吳昊天，滿初日嘎*，劉 昂，何美榮，侯思?jí)?，李崇瑞，?麗，陳巧玲，陳 思，王鳳陽(yáng)，李 昌，金寧一

(1.海南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，海南省熱帶動(dòng)物繁育與疫病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海口市動(dòng)物基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228；2.軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所,吉林長(zhǎng)春 130122)

多殺性巴氏桿菌是巴氏桿菌科巴氏桿菌屬的革蘭氏陰性短桿或者球桿菌，為本屬中最廣泛引起畜禽疾病的細(xì)菌。本菌具有廣泛宿主性，可以感染包括羊、牛、豬、兔以及雞等多種家禽家畜，主要造成呼吸道系統(tǒng)損傷以及敗血癥。目前多殺性巴氏桿菌的的檢測(cè)方法除了傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)以外，還有PCR、LAMP[1]、RPA與RAA[2]等核酸檢測(cè)手段。

布魯氏菌是布魯氏菌屬的馬爾他(羊種)布魯氏菌、流產(chǎn)(牛種)布魯氏菌、豬布魯氏菌、綿羊布魯氏菌、沙林鼠布魯氏菌和犬布魯氏菌的統(tǒng)稱[3]，可以引起人和多種動(dòng)物疾病。已經(jīng)建立的分子生物學(xué)的診斷方法除了傳統(tǒng)的PCR以外，還有ddPCR[4]、qPCR[5]、RPA-LFD[6]等多種方法。

套式PCR是使用內(nèi)外兩對(duì)引物對(duì)目的DNA片段進(jìn)行兩輪擴(kuò)增的技術(shù)，第一輪擴(kuò)增使用外側(cè)引物對(duì)全長(zhǎng)進(jìn)行擴(kuò)增，第二輪使用內(nèi)側(cè)引物對(duì)全長(zhǎng)內(nèi)較短的片段進(jìn)行擴(kuò)增。該方法擁有高靈敏度，高特異性的優(yōu)點(diǎn)。目前使用雙重套式PCR同時(shí)對(duì)多殺性巴氏桿菌和布魯氏菌這兩種羊常見的細(xì)菌的檢測(cè)方法還未見報(bào)道。本研究建立了一種快捷、準(zhǔn)確和高靈敏度的雙重套式PCR，以期能夠在多種樣本中檢測(cè)這兩種病原菌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病原及細(xì)菌 多殺性巴氏桿菌、海藻糖巴氏桿菌、豬鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、斯氏假單胞菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離，布魯氏菌S2株購(gòu)自金宇保靈生物藥品有限公司，大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均購(gòu)自國(guó)家微生物資源平臺(tái)。

1.1.2 樣本來(lái)源 3份布魯氏菌陽(yáng)性樣本來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)保存的綿羊攻毒布魯氏菌S2株后的下頜淋巴結(jié)樣本，3份多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性樣本來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室保存的山羊攻毒多殺性巴氏桿菌后的肝臟樣本，3份陰性樣本來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)室保存的健康山羊組織樣本。

1.1.3 主要試劑 2×TaqPlus Master MixⅡ，中國(guó)南京諾唯贊生物科技股份有限公司產(chǎn)品；DNA Marker B，中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖，德國(guó)Biofroxx公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒少量提取試劑盒、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、pGM-T連接試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，均為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)，均為北京青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.4 主要儀器 PCR儀(Biometra TOne 96G)，德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品；超微量分光光度計(jì)(NanoPhotometer N50)，德國(guó)IMPLEN公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)(ChampChemi 610)，北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-12)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的多殺性巴氏桿菌kmt1基因序列和布魯氏菌BCSP31基因序列，使用Primer primer5軟件針對(duì)每個(gè)基因各設(shè)計(jì)了1對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品引物、1對(duì)外引物和1對(duì)內(nèi)引物。其中外引物產(chǎn)物在標(biāo)準(zhǔn)品引物產(chǎn)物內(nèi)側(cè)，內(nèi)引物產(chǎn)物在外引物產(chǎn)物內(nèi)側(cè)。序列見表1。

1.2.2 細(xì)菌 DNA模板制備 分別將多殺性巴氏桿菌、海藻糖巴氏桿菌、豬鏈球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、斯氏假單胞菌、布魯氏菌、大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌劃線接種于TSA平板。37℃培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于5 mL TSB培養(yǎng)基。37℃振蕩培養(yǎng)18 h后，取4 mL菌液分別按照天根細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌基因組。

1.2.3 樣本DNA模板制備 所有凍存的樣品均按照天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取樣品內(nèi)的山羊與細(xì)菌的總DNA。

表1 引物序列

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒構(gòu)建 使用標(biāo)準(zhǔn)品引物，分別以多殺性巴氏桿菌基因組或布魯氏菌基因組為模板進(jìn)行PCR，反應(yīng)體系為50 μL，包括2×TaqPlus Master MixⅡ25 μL、kmt1-STF/BCSP31-STF(10 μL/L)與kmt1-STR/BCSP31-STR(10 μL/L)各1 μL、模板2 μL，用ddH2O補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)條件為95℃ 3 min；95℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，按照天根瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說(shuō)明書回收目的條帶。使用pGM-T連接試劑盒將回收的目的條帶與pGM-T載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌感受態(tài)DH5α，挑取陽(yáng)性菌落至液體LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12 h后，按照天根質(zhì)粒少量提取試劑盒提取重組質(zhì)粒DNA并測(cè)序。

1.2.5 雙重套式PCR反應(yīng)體系建立 以多殺性巴氏桿菌和布魯氏菌基因組為第一輪反應(yīng)的模板，建立多殺性巴氏桿菌與布魯氏菌雙重套式PCR體系。第一輪反應(yīng)體系為20 μL，包括2×TaqPlus Master MixⅡ10 μL、kmt1-outF(10 μL/L)，kmt1-outR(10 μL/L)，BCSP31-outF(10 μL/L)與BCSP31-outR(10 μL/L)各0.5 μL、模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。

第一輪反應(yīng)產(chǎn)物稀釋100倍后作為第二輪反應(yīng)的模板。第二輪反應(yīng)體系為20 μL，包括2×TaqPlus Master MixⅡ10 μL、kmt1-inF(10 μL/L)，kmt1-inR(10 μL/L)，BCSP31-inF(10 μL/L)與BCSP31-inR(10 μL/L)各0.5 μL、模板1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 3 min；95℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 20 s，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min。產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.6 雙重套式PCR特異性測(cè)定 分別以沙門氏菌、豬鏈球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、海藻糖巴氏桿菌和斯氏假單胞菌基因組為模板進(jìn)行雙重套式PCR，產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.7 雙重套式PCR靈敏度檢測(cè) 測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算其拷貝數(shù)。將已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋后作為反應(yīng)模板分別進(jìn)行雙重套式PCR和普通PCR，產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

普通PCR的體系與條件除使用標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板以外，其余均與第二輪套式PCR相同。

1.2.8 雙重套式PCR檢測(cè)病料 以多殺性巴氏桿菌陽(yáng)性病料和布魯氏菌陽(yáng)性病料提取的DNA為模板，用雙重套式PCR進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重套式PCR反應(yīng)體系建立

成功建立雙重套式PCR反應(yīng)，使用目標(biāo)細(xì)菌基因組為模板，兩輪反應(yīng)均無(wú)非特異性條帶產(chǎn)生，且條帶清晰(圖1)。

A.第一輪擴(kuò)增：M.Maker；1.空白對(duì)照；2.多殺性巴氏桿菌和布魯氏菌；3.布魯氏菌；4.多殺性巴氏桿菌

2.2 雙重套式PCR的特異性

使用沙門氏菌、豬鏈球菌、大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、海藻糖巴氏桿菌和斯氏假單胞菌八種常見細(xì)菌或者羊源細(xì)菌的基因組作為模板進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該方法特異性良好，無(wú)非特異性條帶擴(kuò)增(圖2)。

M.Maker；1.沙門氏菌；2.豬鏈球菌；3.大腸埃希氏菌；4.金黃色葡萄球菌；5.銅綠假單胞菌；6.鮑曼不動(dòng)桿菌；7.海藻糖巴氏桿菌；8.斯氏假單胞菌

2.3 雙重套式PCR的靈敏度

以梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒為模板，分別對(duì)其用雙重巢式PCR和普通PCR的方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，雙重套式PCR具有極佳的靈敏度，可達(dá)到普通PCR的100倍～1 000倍，對(duì)于kmt1最低可檢測(cè)70.9 copies/μL，對(duì)于BCSP31最低可檢測(cè)89.5 copies/μL。(圖3、4)。

A.雙重套式PCR：M.Maker；1～10.7.09×107 copies/μL～7.09×10-2 copies/μL；11.空白對(duì)照 B.普通PCR：M.Maker；1～10.7.09×107 copies/μL～7.09×10-2 copies/μL；11.空白對(duì)照A.Double nested PCR:M.Maker; 1-10.7.09×107 copies/μL-7.09×10-2 copies/μL; 11.Negative control B.Normal PCR:M.Maker; 1-10.7.09×107 copies/μL-7.09×10-2 copies/μL; 11.Negative control

A.雙重套式PCR：M.Maker；1～10.8.95×107 copies/μL～8.95×10-2 copies/μL；11.空白對(duì)照B.普通PCR：M.Maker；1～10.8.95×107 copies/μL～8.95×10-2 copies/μL；11.空白對(duì)照A.Double nested PCR:M.Maker; 1-10.8.95×107 copies/μL-8.95×10-2 copies/μL; 11.Negative controlB.Normal PCR:M-Maker; 1-10.8.95×107 copies/μL-8.95×10-2 copies/μL; 11.Negative control

2.4 雙重套式PCR檢測(cè)病料

以從多殺性巴氏桿菌或布氏桿菌S2株攻毒后的羊組織樣本提取的總DNA為模板，用雙重套式PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，雙重套式PCR可以準(zhǔn)確在組織樣本的總DNA中檢測(cè)到病原DNA(圖5)。

A.檢測(cè)感染多殺性巴氏桿菌病料：M.Maker；1～3.3份感染多殺性巴氏桿菌病料；4～6.3份陰性樣本

3 討論

病原微生物的檢測(cè)不僅是傳染病診斷的主要工具之一，對(duì)于各類傳染病的防控也有著重要的意義。最傳統(tǒng)的病原檢測(cè)方式為對(duì)樣本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，然后挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，但該方法檢測(cè)速度慢，人工成本高，不適用于大規(guī)模使用。血清學(xué)方法如凝集試驗(yàn)和ELISA雖然速度快，但是靈敏度較差，且其中針對(duì)抗體的檢測(cè)方不適用于接種過(guò)疫苗的動(dòng)物。以PCR為代表的核酸檢測(cè)方法正在不斷推廣到臨床。這類技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于靈敏度高、特異性強(qiáng)，檢測(cè)速度快[7]。多重套式PCR是將多重PCR和套式PCR結(jié)合起來(lái)的PCR技術(shù)，不但可以同時(shí)對(duì)多個(gè)病原進(jìn)行高靈敏度高特異性的檢測(cè)，而且相比于普通的PCR，同時(shí)提高了靈敏度和特異性[8]。王多智[9]等人使用套式PCR檢測(cè)綿羊梅迪-維斯納病，靈敏度可達(dá)到普通PCR的10倍。孫明[10]等建立的牛巴貝斯蟲套式PCR檢測(cè)方法的靈敏度能達(dá)到普通PCR的1 000倍。目前套式PCR在獸醫(yī)上的應(yīng)用還不廣泛，王朋林等[11]建立了豬囊孢球蟲和畢氏腸微孢子蟲的雙重套式PCR方法，張靜[12]等建立了豬圓環(huán)病毒3型套式PCR檢測(cè)方法。

多殺性巴氏桿菌病和布魯氏菌病都是羊常見的細(xì)菌性疾病。多殺性巴氏桿菌可引起包括羊、牛、豬、禽類等多種動(dòng)物的疾病，還可以通過(guò)動(dòng)物抓咬、皮膚損傷等感染人類[13]。本菌可引起羊出血性敗血癥，常導(dǎo)致幼羊胸腔和肝臟病變，病死率高，傳播速度快[14]。多殺性巴氏桿菌能在健康動(dòng)物的呼吸道黏膜生存，因此在成年羊多為隱性感染[15]。布魯氏菌主要侵染羊的生殖系統(tǒng)，具有較長(zhǎng)的潛伏期。被感染的公羊表現(xiàn)為睪丸炎，母羊會(huì)表現(xiàn)為流產(chǎn)和子宮內(nèi)膜炎等癥狀，并會(huì)隨著分娩或者流產(chǎn)大量排出細(xì)菌[16]。布魯氏菌可以通過(guò)直接接觸、消化道誤食和呼吸道吸入感染人類[17]。這兩種細(xì)菌均容易隨著無(wú)癥狀的動(dòng)物傳播，且對(duì)動(dòng)物和人員都具有一定的危害性。為了保證動(dòng)物與畜牧從業(yè)人員的健康，防止這兩種細(xì)菌的傳播，需要建立一種高靈敏度、高特異性的檢測(cè)方法來(lái)對(duì)這兩種細(xì)菌進(jìn)行篩查。

本研究建立了一種可以同時(shí)對(duì)多殺性巴氏桿菌和布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)的高靈敏度和特異性的方法。試驗(yàn)顯示，本方法具有良好的特異性，對(duì)于多種常見或者羊源的細(xì)菌均無(wú)非特異性擴(kuò)增。本方法具有極高的靈敏性，最低可以檢測(cè)70.9 copies/μL的kmt1基因或者89.5 copies/μL的BCSP31基因，靈敏度可達(dá)普通PCR的100倍。此外，本方法能夠準(zhǔn)確地在人工感染動(dòng)物的不同器官組織樣本中檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的細(xì)菌，并且不會(huì)對(duì)陰性樣本有非特異性擴(kuò)增。使用本方法可以在3 h內(nèi)一次檢測(cè)兩種病原核酸，并且由于高特異性和靈敏度，可以適應(yīng)多種來(lái)源的樣本，且無(wú)需對(duì)樣本DNA進(jìn)行額外的富集。相比于多重qPCR、多重RPA、多重LAMP等檢測(cè)手段，多重套式PCR成本低廉，操作簡(jiǎn)便，在畜群凈化、動(dòng)物檢疫、疾病診斷等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。