王亞新，劉春羽，侯麗娜，溫永俊，王鳳雪

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)的病原是牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)，屬于牛皰疹病毒1型(BoHV-1)。該病毒外觀呈球狀，可引起多種不同的臨床表現(xiàn)，從上呼吸道疾病、鼻炎、外陰陰道炎、腸炎、結(jié)膜炎、流產(chǎn)和腦炎，到新生小牛致命的全身感染[1]。IBRV主要引起上呼吸道感染，具有高度傳染性。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)將該病列為必須報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[2]。因?yàn)樗餍蟹秶鷺O其廣泛，又常引起潛伏感染，造成病牛終身帶毒并不斷向外界排毒，防治困難極大[3]。因此，IBRV對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成了重大影響。而目前的防疫措施仍是以疫苗免疫為主，建立IBRV早期特異性診斷方法具有重要意義。

目前已有的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的病毒分離鑒定、血清學(xué)診斷方法、PCR方法、熒光定量PCR方法等[4]。傳統(tǒng)的病毒分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng)、過程復(fù)雜，血清學(xué)診斷一般要在病毒感染機(jī)體數(shù)天后產(chǎn)生抗體才能檢測(cè)，二者均不能滿足臨床快速診斷的需要；而熒光定量PCR方法具有操作簡(jiǎn)便、快速、可視化的特點(diǎn)，其較普通PCR方法有更高的靈敏性，且省去了進(jìn)行核酸凝膠電泳分析步驟，既節(jié)省時(shí)間提高了效率，又避免二次開蓋造成交叉污染。gB基因是IBRV囊膜中存在的重要糖蛋白之一，因?yàn)樗哂泄δ芴匦?，參與病毒侵入、病毒基因表達(dá)、復(fù)制和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[5]，且gB基因高度保守[6]。故本研究擬針對(duì)IBRV的保守區(qū)gB建立一種熒光定量PCR方法，為牛傳染性鼻氣管炎的快速診斷提供一種方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及樣品 牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院溫永俊實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存。牛副流感病毒(Bovine parainfluenza virus,BPIV)、牛呼吸道合胞體病毒(Bovine respiratory syncytial virus,BRSV)由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 GoTaq?qPCR Master Mix，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；病毒質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；LATaqDNA聚合酶，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金公司產(chǎn)品；pET-32a載體由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院溫永俊實(shí)驗(yàn)室保存；T4 DNA連接酶、Hind Ⅲ、KpnⅠ限制性核酸內(nèi)切酶，NEB(北京)有限公司產(chǎn)品；牛腎細(xì)胞(MDBK細(xì)胞)，昆明細(xì)胞庫(kù)產(chǎn)品；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；胰蛋白酶-EDTA消化液以及青鏈霉素混合液，北京索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 Applied BiosystemsTMQuantStudio 5實(shí)時(shí)定量PCR儀、細(xì)胞培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；PCR基因擴(kuò)增儀，德國(guó)耶拿分析儀器股份公司產(chǎn)品；BSC-1300ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 參考NCBI中IBRV的全基因組 (GenBank:AJ004801.1) ，針對(duì)IBRV gB基因的保守區(qū)，利用Primer 5軟件，設(shè)計(jì)gB基因的上、下游引物Hind Ⅲ-gB-F、KpnⅠ-gB-R，用于構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒，片段大小為1 098 bp。引物IBRV-F、IBRV-R為SYBR GreenⅠ熒光定量PCR的上、下游引物。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.2.2 陽(yáng)性重組質(zhì)粒的構(gòu)建 從500 μL病毒液中提取IBRV基因組，以IBRV基因組為模板使用IBRV gB基因的上、下游引物Hind Ⅲ-gB-F、KpnⅠ-gB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)體系為：Buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 4 μL，IBRV基因組模板1 μL，LATaq0.25 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性 30 s，60℃ 退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。擴(kuò)增后經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，將gB基因片段回收純化后用T4 DNA連接酶連接pET-32a載體，構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒pET32a-gB。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至trans 5α感受態(tài)細(xì)胞中，置于37℃搖床活化1 h后，涂于氨芐抗性的普通瓊脂板，12 h～16 h挑出單個(gè)菌落進(jìn)行搖菌擴(kuò)增，37℃搖床培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證。采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定陽(yáng)性重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度，根據(jù)公式：拷貝數(shù)=6.02×1023(拷貝數(shù)/mol)×DNA量(g)/[DNA長(zhǎng)度(堿基數(shù))×660 Da/堿基]，計(jì)算陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì)IBRV陽(yáng)性重組質(zhì)粒依次進(jìn)行10倍梯度稀釋,選取1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×1046個(gè)連續(xù)梯度的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)體系為：SYBR GreenⅠ10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s；95℃ 15 s，64℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 1 s。進(jìn)行熒光定量PCR，以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 將構(gòu)建好的陽(yáng)性質(zhì)粒模板以1×108為初始拷貝數(shù)進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別按照已優(yōu)化好的條件進(jìn)行qPCR和普通PCR擴(kuò)增，用ddH2O作為陰性對(duì)照，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果得出最低檢測(cè)的拷貝數(shù)。

1.2.5 特異性試驗(yàn) 以BPIV、BRSV、BVDV與IBRV的核酸作為模板，以ddH2O為陰性對(duì)照，按照優(yōu)化后的條件同時(shí)進(jìn)行qPCR，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將構(gòu)建好的陽(yáng)性質(zhì)粒模板以初始拷貝數(shù)為進(jìn)行10倍倍比稀釋，每個(gè)稀釋度進(jìn)行3次重復(fù)qPCR擴(kuò)增，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算同一稀釋度的不同孔間的變異系數(shù)；在不同時(shí)間段進(jìn)行3次重復(fù)qPCR擴(kuò)增，進(jìn)行組間重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算同一稀釋度的不同檢測(cè)次數(shù)的變異系數(shù)。根據(jù)結(jié)果檢驗(yàn)SYBR GreenⅠqPCR方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.2.7 病毒滴度與拷貝數(shù)的關(guān)系 培養(yǎng)MDBK細(xì)胞，待其生長(zhǎng)至80%～90%時(shí)用IBRV親本病毒感染，待細(xì)胞病變至90%左右時(shí)凍融3次，離心后收取上清，將收的IBRV 病毒液進(jìn)行10倍倍比稀釋，分別以稀釋度10-1～10-10感染于生長(zhǎng)80%～90% 的96孔MDBK細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度做8個(gè)重復(fù)，每個(gè)細(xì)胞孔100 μL病毒稀釋液，同時(shí)以DMEM為陰性對(duì)照。觀察病變情況，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。用已知病毒毒價(jià)的IBRV基因組進(jìn)行10倍倍比稀釋，取病毒滴度107、106、105、104的基因組，按優(yōu)化好的條件進(jìn)行qPCR,將所得CT值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出相應(yīng)拷貝數(shù)，從而建立病毒毒價(jià)與相應(yīng)拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增gB基因

以IBRV核酸為模板，用gB基因上、下游引物Hind Ⅲ-gB-F、KpnⅠ-gB-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得目的片段大小為1 098 bp，與預(yù)期相符。

將目的片段連接至pET-32a載體上，構(gòu)建陽(yáng)性重組質(zhì)粒，經(jīng)Hind Ⅲ、KpnⅠ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定結(jié)果正確，目的片段大小為1 098 bp， pET-32a載體大小為5 900 bp， 經(jīng)測(cè)序鑒定正確。說明陽(yáng)性重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。經(jīng)計(jì)算質(zhì)粒的拷貝數(shù)為5.474×1010拷貝/μL。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000; 1.gB基因擴(kuò)增產(chǎn)物；2.陰性對(duì)照

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5000; 1.pET32a-gB雙酶切產(chǎn)物

2.2 IBRV gB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以拷貝數(shù)為5.474×109～5.474×104拷貝/μL的陽(yáng)性重組質(zhì)粒為模板，按照以優(yōu)化的SYBR GreenⅠqPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸，以3次CT值的平均CT值為y軸建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=-3.351 3x+40.218，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 3。

2.3 熔解曲線

熔解曲線在87℃左右出現(xiàn)較均一的單峰，說明靶序列為特異性擴(kuò)增，沒有引物二聚體或非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。

圖3 IBRV gB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

2.4 敏感性試驗(yàn)

將構(gòu)建好的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋,以5.474×108拷貝數(shù)為初始濃度，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，本研究針對(duì)IBRVgB基因建立的SYBR GreenⅠqPCR方法可檢測(cè)的最低拷貝數(shù)為5.747×102拷貝/μL，比普通PCR敏感性高10倍。

2.5 特異性試驗(yàn)

用本研究建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法，以BPIV、BRSV、BVDV與IBRV的核酸作為模板同時(shí)進(jìn)行的qPCR特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，只檢測(cè)出IBRV樣品為陽(yáng)性，BPIV、BRSV、BVDV、ddH2O均為陰性,說明該方法特異性良好，未與其他幾種病毒產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

將構(gòu)建好的陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，取5個(gè)稀釋度的質(zhì)粒為模板，按照已優(yōu)化的SYBR GreenⅠ qPCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。分別得到3次組內(nèi)重復(fù)性結(jié)果和3次組間重復(fù)性結(jié)果，利用CT值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差，計(jì)算每個(gè)稀釋度的變異系數(shù)。結(jié)果可見每個(gè)稀釋度的3次重復(fù)性結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)均小于1%，組間變異系數(shù)均小于2%，說明該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。

2.7 病毒滴度與基因拷貝數(shù)的關(guān)系

用已知病毒毒價(jià)的IBRV基因組進(jìn)行10倍倍比稀釋，取病毒滴度108、107、106、105的基因組為模板，按優(yōu)化好的條件進(jìn)行qPCR，所得CT值分別為帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.351 3x+40.218，得出相應(yīng)拷貝數(shù)，以病毒滴度的對(duì)數(shù)為y軸，以病毒拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸建立病毒滴度與病毒拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，經(jīng)計(jì)算回歸方程為y=0.797 7x-1.109 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.985 4，表明病毒滴度與病毒拷貝數(shù)的線性關(guān)系較好。

圖4 IBRV gB基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的熔解曲線

1.5.474×108拷貝/μL; 2.5.474×107拷貝/μL; 3.5.474×106拷貝/μL; 4.5.474×105拷貝/μL; 5.5.474×104拷貝/μL; 6.5.474×103拷貝/μL; 7.5.474×102拷貝/μL

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 500；1.5.474×108拷貝/μL; 2.5.474×107拷貝/μL; 3.5.474×106拷貝/μL; 4.5.474×105拷貝/μL; 5.5.474×104拷貝/μL; 6.5.474×103拷貝/μL; 7.5.474×102拷貝/μL；8.5.474×101拷貝/μL；9.陰性對(duì)照

表2 組內(nèi)重復(fù)性結(jié)果

表3 組間重復(fù)性結(jié)果

1.牛傳染性鼻氣管炎病毒；2.牛呼吸道合胞體病毒；3.牛副流感病毒；4.牛病毒性腹瀉病毒

表4 病毒滴度、CT值與病毒拷貝數(shù)

圖8 IBRV病毒滴度與病毒拷貝數(shù)的關(guān)系圖

3 討論

牛傳染性鼻氣管炎病毒可呈現(xiàn)顯性發(fā)病或者隱性感染[7]，且IBRV一旦感染將處于終身潛伏帶毒狀態(tài)?；疾∨＝?jīng)各種應(yīng)激狀態(tài)或經(jīng)皮質(zhì)類固醇物質(zhì)[8]刺激后病毒可自我激活，導(dǎo)致復(fù)發(fā)[9]。該病給全球養(yǎng)牛業(yè)及乳制品產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[10]。

張喜喜[11]等建立的牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因TaqMan探針及SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR方法，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為100拷貝/μL；劉占悝[12]等建立的牛傳染性鼻氣管炎病毒SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為3.04×101拷貝/μL；王海軍[13]等建立的牛傳染性鼻氣管炎病毒gB基因熒光定量PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為10 拷貝/μL；本試驗(yàn)建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，最低檢測(cè)拷貝數(shù)為5.747×102拷貝/μL；圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線可見不同稀釋度的樣品對(duì)應(yīng)CT值的距離基本相等，擴(kuò)增效率為98.8%，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線建立成功。通過表2和表3的數(shù)據(jù)顯示，組間試驗(yàn)和組內(nèi)試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2%，可見該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性良好；圖5特異性結(jié)果可見，只有IBRV在可信區(qū)間出現(xiàn)擴(kuò)增曲線而其他病毒未在可信區(qū)間出現(xiàn)擴(kuò)增，可見該方法對(duì)IBRV有良好的特異性；病毒滴度與病毒拷貝數(shù)的線性相關(guān)系數(shù)R2=0.985 4，表明病毒滴度與病毒拷貝數(shù)具有良好的線性關(guān)系，因此該方法在特異性檢測(cè)IBRV的基礎(chǔ)上，還可以為檢測(cè)IBRV的病毒滴度提供參考。

常規(guī)病毒滴定檢測(cè)的是具有感染性的活病毒粒子的效價(jià)，而本研究建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的是病毒核酸，其中包含了具有感染性的活病毒粒子核酸以及已經(jīng)失活喪失感染性的病毒核酸。失活病毒雖沒有感染性但保留了抗原性和免疫原性，可以作為疫苗的有效成分。所以本方法還能對(duì)活疫苗滴度進(jìn)行檢測(cè)，既可以節(jié)約常規(guī)病毒滴定檢測(cè)活疫苗滴度的時(shí)間又節(jié)約了成本。熒光定量PCR能夠解決普通PCR只能定性而不能定量的問題，且其具有較高的敏感性和特異性[14]。而SYBR Green Ⅰ熒光定量PCR檢測(cè)方法的整體診斷潛力與TaqMan熒光定量檢測(cè)方法相當(dāng)[15]，而相較于TaqMan熒光定量PCR方法，SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法在實(shí)際臨床檢測(cè)中更便捷、更經(jīng)濟(jì)，更適用。綜上所述，本試驗(yàn)所建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，為IBRV的快速特異性臨床檢測(cè)提供了技術(shù)支持。