王玉堂，逯陣毫，陳永奇，馬明，渠海

（鄭州安圖生物工程股份有限公司，河南 鄭州 450016）

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是引起慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要原因之一，該病每年造成100 萬人死亡。乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標志［1-6］?，F(xiàn)有的乙肝表面抗原的檢測有以下幾種方法［7-11］：①吖啶酯直接化學發(fā)光檢測；②堿性磷酸酶和辣根酶的酶促化學發(fā)光；③電化學發(fā)光。以上的方法均為非均相化學發(fā)光反應(yīng)，需要進行磁分離操作，會延長檢測時間，對檢測的通量有限制。本研究報道了一種利用Lumigen 公司SPARCAL 試劑構(gòu)建的均相化學發(fā)光技術(shù)，可以不需要進行磁洗的操作，即可進行檢測，大大縮短了檢測時間和耗材使用，并建立了表面抗原的檢測試劑盒并評估該試劑的分析性能和臨床相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

配對的抗體來自于鄭州安圖生物工程股份有限公司，配套試劑（激發(fā)液、本底消除劑、吖啶物質(zhì)）選用美國Lumigen 公司的SPARCAL 試劑，配套校準品選用鄭州安圖生物工程股份有限公司成品校準品（批號：20180415）、配套質(zhì)控選用鄭州安圖生物工程股份有限公司成品質(zhì)控品（批號：20171201），樣本由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供。磁微粒乙肝表面抗原檢測試劑盒來自雅培。

1.2 儀器與設(shè)備

板式化學發(fā)光儀選自德國BERTHOLD 公司生產(chǎn)的LB-960 化學發(fā)光儀。全自動化學發(fā)光儀（雅培i2000）。

1.3 實驗方法

1.3.1 吖啶-羊多抗標記 取用3.5 mg/mL 的羊多抗，用PH=8.5 的硼酸緩沖液稀釋至1 mg/mL，在離心管中加入700 μL 的硼酸緩沖液。250 μL 的硼酸緩沖液（1mg/mL），43 μL 的吖啶N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液（1 mg/m），避光室溫反應(yīng)2 h，用硼酸緩沖液稀釋至5 μg/mL，透析備用。

1.3.2 辣根過氧物酶（HRP）-抗體的標記 取用200 μL HRP 的磷酸鹽（PBS）溶液（1 mg/mL），加入5 mg/mL 的過碘酸鈉水溶液氧化30 min，PH=8.5的硼酸緩沖液進行透析過夜，加入到150 μL 的鼠單抗（1 mg/mL）中，反應(yīng)2 h，用硼酸緩沖液稀釋至0.5 μg/mL，2～8℃保存。取用200 μL HRP的PBS 溶液（1 mg/mL），加入過碘酸鈉水溶液（5 mg/mL）氧化30 min，PH=8.5 的硼酸緩沖液進行透析過夜，加入到150 μL 鼠單抗（1 mg/mL）中，反應(yīng)2 h，用硼酸緩沖液稀釋至0.5 μg/mL，2～8℃保存。

1.3.3 反應(yīng)方法建立 將25 μL 吖啶標記物、25 μL HRP 標記物、樣本加入到微孔板孔中，室溫避光反應(yīng)30 min，加入3 μL SPARCAL 本底消除劑，放入LB-960 進行測試發(fā)光值（讀取1 s 發(fā)光值總和）。

1.3.4 精密度評估方法 參考美國國家臨床實驗室標準化研究所的EP5-A2 文件指南，進行精密度試驗。采用A 公司三個濃度的質(zhì)控品進行檢測，每天上午和下午各一批，每批檢測兩次，共進行20 d，3 個濃度樣本分別獲得80 個測試結(jié)果。使用經(jīng)離群值檢驗合格的數(shù)據(jù)進行批內(nèi)、批間以及總不精密度的計算。

1.3.5 線性范圍評估方法 參考美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）的EP6-A 文件，用高值表面抗原樣本（濃度在300 IU/mL）和陰性血清兩個樣本，按照1∶0、0.95∶0.05、0.9∶0.1、0.8∶0.2、0.7∶0.3、0.6∶0.4、0.5∶0.5、0.4∶0.6、0.3∶0.7、0.2∶0.8、0.1∶0.9、0.05∶0.95、0∶1（單位：mL）配成13 個系列濃度樣本，在LB-960 上進行檢測，每孔重復檢測3次，以樣本計算濃度為X軸，以實測均值為Y 軸計算線性回歸方程。

1.3.6 臨床對比評估方法 選取40 份臨床樣本，與雅培的HBsAg 試劑進行對比，確定臨床相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 精密度考核結(jié)果

實驗結(jié)果看出乙肝表面抗原低值樣本檢測均值為0.21 mIU/mL，變異系數(shù)（CV）分別為CV批內(nèi)=4.9%，CV批間=6.7%；乙肝表面抗原中值樣本檢測均值為0.42 mIU/mL，CV批內(nèi)=4.5%，CV批間=5.8%；乙肝表面抗原高值樣本檢測均值為4.2 mIU/mL，CV批內(nèi)=3.3%，CV批間=4.6%。由表1整體結(jié)果來看，均值CV批內(nèi)=4.23%，CV批內(nèi)=5.7%，表現(xiàn)出較好的精密性。

2.2 線性評價結(jié)果

考核了自建HBsAg 試劑盒線性范圍，使用高值陽性樣本用陰性血清稀釋不同成不同樣本檢測結(jié)果見表1，理論值與檢測濃度值線性方程見圖1。

表1 樣本稀釋比例和理論濃度及實際檢測濃度數(shù)據(jù)

圖1 自建的HBsAg 試劑盒的線性評估

2.3 臨床相關(guān)性結(jié)果

考核自建HBsAg 試劑盒臨床相關(guān)性，與標桿雅培試劑盒進行了比對，共考核40 份臨床血清，其相關(guān)性見圖2。

圖2 與雅培的全自動化學發(fā)光對比分析結(jié)果

3 討論

本文建立了新型的乙肝表面抗原的檢測試劑盒，該方法檢測速度快，特異性好；相比較于現(xiàn)在市場上有的全自動化學發(fā)光儀有不需要清洗的優(yōu)勢，縮短了檢測時間，同時能夠減少耗材使用，若建立全自動化學發(fā)光平臺有比較好的應(yīng)用前景。