邱澤成，陳斌，林燕鳳，李柳生，陳健健，王仕佳，黃雄沛

（廣東省茂名市人民醫(yī)院 肝膽胰肛腸外科，廣東 茂名 525000）

肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤疾病之一，其發(fā)病率逐年升高。臨床研究顯示，患者行肝癌根治術(shù)后5 年的復(fù)發(fā)率超過(guò)60%，由于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移常常導(dǎo)致預(yù)后不佳，近年來(lái)死亡率也居高不下［1］。目前，術(shù)前尚無(wú)確切的生物學(xué)指標(biāo)可提示術(shù)后復(fù)發(fā)及預(yù)后情況，而術(shù)后則常采用腹部超聲及血清甲胎蛋白（AFP）對(duì)肝癌預(yù)后進(jìn)行監(jiān)測(cè)，但不能準(zhǔn)確地提示早期復(fù)發(fā)時(shí)間點(diǎn)，也不能精準(zhǔn)地給予干預(yù)治療，存在一定的局限性［2］。因此，若能尋找經(jīng)濟(jì)、實(shí)用、準(zhǔn)確性高的指標(biāo)，改善肝癌患者術(shù)后預(yù)后，將產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)效益，降低醫(yī)療費(fèi)用，提高肝癌疾病的治愈率。研究證實(shí)肝癌細(xì)胞會(huì)釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，稱(chēng)為循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTCs），并存儲(chǔ)在各個(gè)器官，從而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，或者返回殘肝臟或新生的健康肝臟，而從導(dǎo)致肝內(nèi)復(fù)發(fā)。CTCs 計(jì)數(shù)和分子特征的鑒定可以為監(jiān)測(cè)肝癌患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、個(gè)體化治療方案及判斷預(yù)后提供依據(jù)［3］。超敏C 反應(yīng)蛋白（hs-CRP）雖非腫瘤標(biāo)志物，但在腫瘤發(fā)生時(shí)常有升高［4］。本研究嘗試通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)兩指標(biāo)，希望提高對(duì)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)判斷，包括復(fù)發(fā)高危度、時(shí)間點(diǎn)、治療效果、耐藥性?；诖耍狙芯繙y(cè)定了手術(shù)前后患者CTSs 和hs-CRP 水平變化，探究術(shù)前術(shù)后CTCs 數(shù)量、hs-CRP 水平與術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的關(guān)系，并對(duì)肝癌預(yù)后復(fù)發(fā)情況進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取廣東省茂名市人民醫(yī)院2017 年12 月至2019 年12 月收治的60 例原發(fā)性肝癌患者作為研究對(duì)象。60 例肝癌患者男38例，女22例，年齡52～79歲，平均（64.38±11.24）歲。同時(shí)，選取30 例健康體檢者作為對(duì)照，無(wú)肝癌等惡性腫瘤、心血管疾病、肝腎等器質(zhì)性病變健康體檢者；其中男17例，女13例，年齡48～74歲，平均（60.15±9.54）歲，。

納入標(biāo)準(zhǔn)［5-6］：①術(shù)前影像學(xué)檢查均未見(jiàn)腫瘤肝外轉(zhuǎn)移灶，且術(shù)后均經(jīng)病理檢查明確診斷；②術(shù)前美國(guó)麻醉師協(xié)會(huì)（ASA）評(píng)分Ⅰ～Ⅱ級(jí)者；③均簽署知情同意書(shū)，自愿參加者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤或自身免疫疾病者；②合并心血管疾病者；③不配合檢查，中途退出者。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

術(shù)前及術(shù)后1 周采集靜脈血10 mL 應(yīng)用CanPatrol 檢測(cè)外周血中CTCs 數(shù)量及分型。采取利用CanPatroTM-CTC-二代捕獲技術(shù)聯(lián)合RNA 多重原位雜交分析測(cè)定CTCs 數(shù)量［78］。具體如下：采集血樣后，離心去除上清液，固定劑固定8 min；連接真空泵，將樣品液體轉(zhuǎn)移至過(guò)濾器，完成腫瘤細(xì)胞納米技術(shù)截留與富集，甲醛溶液固定60 min后PBS 洗滌晾干。再根據(jù)CanPatro-CTC-二代捕獲技術(shù)及RNA-ISH 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA 多重原位雜交分析檢測(cè)。

術(shù)前及術(shù)后1 周采集靜脈血2 mL，3 000 r/min離心10 min 后取上清液，采用放免法，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)hs-CRP 和AFP。

隨訪(fǎng)情況：術(shù)后第1 年每個(gè)月、術(shù)后第2 年后每2 個(gè)月采集靜脈血進(jìn)行復(fù)查，包括hs-CRP、AFP、肝功能，同時(shí)還配合影像學(xué)檢查如肝臟B超、CT、MRI 或血管造影等。當(dāng)患者AFP 水平異常增高時(shí)，復(fù)查隨訪(fǎng)則改為每個(gè)月1次，若確診為肝癌復(fù)發(fā)，則取血樣再次進(jìn)行CTCs 測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間差異采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析；計(jì)數(shù)資料以百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。同時(shí)，采用一元線(xiàn)性回歸分析評(píng)估CTCs 數(shù)量、hs-CRP 水平與術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對(duì)照者與肝癌患者手術(shù)前后CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平比較

術(shù)前，肝癌患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平顯著高于健康者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。術(shù)后，肝癌患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平較術(shù)前均顯著降低（P＜0.05），但仍高于健康人群，其中CTCs 數(shù)量與健康對(duì)照者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 健康對(duì)照者與肝癌患者手術(shù)前后CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平分析（）

表1 健康對(duì)照者與肝癌患者手術(shù)前后CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平分析（）

注：1）與健康對(duì)照比較，P＜0.05；2）與術(shù)前比較，P＜0.05。

2.2 術(shù)后肝癌患者隨訪(fǎng)情況分析

隨訪(fǎng)時(shí)間截止到2019 年12 月31日，隨訪(fǎng)時(shí)間為7～20 個(gè)月，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為12.76 個(gè)月。復(fù)查確診術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)患者32例，其中男18例，女13例，年齡54～76歲，平均（62.77±8.95）歲。復(fù)發(fā)時(shí)AFP≥100 ng/mL 陽(yáng)性患者23例，AFP＜20 ng/mL 陰性患者9例，復(fù)發(fā)時(shí)間5～16 個(gè)月，平均11.45 個(gè)月。

2.3 確診肝癌患者手術(shù)前后及復(fù)發(fā)時(shí)CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平變化

術(shù)后1周，肝癌患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平明顯低于術(shù)前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。確診復(fù)發(fā)時(shí)，患者CTCs、hs-CRP 及AFP 水平較術(shù)后1 周均有顯著升高（P＜0.05），但仍低于術(shù)前水平；其中CTCs 及AFP 與術(shù)前比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 術(shù)前、術(shù)后1 周及確診復(fù)發(fā)時(shí)肝癌患者血清CTCs、hs-CRP 和APF 水平變化（n=32,）

表2 術(shù)前、術(shù)后1 周及確診復(fù)發(fā)時(shí)肝癌患者血清CTCs、hs-CRP 和APF 水平變化（n=32,）

注：1）與術(shù)前比較，P＜0.05；2）與術(shù)后比較，P＜0.05。

2.4 肝癌復(fù)發(fā)患者術(shù)前及術(shù)后CTCs、hs-CRP水平與復(fù)發(fā)時(shí)AFP 相關(guān)性分析

肝癌復(fù)發(fā)患者術(shù)前的CTCs 數(shù)量與復(fù)發(fā)時(shí)腫瘤標(biāo)志物AFP 水平呈正相關(guān)（R2=0.775,P＜0.001），且術(shù)后CTCs 數(shù)量雖有所降低，但仍與AFP 水平明顯正相關(guān)（R2=0.587,P＜0.001）。同時(shí)，肝癌復(fù)發(fā)患者術(shù)前的hs-CRP 水平與復(fù)發(fā)時(shí)AFP 表現(xiàn)正相關(guān)（R2=0.673,P＜0.001）；且術(shù)后hs-CRP 水平也與AFP 呈正相關(guān)（R2=0.788,P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 術(shù)前及術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)患者CTCs、hs-CRP 水平與復(fù)發(fā)時(shí)AFP 相關(guān)性

2.5 肝癌復(fù)發(fā)患者復(fù)發(fā)時(shí)CTCs、hs-CRP 水平與復(fù)發(fā)時(shí)AFP 相關(guān)性分析

如圖2 所示，肝癌患者復(fù)發(fā)時(shí)，血樣中CTCs數(shù)量與腫瘤標(biāo)志物AFP 水平明顯正相關(guān)（R2=0.574,P＜0.001），血清hs-CRP 含量也與AFP 呈正相關(guān)（R2=0.809,P＜0.001）。

圖2 肝癌復(fù)發(fā)患者復(fù)發(fā)時(shí)CTCs、hs-CRP 水平與復(fù)發(fā)時(shí)AFP 相關(guān)性

3 討論

肝癌作為臨床常見(jiàn)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅患者生命健康安全。目前臨床多采取根治切除術(shù)進(jìn)行治療，具有良好的臨床療效。但是大量臨床實(shí)踐表明，行肝癌切除術(shù)后較易出現(xiàn)肝癌組織轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。因此，如何早期有效預(yù)測(cè)肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移成為影響肝癌患者預(yù)后重要因素，尋找肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的預(yù)后因子成為近年臨床關(guān)注的熱點(diǎn)。目前，臨床多采取AFP 作為肝癌復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移診斷重要指標(biāo)，但有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，仍有30%～40%的肝癌患者血清AFP 呈陰性，其特異性和敏感性尚有待提高［9］。相關(guān)報(bào)道指出，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與CTCs 數(shù)量存在一定相關(guān)性，且肝癌患者h(yuǎn)s-CRP水平隨著肝癌組織轉(zhuǎn)移損傷肝細(xì)胞誘發(fā)炎癥反應(yīng)而表達(dá)增加［10-11］。但目前尚未見(jiàn)聯(lián)合CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平聯(lián)合預(yù)測(cè)肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)。本研究嘗試研究肝癌患者CTCs 數(shù)量、hs-CRP 水平與術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的關(guān)系，并對(duì)肝癌預(yù)后復(fù)發(fā)情況進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)分析。

AFP 作為肝癌的重要腫瘤標(biāo)志物，在輔助診斷具有重要地位，也常用于預(yù)后評(píng)估［12］。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)查確診術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)患者32例，復(fù)發(fā)時(shí)AFP≥100 ng/mL 患者23例，AFP＜20 ng/mL 患者9例，表明僅依據(jù)AFP 作為判斷肝癌復(fù)發(fā)的指標(biāo)檢出率有限，易出現(xiàn)漏診［2,7］。檢測(cè)肝癌患者術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)CTCs、hs-CRP 水平發(fā)現(xiàn)，肝癌患者術(shù)前CTCs、hs-CRP 均顯著高于健康人群（P＜0.05）；而術(shù)后，CTCs 及hs-CRP 水平較術(shù)前有明顯降低（P＜0.05）。這是因?yàn)樾g(shù)前肝癌細(xì)胞釋放并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)及淋巴系統(tǒng)，使得循環(huán)系統(tǒng)存在CTCs；且大量研究證實(shí)，惡性腫瘤的發(fā)展與機(jī)體炎性反應(yīng)密切相關(guān)，肝癌腫瘤細(xì)胞在增殖、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，侵襲周?chē)＝M織，造成細(xì)胞損傷、凋亡，激活炎癥反應(yīng)，hs-CRP、腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎性介質(zhì)釋放，機(jī)體表現(xiàn)為微炎癥狀［13-14］。然而，確診復(fù)發(fā)時(shí)，患者CTCs、hs-CRP顯著高于術(shù)后1周，這提示肝癌患者CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平隨著癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或癌變復(fù)發(fā)而增加。CTCs 具有一定的侵襲性，經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)回到肝臟靶器官后，會(huì)黏附并聚集后形成微小癌栓，在適當(dāng)條件下，再次發(fā)生間質(zhì)-上皮化形成新生腫瘤組織，導(dǎo)致肝癌組織復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移［15-16］。因此，若肝癌患者術(shù)后CTCs 升高，則表示腫瘤細(xì)胞可能轉(zhuǎn)移，肝癌有復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，可應(yīng)用該指標(biāo)對(duì)肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)進(jìn)行早期診斷及預(yù)后評(píng)估，這與劉子鑫等［15］的研究結(jié)果一致。伴隨患者術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞增殖或肝組織壞死受損均可導(dǎo)致炎癥反應(yīng)過(guò)度激活，炎癥因子hs-CRP 表達(dá)上調(diào)［16］，因此可聯(lián)合hs-CRP 評(píng)估肝癌患者預(yù)后復(fù)發(fā)狀況。

為了進(jìn)一步探究肝癌患者CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平與患者腫瘤標(biāo)志物AFP 關(guān)系，本研究同時(shí)分析了術(shù)前，術(shù)后及確診時(shí)相關(guān)指標(biāo)與肝癌預(yù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，肝癌復(fù)發(fā)患者術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)確診時(shí)血清CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平均與腫瘤標(biāo)志物AFP 呈正相關(guān)（P＜0.001）。這表明血清CTCs 及hs-CRP 水平越高，機(jī)體腫瘤標(biāo)志物AFP 越高，肝癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)傾向越高，這與袁林、肖瀟等［17-18］的報(bào)道類(lèi)似。CTCs 和hs-CRP 可和AFP 一樣作為肝癌診療的標(biāo)志物，輔助預(yù)后診斷，尤其是肝癌術(shù)后，監(jiān)測(cè)AFP 同時(shí)還要測(cè)定聯(lián)合測(cè)定CTCs 及hs-CRP，幫助了解病情進(jìn)展，針對(duì)可能的結(jié)果及早進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)，減少肝癌復(fù)發(fā)。本研究仍有不足之處，入選樣本例數(shù)較少，隨訪(fǎng)時(shí)間不長(zhǎng)，后續(xù)會(huì)加大樣本量，延長(zhǎng)隨訪(fǎng)時(shí)間，以評(píng)估患者生存期和長(zhǎng)期預(yù)后情況。

綜上所述，術(shù)前肝癌患者CTCs 及hs-CRP 水平顯著高于術(shù)后，而復(fù)發(fā)時(shí)CTCs 及hs-CRP 又明顯高于術(shù)后水平；且肝癌復(fù)發(fā)患者術(shù)前、術(shù)后及復(fù)發(fā)時(shí)，CTCs 數(shù)量及hs-CRP 水平與腫瘤標(biāo)志物AFP 均呈正相關(guān)。術(shù)后復(fù)查可聯(lián)合檢測(cè)患者CTCs數(shù)量及hs-CRP 水平，幫助預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后復(fù)發(fā)情況，促進(jìn)臨床診療。