張 繼,吳 雪,劉若余

（1.貴州省草地技術(shù)試驗(yàn)推廣站，貴州 貴陽 550025；2.貴陽市烏當(dāng)區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 貴陽 550018；3.貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

豐富的遺傳多樣性是畜牧業(yè)生產(chǎn)的基礎(chǔ)。在動(dòng)物遺傳科學(xué)界對很多家養(yǎng)動(dòng)物的進(jìn)化歷程有雙起源和三起源等多種觀點(diǎn)[1]。貴州半細(xì)毛羊于20世紀(jì)80年代從中國陜西、甘肅、山東等地引進(jìn)考力代綿羊[2]，再由貴州粗毛羊與新疆細(xì)毛公羊的雜交二代與考力代羊進(jìn)行級進(jìn)雜交，并從子代（考細(xì)雜，羅考細(xì)雜，羅細(xì)雜）當(dāng)中選取的理想型個(gè)體進(jìn)行橫交固定，培育成貴州獨(dú)有的半細(xì)毛羊品種[3]。貴州半細(xì)毛羊體質(zhì)壯實(shí)，肉質(zhì)鮮美細(xì)膩，膻味不明顯，體軀為豐滿的圓桶狀，全身毛色為白色，是同時(shí)符合毛用市場要求和肉用市場需求的毛肉兼用性品種。

線粒體（mitochondria）是生物能量代謝的重要細(xì)胞器[4]。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA 分子，相對于核DNA 來說其分子量較?。?5.7～19.5 kb）；在單個(gè)動(dòng)物體內(nèi)具有高度的均一性，在生物體組織中無特異性[5]；線粒體DNA 的進(jìn)化速度一般是細(xì)胞核遺傳物質(zhì)變異速度的5～10 倍，因此線粒體DNA在不同的物種、種內(nèi)不同群體間變異程度大，與核DNA 相比，線粒體DNA 具有更為豐富的多態(tài)性，對于種內(nèi)和近緣種間的遺傳解析保持著很高靈敏度[6]。此外，線粒體DNA 的遺傳方式是母系遺傳，獨(dú)特的遺傳方式避免了父系個(gè)體對遺傳的影響，單個(gè)個(gè)體就能作為整個(gè)母系集團(tuán)的代表，因此對于試驗(yàn)材料的需求相對較少[7]。通過對已受到馴化的畜禽體內(nèi)線粒體DNA 的類型研究，能夠重新展示其野生先祖的DNA 類型，這得益于線粒體DNA 在世代傳遞過程中保持著相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，同時(shí)也因?yàn)槠鋰?yán)格的母系遺傳而使畜禽品種的母系集團(tuán)特征得以反映，因此線粒體DNA 成為歸類和探索動(dòng)物物種進(jìn)化歷程的重要工具[8]，也為各個(gè)地方品種的遺傳多樣性研究以及保種育種工作提供了有力支持。

通常線粒體的控制區(qū)也被稱為D-loop區(qū)，其大約占據(jù)線粒體DNA 總量的6%[9]，廣泛存在于線粒體DNA 的識(shí)入Apbe 和tRNApo 之間，腺嘌呤的含量相對比較豐富。在中國有關(guān)綿羊線粒體DNA 遺傳多樣性的探究方法較少，RFLP 方法[10]是最先采用的方法之一。目前對于線粒體DNA-RFLP 技術(shù)大多被運(yùn)用于牛、豬和雞等畜禽動(dòng)物的起源進(jìn)化和品種間親緣關(guān)系的研究中。盡管已有綿羊起源和品種分化方面的研究，但鮮見對貴州綿羊與山羊遺傳學(xué)研究的相關(guān)報(bào)道。因此，選取20只家養(yǎng)貴州半細(xì)毛羊個(gè)體，對其進(jìn)行線粒體DNA 的D-loop 區(qū)的序列測定，分析貴州半細(xì)毛羊的遺傳多樣性，為貴州綿羊的遺傳多樣性研究以及育種保種和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)羊，選自貴州省畢節(jié)市威寧縣威寧種羊場，其品種名稱及產(chǎn)地信息等見表1。

表1 試驗(yàn)綿羊品種信息

試驗(yàn)樣本：選用20 只飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同且成年健康的貴州半細(xì)毛羊，將采集的血樣放在冰盒中短暫保存，回到實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)入-40℃低溫冰箱保存。

試劑：ezup 柱式血液基因組DNA 提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]；瓊脂糖（BIOWEST）、DNA Marker（DL 2000）（康為世紀(jì)）、10×DNA loading buffer（康為世紀(jì)）、Goldenview Ⅰ型核酸染料（康為世紀(jì)）。

儀器設(shè)備：試驗(yàn)主要儀器設(shè)備信息見表2。分析軟件：MEGA 5.0、CLUSTALX、DNAStar、BIOEDIT。

表2 試驗(yàn)主要儀器設(shè)備信息

1.2 貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA 的提取及檢測

利用試劑盒提取貴州半細(xì)毛羊血樣DNA，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行DNA 濃度和純度檢測，取每個(gè)DNA樣品5 μL進(jìn)行混合，構(gòu)建DNA池。

1.3 線粒體DNA D-loop 區(qū)的引物設(shè)計(jì)及目的片段擴(kuò)增與測序

引物設(shè)計(jì)：從NCBI 數(shù)據(jù)庫中查詢綿羊mtDNA的序列（GenBank登錄號：AF010406），使用生物軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)1對D-loop區(qū)引物并送到北京諾賽生物公司進(jìn)行合成。上游引物：AGAACAACCAACCTCCCTA；下游引物：TGCTTGATACCTGCTCCTT，擴(kuò)增片段1 456 bp。

反應(yīng)體系：PCR 反應(yīng)體系（30 μL）：2×Taq PCR Master Mix 15 μL，濃 度 為10 pmol/μL 的上、下游引物各1.5 μL，DNA池模板3 μL，最后加ddH2O補(bǔ)足30 μL。

PCR 擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，61.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃終延伸5 min，4℃保存。

將擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，待結(jié)果與目的片段相一致之后送北京諾賽生物公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用DNAstar 軟件對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比對，利用SeqMan 軟件將20 條貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop 區(qū)序列與NCBI 上查找到的綿羊線粒體DNA D-loop 區(qū)序列進(jìn)行比對，用MEGA 5.0 軟件將比對結(jié)果進(jìn)行分析并構(gòu)建貴州半細(xì)毛羊遺傳發(fā)育樹。

1.5 貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊的比對

將試驗(yàn)測序出的20條貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop 區(qū)序列與試驗(yàn)組前期試驗(yàn)所得16 條貴州威寧綿羊線粒體DNA D-loop區(qū)序列和5 條NCBI 下載序列進(jìn)行比對。在Kimura 2-parameter 模型下用MEGA 5.0軟件選用鄰接法（Neighbor-jioning mehod，NJ）用MEGA 5.0 進(jìn)行遺傳發(fā)育樹構(gòu)建。分析貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊的母系遺傳結(jié)構(gòu)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增及測序結(jié)果

將擴(kuò)增出的PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。從圖1可知，電泳條帶清晰明亮、無雜帶、無彌散和拖尾，說明PCR 擴(kuò)增條件合適，引物特異性好。擴(kuò)增所得片段大小與預(yù)期目的片段大小一致，說明擴(kuò)增得到的是試驗(yàn)所需mtDNA 片段。將擴(kuò)增得到的mtDNA 片段進(jìn)行雙向測序，從圖2 可知，測序峰圖均呈單一峰，無雜峰，表明測序結(jié)果良好。

圖1 貴州半細(xì)毛羊mtDNA D-loop區(qū)的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 貴州半細(xì)毛羊mtDNA D-loop區(qū)的測序峰

2.2 貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop 區(qū)的核苷酸變異及堿基組成

經(jīng)試驗(yàn)檢測，20 只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體mtDNA D-loop 區(qū)的長度為1 106.0～1 182.0 bp，其中長度為1 181 bp個(gè)體數(shù)量為16，長度為1 180.0 bp 個(gè)體數(shù)量為1，長度為1 178.0 bp 個(gè)體數(shù)量為1，長度為1 176.0 bp個(gè)體數(shù)量為1（表3），長度為1 106.0 bp 個(gè)體數(shù)量為1，由此推測貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop 區(qū)的長度為1 181.0 bp。其中個(gè)體GZ1 在長度146 bp 處缺失4 個(gè)堿基TCCA（圖3）。個(gè)體GZ10 在長度205 bp 處缺失74 個(gè)堿基（圖4）。20 只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體的A、G、C、T 平均含量分別為33.1%、14.4%、22.9%、29.7%，其中 A+T 為62.8%，G+C 為37.3%，A+T 含量明顯高于G+C 含量。20 條序列中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)84個(gè)，其中轉(zhuǎn)換83個(gè)，顛換1個(gè)。所發(fā)現(xiàn)的84個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共確定17個(gè)單倍型。

圖3 貴州半細(xì)毛羊GZ1的mtDNA D-loop區(qū)堿基缺失

圖4 貴州半細(xì)毛羊GZ10的mtDNA D-loop區(qū)堿基缺失

表3 貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop區(qū)的核苷酸組成與長度

續(xù)表3

2.3 貴州半細(xì)毛羊群體的起源與進(jìn)化分析

在Kimura 2-parameter模型下選用鄰接法（NJ）和未加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建了20只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體和5 條NCBI 下載序列的遺傳發(fā)育樹，5 條NCBI 下載序列分別是1 條亞洲A 型序列（AL：AF039578）、1條歐洲B型序列（BL：AF039577）、1條羱羊序列（AJ238300）、1條摩弗倫羊序列（AY091487）、1條赤羊序列（AY091490）。從圖5可知，不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均將貴州半細(xì)毛羊分為2個(gè)支系，且不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果相似，25條序列構(gòu)建的遺傳發(fā)育樹明顯分為3個(gè)分支，第1支系為16只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體和亞洲A型；第2支系包括4只貴州半細(xì)毛羊綿羊個(gè)體、歐洲B型與摩弗倫羊序列；第3支系中未見貴州半細(xì)毛羊的個(gè)體。

圖5 貴州半細(xì)毛羊UPGMA（左）和NJ（右）遺傳發(fā)育樹

2.4 貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊的母系遺傳結(jié)構(gòu)差異

從圖6可看出，遺傳發(fā)育樹同樣明顯分為3 個(gè)分支，第1 支系16 只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體、12 只威寧綿羊和亞洲A 型；第2 支系包括4 只貴州半細(xì)毛羊綿羊個(gè)體、4只威寧綿羊、歐洲B型與摩弗倫羊序列；第3支系中同樣未見貴州半細(xì)毛羊的個(gè)體。說明貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊的遺傳結(jié)構(gòu)相近，均有亞洲型和歐洲型2個(gè)母系起源。

圖6 貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊的NJ遺傳發(fā)育樹

3 討論

作為生物多樣性的重要參考指標(biāo)，家畜的遺傳多樣性有著極其重要的地位[11]。家養(yǎng)綿羊是許多農(nóng)業(yè)國家的主要家畜品種，中國有著悠久的的綿羊飼養(yǎng)歷史以及相當(dāng)豐富的種質(zhì)資源。以摩佛倫羊（Ovis musimonorO.orientalis）、盤羊（O.vignei）和羱羊（O.ammon）等為代表的許多野生羊品種都曾經(jīng)被認(rèn)定為家養(yǎng)綿羊的祖先，對于部分綿羊品種的育成有著一定的貢獻(xiàn)[1]。試驗(yàn)對20只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體線粒體DNA D-loop 區(qū)的探究表明，D-loop序列長度為1 181.0 bp，與NCBI 上綿羊線粒體DNA D-loop 區(qū)序列長度一致。從貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop 區(qū)序列的堿基組成來看，A+T為62.8%，G+C為37.3%，A+T含量明顯高于G+C 含量，同樣與mtDNA D-loop 區(qū)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)一致。在20 條序列當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)84個(gè)，其中轉(zhuǎn)換83個(gè)，顛換1個(gè)。所發(fā)現(xiàn)的84 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)共確定了17 個(gè)單倍型。說明貴州半細(xì)毛羊mtDNA D-loop區(qū)序列具有轉(zhuǎn)換偏倚性。通過構(gòu)建遺傳發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，貴州半細(xì)毛羊20只個(gè)體遺傳發(fā)育樹主要分為兩支，個(gè)體GZ1、GZ4、GZ6和GZ24遺傳結(jié)構(gòu)與歐洲B 型相近，其余16 只個(gè)體遺傳結(jié)構(gòu)與亞洲A 型相近，由此推測貴州半細(xì)毛羊至少有2個(gè)母系起源，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)貴州半細(xì)毛羊的育種方式為三元雜交類型[12]，首先由新疆細(xì)毛羊作為父本與貴州當(dāng)?shù)赝幘d羊作為母本進(jìn)行雜交出子代，再由子代與新西蘭系考力代羊進(jìn)行雜交，從而培育出貴州半細(xì)毛羊品種。

因貴州半細(xì)毛羊的培育是由貴州當(dāng)?shù)赝幘d羊、新疆細(xì)毛羊和新西蘭系考力代羊?yàn)楦改副具M(jìn)行的，因此與16 只威寧綿羊個(gè)體線粒體DNA D-loop 區(qū)序列進(jìn)行對比，研究其遺傳結(jié)構(gòu)。通過對比分析發(fā)現(xiàn)，貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊的遺傳結(jié)構(gòu)相近，但又不完全相同。通過構(gòu)建遺傳發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)貴州半細(xì)毛羊與威寧綿羊都被分為兩支系（歐洲B型與亞洲A 型），這與貴州威寧綿羊的遺傳結(jié)構(gòu)相符合，說明威寧綿羊在貴州半細(xì)毛羊的培育過程中作為母本之一產(chǎn)生了影響作用。但通過對多態(tài)位點(diǎn)的對比，發(fā)現(xiàn)貴州半細(xì)毛羊的D-loop 序列多態(tài)性更強(qiáng)，威寧綿羊16 條序列發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)數(shù)為52 個(gè)，其中轉(zhuǎn)換52 個(gè)，無顛換。而貴州半細(xì)毛羊20條序列所測多態(tài)位點(diǎn)為84個(gè)，其中轉(zhuǎn)換83個(gè)，顛換1個(gè)。相比于威寧綿羊有所增加，說明貴州半細(xì)毛羊在培育過程中在其他品種羊的影響下，遺傳結(jié)構(gòu)有所改變。這或許是因?yàn)橘F州半細(xì)毛羊的育種過程中，威寧綿羊作為母本只參與了與新疆細(xì)毛羊的雜交組合出子代，而貴州半細(xì)毛羊的培育過程還有新西蘭系考力代羊，是三元雜交所培育出的品種，也就造成貴州半細(xì)毛羊的堿基序列與只占有父母本三分之一的威寧綿羊堿基序列有所不同，D-loop 區(qū)的多態(tài)性也有所增加。

在堿基組成方面，威寧綿羊D-loop 區(qū)的長度為1 181.0 bp，其堿基組成A+T 為62.7%，G+C 為37.4%，A+T 含量明顯高于G+C 含量，與試驗(yàn)所測貴州半細(xì)毛羊D-loop序列結(jié)果相符。

試驗(yàn)構(gòu)建的遺傳發(fā)育樹表明，貴州半細(xì)毛羊至少有2個(gè)母系起源，即亞洲A 型和歐洲B型，其中亞洲A型在貴州半細(xì)毛羊群體中占優(yōu)勢，因貴州半細(xì)毛羊的育種過程有貴州威寧綿羊品種的參與，故其母系起源和貴州威寧綿羊相近。

4 結(jié)論

20 只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體線粒體DNA D-loop 區(qū)的長度為 1 106.0～1 181.0 bp，由于1 181.0 bp 長度占絕大多數(shù)，故貴州半細(xì)毛羊線粒體DNA D-loop 區(qū)的長度為1 181.0 bp。除少數(shù)插入/缺失外，少數(shù)個(gè)體長度變異為串聯(lián)重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)不同造成。在20只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體線粒體DNA D-loop 序列中共發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)84 個(gè)，其中轉(zhuǎn)換83 個(gè)，顛換1 個(gè)，這些多態(tài)位點(diǎn)共確定17個(gè)單倍型。不同方法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均將貴州半細(xì)毛羊分為2個(gè)支系，根據(jù)NCBI 上查找的序列特征確定為支系A(chǔ)（亞洲A 型）和支系B（歐洲B 型），支系A(chǔ) 包括16 只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體，支系B 包括4 只貴州半細(xì)毛羊個(gè)體。說明貴州半細(xì)毛羊mtDNA D-loop 區(qū)遺傳多樣性比較豐富，貴州半細(xì)毛羊至少存在2個(gè)獨(dú)立的母系起源。