌進行分離純化，得到純培養(yǎng)的單菌落QPB1，在37℃培養(yǎng)16 h，可形成表面濕潤凸起、白色不透明、有光澤的圓形菌落；染色鏡檢觀察，顯示其為革蘭氏陰性桿菌(圖2)。

A.QPB1培養(yǎng)基生長形態(tài);B.QPB1革蘭氏染色

2.2.2 生化試驗結果 生化鑒定發(fā)現(xiàn)，分離株QPB1氧化酶、硝酸鹽還原為陽性，能利用麥芽糖、半乳糖，精氨酸雙水解酶陽性，不能利用阿拉伯糖、甘露醇、蔗糖、棉子糖、山梨醇、鼠李糖，硫化氫反應陰性，葡糖糖不產(chǎn)氣(表2)；參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》，發(fā)現(xiàn)QPB1與類志賀鄰單胞菌的生化特性相符合，初步判定QPB1為類志賀鄰單胞菌。

表2 QPB1和類志賀鄰單胞菌生化鑒定結果比較

2.3 16S rRNA鑒定

利用通用引物27F和1492R擴增分離菌株的16S rRNA基因，結果如圖3A所示，擴增得到了1443 bp的基因序列，NCBI網(wǎng)站選擇Blast進行序列比對，QPB1的基因序列與GenBank中收錄的類志賀鄰單胞菌(MK397781.1)基因序列的同源性達到99.79%(圖3B)；選擇同源性較高的序列構建系統(tǒng)進化樹，結果顯示進化樹中QPB1與類志賀鄰單胞菌聚為一支。根據(jù)上述結果，進一步確定分離菌株QPB1為類志賀鄰單胞菌。

A.通用引物擴增結果；B.基于16S rRNA序列構建的系統(tǒng)進化樹A.Universal primer amplification results; B.Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA sequence

2.4 特異性PCR檢測

使用特異性引物對類志賀鄰單胞菌的23S rRNA基因進行擴增，結果顯示，在患病框鏡鯉的腸、鰓、肝和脾中均能擴增出明亮且特異的條帶，大小為284 bp，與目的片段大小一致，表示在框鏡鯉的腸、鰓、肝和脾中均存在類志賀鄰單胞菌(圖4)。

M:DL 2 000 DNA Marker;1.陰性對照;2.腸;3.腎;4.鰓;5.肝;6.脾

2.5 藥敏試驗

采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴散法，參照杭州微生物試劑有限公司的藥敏試驗判斷標準來判定類志賀鄰單胞菌的耐藥性，結果顯示分離株QPB1對慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、苯唑西林、頭孢哌酮、氨芐西林、頭孢他啶、卡那霉素、頭孢呋辛、頭孢唑林、諾氟沙星、新霉素和呋喃唑酮敏感，對羧芐西林中度敏感，對紅霉素、哌拉西林、四環(huán)素、克林霉素、麥迪霉素、萬古霉素和復方新諾明耐藥(表3)。

表3 類志賀鄰單胞菌藥敏試驗結果

2.6 耐藥基因檢測

通過PCR對QPB1所攜帶的耐藥基因進行擴增，結果顯示tetA、tetM、sulⅠ、sulⅡ擴增出特異性條帶，大小約為730 bp、580 bp、822 bp 和722 bp，與預期片段大小相符，耐藥基因tetC、erm(F)、ere(D)、lnu(H)均未檢出(圖5)。

2～6.陰性對照;8～12.為細菌檢測2-6.Negative controls;8-12.Bacterial detection

2.7 中藥抑菌試驗

中藥抑制QPB1試驗結果為丁香、連翹、黃連、五倍子、黃芩、荊芥、地榆、首烏藤、大黃、野菊花和烏梅對QPB1表現(xiàn)出明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均大于11 mm。黃連和烏梅的最小抑菌濃度為3.906 25 μg/mL，最小殺菌濃度為7.812 5 μg/mL，其余藥物的最小抑菌和最小殺菌濃度為7.812 5 μg/mL～500 μg/mL(表4)。

表4 中藥抑菌結果

3 討論

類志賀鄰單胞菌廣泛分布于自然界，主要儲存地為水生環(huán)境，魚類是其常見宿主，也是一種人-獸-魚共患病原菌[17]。本研究中類志賀鄰單胞菌分離自荊州區(qū)某水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)患病框鏡鯉體內(nèi)。首先通過對病魚體表觀察，發(fā)現(xiàn)自然發(fā)病框鏡鯉表現(xiàn)為反應遲鈍，攝食減少，伴有腹水，肛門紅腫，體表有潰瘍；分析框鏡鯉整體病變，發(fā)現(xiàn)與類志賀鄰單胞菌引起的病理現(xiàn)象高度相似，因此對病魚的體表、腮、腹腔積液、腸、肝等進行了細菌分離，對所分離出的優(yōu)勢菌落純化后，進行生理生化鑒定，鑒定結果與前人對類志賀鄰單胞菌的研究結果一致[18-19]；測序鑒定該菌株的基因序列與類志賀鄰單胞菌(MK397781.1)基因序列同源性為99.86%，結合生理生化特性和分子特征分析確定菌株QPB1為類志賀鄰單胞菌。通過對類志賀鄰單胞菌的23S rRNA基因進行特異性擴增發(fā)現(xiàn)在患病框鏡鯉的腸、鰓絲和肝中均存在類志賀鄰單胞菌。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，治療細菌感染目前主要以抗生素為主，對于抗生素的使用應該標準化、合理化，防止濫用的情況發(fā)生。為了更好的指導該養(yǎng)殖場合理用藥，減少框鏡鯉傷亡，本研究對該菌株的耐藥性進行了檢測，發(fā)現(xiàn)其對紅霉素、哌拉西林、四環(huán)素、克林霉素、麥迪霉素、萬古霉素和復方新諾明耐藥，對慶大霉素、環(huán)丙沙星、頭孢曲松、苯唑西林、頭孢哌酮、氨芐西林、頭孢他啶、卡那霉素、頭孢呋辛、頭孢唑林、諾氟沙星、新霉素、呋喃唑酮敏感，對羧芐西林中度敏感，并通過耐藥基因篩查證實菌株QPB1含有磺胺類和四環(huán)素類耐藥基因，因此該養(yǎng)殖場可在治療細菌感染中避免此類抗生素的使用。分離株QPB1的藥敏試驗與其他研究人員的試驗結果存在差異[20-22]，這可能是由于時間、地區(qū)以及抗生素使用史有關，也提示在臨床治療中要重視藥物的敏感性，精準用藥。

利用中藥治療水產(chǎn)類細菌病的已多有報道[23-25]，測定的中藥最小抑菌濃度和最小殺菌濃度對指導臨床用藥有一定的參考意義。賴曉健等研究人員研究了10味中藥和14種復方藥對類志賀鄰單胞菌的體外抑菌作用，結果表明，10味中藥均有較好的抑菌效果，其MIC和MBC范圍為2 mg/mL～24 mg/mL，其中五倍子、丁香和生地榆的效果最好[26]。本研究對從框鏡鯉體內(nèi)分離的類志賀鄰單胞菌進行中藥抑制試驗，篩選到丁香、連翹、黃連、五倍子、黃芩、荊芥、地榆、首烏藤、大黃(熟)、野菊花和烏梅對類志賀鄰單胞菌分離株表現(xiàn)出明顯的抑制作用，其中黃連、烏梅、野菊花和大黃抑菌效果最為顯著；與前人的研究結果存在差異可能是由于實驗方法、條件等不一致，所試菌株毒力、藥物采集地區(qū)、季節(jié)、部位(根、莖、葉、花、果實、種子)、植物年齡(多年生植物藥)、貯藏炮制方法均可能影響實驗結果的差異[27]。本研究對從患病框鏡鯉中分離出來的類志賀鄰單胞菌進行抗菌藥物的篩選，結合中藥體外抑菌試驗結果，為水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)精準施治提供指導意見。目前，本研究針對中藥對類志賀鄰單胞菌的抑制作用僅進行了體外試驗，由于臨床試驗的局限性尚未進行體內(nèi)試驗，后續(xù)將針對中藥單方及復方用藥進行魚體內(nèi)試驗，為此后企業(yè)開展聯(lián)合用藥提供理論基礎。