唐靚，張文元，李躍中

（杭州醫(yī)學(xué)院1.食品科學(xué)與工程學(xué)院；2.生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310013）

前交叉韌帶（anterior cruciate ligament,ACL）斷裂無法自愈［1］。組織工程技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用為ACL 重建提供了新的思路和方法［2］。找到合適的生物材料作為一個(gè)潛在的支架是組織工程ACL 的關(guān)鍵因素，它必須是生物相容性和可生物降解的，以允許組織長(zhǎng)入，并具有優(yōu)異的力學(xué)性能。支架降解速率應(yīng)與組織長(zhǎng)入支架速率相匹配，即降解時(shí)間要求同韌帶再生的周期相匹配，以及與之匹配的力學(xué)性能，并可模擬組織界面特性，這對(duì)于新生韌帶的形成至關(guān)重要。蠶絲脫膠后獲得的蠶絲絲素纖維具有獨(dú)特而非凡機(jī)械強(qiáng)度和韌性，具有輕比重、高強(qiáng)度、良好的黏彈性和熱穩(wěn)定性［3］，緩慢的可生物降解性，最小限度炎癥反應(yīng)，已成為用于組織工程韌帶很有吸引力的候選材料。天然蠶絲絲素纖維降解緩慢可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供長(zhǎng)久的支持，長(zhǎng)期保持優(yōu)良的機(jī)械性能。但也因降解緩慢，不能及時(shí)騰出空間導(dǎo)致阻礙組織的再生。許多研究結(jié)果表明，由于再生蠶絲絲素有一些化學(xué)鍵被打斷，一些一級(jí)結(jié)構(gòu)與高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，以至于再生蠶絲絲素材料（例如纖維、膜或多孔海綿狀材料）的降解速率明顯快于天然蠶絲絲素纖維［4-6］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用天然絲素纖維與再生絲素纖維混合緯編針織成網(wǎng)狀支架，適當(dāng)調(diào)節(jié)支架的降解速度。并通過維生素C 誘導(dǎo)制備骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs）細(xì)胞片，覆蓋于天然絲素纖維混合再生絲素纖維的緯編針織網(wǎng)上體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)情況，并測(cè)試其機(jī)械強(qiáng)度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5 mg/mL ? 型鼠尾膠原（杭州生友生物技術(shù)有限公司），α-MEM（HyClone），胎牛血清（上海翌圣）。2 wt%再生絲素溶液由本實(shí)驗(yàn)室自制［7］。桑蠶絲（Bombyx Morisilk）、再生蠶絲蛋白纖維購于杭州絲綢市場(chǎng)。新西蘭白兔，3 月齡，雌雄不限，約2 kg，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2020-0005，新昌縣大市聚鎮(zhèn)欣健兔場(chǎng)提供。

1.2 儀器與設(shè)備

掃描電鏡（SEM,XL30-ESEM,Philips-FEI,荷蘭），拉力機(jī)（QX-W300,上海企想檢測(cè)儀器有限公司），冷凍干燥機(jī)（LL3000,丹麥HetoPowerDry公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 兔BMSCs 提取 參照文獻(xiàn)［8］，從新西蘭白兔髂骨抽取骨髓，通過密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法分離、純化BMSCs。并傳代培養(yǎng)。

1.3.2 BMSCs 細(xì)胞片的制備 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BMSCs 以1×106cells/mL 接種到6 孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)，隔天換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到近100%時(shí)，更換為細(xì)胞片誘導(dǎo)液（α-MEM 完全培養(yǎng)基+50μg/mL 維生素C）。培養(yǎng)7 d 后培養(yǎng)板底部可見乳白色半透明膜片形成，用細(xì)胞刮刀將其從培養(yǎng)板底完整剝離。

1.3.3 蠶絲纖維針織網(wǎng)支架制備 參照文獻(xiàn)［9］，蠶絲通過0.5%Na2CO3溶液煮沸兩次，脫去絲膠，得到蠶絲絲素纖維細(xì)絲，即為天然蠶絲纖維。按天然蠶絲纖維、再生蠶絲纖維比例約為1∶1 的質(zhì)量比（含天然蠶絲纖維100根，再生蠶絲蛋白纖維35 根）均勻混合平行排列，逆時(shí)針扭合（2 捻）成1 小束（共含纖維單絲270 根）。再將纖維小束按圖1 緯編針織成網(wǎng)狀物（30 mm×5 mm）。然后將2 wt%再生絲素與5 mg/mL I 型膠原以1∶1 混勻滴加充填于絲網(wǎng)中，盡量使其浸透，-80℃冰箱過夜，置于凍干機(jī)凍干。環(huán)氧乙烷消毒備用。掃描電鏡（SEM）觀察。

圖1 緯編針織示意圖

1.3.4 支架-BMSCs 細(xì)胞片復(fù)合物的體外培養(yǎng) 將BMSCs 細(xì)胞片覆蓋纏繞于1.3.3 項(xiàng)已消毒的蠶絲網(wǎng)/膠原-絲素海綿支架上，以絲線稍作固定。37℃、5% CO2培養(yǎng)，1 d 后去除絲線，共培養(yǎng)2周。取1 個(gè)支架-BMSCs 細(xì)胞片復(fù)合物，按細(xì)胞SEM 觀察的操作規(guī)程處理后，行SEM 觀察。

1.3.5 支架-BMSCs 細(xì)胞片復(fù)合物的機(jī)械強(qiáng)度檢測(cè) 取1.3.4 項(xiàng)已培養(yǎng)2 周的支架-BMSCs 細(xì)胞片復(fù)合物樣本6個(gè)，參照文獻(xiàn)［9］用拉力機(jī)進(jìn)行機(jī)械強(qiáng)度測(cè)試。將試樣固定于拉力機(jī)上，拉力至1 N時(shí)測(cè)其橫截面積及夾具間距長(zhǎng)度，再以拉伸速度50 mm/min 進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，記錄最大載荷、拉伸強(qiáng)度、彈性模量等力學(xué)指標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs 培養(yǎng)及傳代

骨髓經(jīng)密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法后，獲得BMSCs。通過原代、傳代培養(yǎng)，第三代BMSCs生長(zhǎng)旺盛，呈長(zhǎng)梭形均勻分布生長(zhǎng)，增殖迅速（圖2）。

圖2 BMSCs 傳代培養(yǎng)2 d 后呈長(zhǎng)梭形均勻分布生長(zhǎng)，增殖迅速（×100）

2.2 天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合的針織網(wǎng)的SEM 觀察

天然蠶絲纖維較細(xì)，再生蠶絲纖維較粗（圖3A）。蠶絲纖維針織網(wǎng)有較大的孔隙，伸縮性和柔軟性良好，并具有足夠的內(nèi)部空間（圖3B）。于蠶絲纖維針織網(wǎng)上滴加的絲素-膠原凍干后成海綿狀（圖3C），可提供細(xì)胞停泊、黏附、增殖、遷移場(chǎng)所，以適于種子細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合的緯編針織網(wǎng)SEM 觀察

2.3 BMSCs 在支架材料上增殖、生長(zhǎng)的SEM 觀察情況

復(fù)合培養(yǎng)2周，BMSCs 細(xì)胞附于天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合的緯編針織網(wǎng)支架上生長(zhǎng)，增殖良好，形態(tài)較佳，呈立體狀生長(zhǎng)，并分泌基質(zhì)（圖4）。

圖4 BMSCs 于支架上的SEM 觀察（×1000）

2.4 針織網(wǎng)-細(xì)胞片復(fù)合物的機(jī)械強(qiáng)度測(cè)定

天然蠶絲纖維與再生蠶絲纖維混合針織網(wǎng)-BMSCs 細(xì)胞片復(fù)合物培養(yǎng)2 周后，其最大載荷、拉伸強(qiáng)度、彈性模量分別為（118.41±13.23）N、（42.78±4.63）MPa、（191.31±19.92）MPa。

3 討論

傳統(tǒng)的組織工程韌帶移植后，關(guān)節(jié)腔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量不足是導(dǎo)致預(yù)后不良的主要原因之一［10-11］。目前的細(xì)胞播種技術(shù)存在細(xì)胞附著效率低、細(xì)胞活性差、細(xì)胞利用率低等缺點(diǎn)，細(xì)胞凝膠復(fù)合材料黏附支架強(qiáng)度有限，不能將大量的細(xì)胞整合到密集的移植物中等問題［12-13］。即這種支架的一個(gè)局限性是它的低孔隙率抑制了細(xì)胞的負(fù)載和浸潤(rùn)。這些問題需要進(jìn)一步的研究來改善細(xì)胞與支架的組裝［14］。因此，人們希望找到加速移植物-骨整合的策略，這將減少生物固定的時(shí)間，提高生物固定的可靠性，允許加速康復(fù)，并潛在地減少早期移植物拔出和晚期移植物本體失效的發(fā)生率。細(xì)胞片技術(shù)可以很好地解決細(xì)胞流失的問題，且費(fèi)用較低。利用細(xì)胞片新模式，以擴(kuò)大種子細(xì)胞的負(fù)載，在一定程度上有效地解決了細(xì)胞流失的問題，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積和良好的界面整合［15］。在蠶絲針織網(wǎng)空隙中添加再生絲素-膠原進(jìn)行凍干形成海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，可提供種子細(xì)胞停泊、黏附、增殖、遷移場(chǎng)所，防止細(xì)胞從支架上漏掉，增加“韌帶化”程度，促進(jìn)細(xì)胞沉積和韌帶組織再生。同時(shí)為后來細(xì)胞生長(zhǎng)及新組織形成預(yù)留了內(nèi)部空間。

相對(duì)于膠原來說，再生絲素蛋白的降解速度相對(duì)較慢。膠原最先降解，再生絲素次之降解，天然絲素纖維最后降解，可形成一定的梯度降解作用。絲素蛋白纖維降解緩慢，可在一定時(shí)期提供機(jī)械支持。隨著膠原、再生絲素、天然絲素纖維的梯度降解，可為細(xì)胞生長(zhǎng)及新組織形成提供空間，而且絲素可降解為數(shù)種氨基酸，對(duì)修復(fù)組織也有部分營(yíng)養(yǎng)作用。

種子細(xì)胞是韌帶組織工程化的關(guān)鍵因素，理想的種子細(xì)胞需要良好的增殖能力，并能持續(xù)分泌特定的ECM，來維持并修復(fù)功能的損失。BMSCs 是組織工程常用的成體干細(xì)胞，具有獲取容易，增殖能力強(qiáng)及多向分化功能［16-17］，是較為理想的韌帶組織工程種子細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用支架覆蓋BMSCs 細(xì)胞片的模式，以擴(kuò)大種子細(xì)胞的負(fù)載。

蠶絲支架雖然目前在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用廣泛，但真正應(yīng)用于臨床還有很長(zhǎng)的路要走。未來蠶絲組織工程韌帶的發(fā)展方向，一方面可以提高和改善蠶絲性能和蠶絲支架結(jié)構(gòu)［18］，更好地與種子細(xì)胞相結(jié)合，并可與生長(zhǎng)因子或其他材料聯(lián)合應(yīng)用，以滿足臨床中ACL 修復(fù)的更高需求［19］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BMSCs 細(xì)胞片附于充填膠原-絲素海綿的天然蠶絲混合再生蠶絲針織網(wǎng)上復(fù)合培養(yǎng)2周，BMSCs 細(xì)胞附于支架上生長(zhǎng)良好，呈立體狀，增殖旺盛，并分泌基質(zhì)。針織網(wǎng)-BMSCs 細(xì)胞片復(fù)合物培養(yǎng)2 周后的最大載荷、抗拉強(qiáng)度、彈性模量分別為（118.41±13.23）N、（42.78±4.63）MPa、（191.31±19.92）MPa，機(jī)械強(qiáng)度良好，為后續(xù)進(jìn)一步研究與應(yīng)用打下基礎(chǔ)。