亓偉鈺，李 鑫，滿榮勇，曹建中

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2.懷化市第一人民醫(yī)院，湖南 懷化 418000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是以慢性關(guān)節(jié)滑膜炎癥、進(jìn)行性骨侵蝕為主要臨床特征的自身免疫疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，中國RA發(fā)病率為0.2%～0.4%，5年內(nèi)致殘率高達(dá)40%～50%[1]。據(jù)中華醫(yī)學(xué)會風(fēng)濕病學(xué)分會最新指南，RA常用藥物主要有甲氨喋呤、來氟米特、柳氮磺胺嘧啶等改善病情的抗風(fēng)濕藥物，阿達(dá)木單抗、依那西普、托法替布等生物制劑，激素及非甾體類藥物四類。甲氨蝶呤、來氟米特等可以部分延緩RA炎癥進(jìn)程，但臨床療效缺乏足夠的循證證據(jù)，且存在胃腸道不適、骨髓抑制、肝硬化、腎損害等諸多不良反應(yīng)[2]。而新型生物制劑不僅價格昂貴，且30%患者存在首次治療失敗，二次治療不敏感等缺點，其安全性亦缺乏足夠的循證數(shù)據(jù)[3]。

蠲痹湯出自清·程國彭《醫(yī)學(xué)心悟》，由羌活、獨活、肉桂、秦艽、當(dāng)歸、川芎、甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香組成。全方溫而不燥，通而不傷正，“通治風(fēng)、寒、濕三氣，合而成痹”。蠲痹湯也是國家中醫(yī)藥管理局頒布的《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》入選方劑。臨床研究顯示，蠲痹湯單獨使用或聯(lián)合西藥治療RA具有一定療效，但多為單中心、小樣本的臨床研究（randomized controlled trial，RCT），其RCT方案設(shè)計和研究質(zhì)量良莠不齊，尚缺乏其臨床療效及安全性的循證證據(jù)。同時，蠲痹湯治療RA的生物學(xué)機制研究較少，且僅聚焦于炎癥細(xì)胞因子。蠲痹湯原方中肉桂可通九竅，利關(guān)節(jié)。但肉桂長于補火助陽，引火歸原，而本病多以閉阻經(jīng)絡(luò)，不通則痛為主。相與肉桂比較，桂枝藥性更加溫和，更善溫通經(jīng)脈、通痹止痛，可用于治療關(guān)節(jié)痹痛。且營衛(wèi)不和為痹證發(fā)病的重要原因。故本研究使用桂枝代替原方桂心進(jìn)行研究。

基于此，本研究擬運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接研究策略，探討蠲痹湯加減治療RA的潛在機制，以期為后續(xù)開展實驗研究提供參考。

1 方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測

1.1.1 中藥活性成分及靶基因篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），分別以羌活、獨活、桂枝、秦艽、當(dāng)歸、川芎、甘草、海風(fēng)藤、桑枝、乳香、木香為關(guān)鍵詞，檢索蠲痹湯加減所有成分。以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得符合標(biāo)準(zhǔn)的藥物成分及靶基因。

1.1.2 RA相關(guān)靶基因篩選 基于GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）、OMIM（http://www.omim.org）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）和Drugbank(https://www.drugbank.ca）進(jìn)行檢索。為明確蠲痹湯加減藥物相關(guān)靶點與RA靶點間的相互作用，利用微生信在線作圖平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制交集靶點的韋恩圖。

1.1.3 建立“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 將藥物及其有效成分、靶點基因整理至Excel表格，利用Cytoscape 3.7.1軟件建立“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，明確其有效成分。

1.1.4 RA與蠲痹湯加減共同靶點篩選及PPI建立 通過Excel將交集靶基因?qū)朐诰€String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），建立疾病靶基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）模型，生物種類選擇“Homo sapiens”，設(shè)置置信度為≥0.9，隱藏游離靶點，得到PPI圖。通過Cytoscape 3.7.1中CytoNCA插件對網(wǎng)絡(luò)互作關(guān)系進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選介數(shù)中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（Eigenvector centrality，EC）、局部連通性（local average connectivity-based method，LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）均大于中位數(shù)的節(jié)點作為核心基因靶點。

1.1.5 交集靶點的GO與KEGG富集分析 通過GO數(shù)據(jù)庫及KEGG數(shù)據(jù)庫對蠲痹湯加減與RA共同靶點進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，設(shè)定閾值≤0.5，GO分析選擇生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）3個部分進(jìn)行，通路分析選擇KEGG，并繪制條形圖和氣泡圖。

1.2 分子對接

1.2.1 蛋白靶點及小分子結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備 將degree值排名靠前的核心靶標(biāo)和活性成分進(jìn)行分子對接。從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/structure）下載核心靶點蛋白晶體結(jié)構(gòu)，采用Pymol 2.1軟件刪除蛋白分子中的無關(guān)小分子；從PBD數(shù)據(jù)庫下載化合物結(jié)構(gòu)，通過Chem3D對所下載的化合物進(jìn)行優(yōu)化，并轉(zhuǎn)化為“mol 2”格式。將處理好的蛋白分子和小分子化合物導(dǎo)入AutoDock Tools1.5.6軟件進(jìn)行常規(guī)預(yù)處理，并保存為“pdbqt”文件。

1.2.2 對接過程 將處理后的化合物作為小分子配體，蛋白靶點作為受體，根據(jù)小分子與靶點相互作用確定Grid Box的中心位置及長寬高。最后通過AutoDock進(jìn)行批量分子對接，采用Pymol 2.1軟件進(jìn)行可視化。使用Lamarckian遺傳算法進(jìn)行分子對接計算，并根據(jù)結(jié)合自由能評估最終對接結(jié)構(gòu)，分析化合物與靶蛋白的相互作用模式及與活性位點殘基作用情況。

2 結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1 蠲痹湯加減活性成分及靶基因篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對蠲痹湯加減進(jìn)行檢索，篩選符合標(biāo)準(zhǔn)的有效成分共172個，其中羌活15個、獨活9個、桂枝7個、秦艽2個、當(dāng)歸2個、川芎7個、甘草92個、海風(fēng)藤21個、桑枝3個、乳香8個、木香6個，具體有效成分見表1。得到靶基因共11 213個，其中羌活1 243個、獨活650個、桂枝2 402個、秦艽157個、當(dāng)歸864個、川芎1 356個、甘草2 506個、海風(fēng)藤372個、桑枝204個、乳香659個、木香800個，獲得有效靶基因2 175個，刪除重復(fù)靶標(biāo)，最終獲得223個靶標(biāo)。

表1 蠲痹湯加減藥物組成的部分有效成分

2.1.2 RA相關(guān)靶基因的篩選 通過GeneCards、OMIM、TTD和Drugbank數(shù)據(jù)庫篩選RA相關(guān)靶標(biāo)，得到靶基因4 958個，取相關(guān)度≥1的靶基因。GeneCards數(shù)據(jù)庫共獲得2 810個基因靶點；OMIM數(shù)據(jù)庫共獲得27個基因靶點；TTD數(shù)據(jù)庫共獲得141個基因靶點；Drugbank數(shù)據(jù)庫共獲得571個基因靶點；將其合并去除重復(fù)值，最終獲得RA相關(guān)靶點2 933個。基于RA相關(guān)靶點與蠲痹湯加減作用靶點之間的相互作用，將篩選出的疾病藥物靶點輸入微生信在線平臺獲取韋恩圖，結(jié)果顯示共有交集靶點157個。（見圖1）

圖1 蠲痹湯加減與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共有靶點韋恩圖

2.1.3 中藥有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)建立 將收集到的有效成分及靶點的關(guān)系導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，建立“中藥-有效成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，得到304個節(jié)點與1 383條相互作用關(guān)系。（見圖2）其中紫色代表藥物活性成分，藍(lán)色代表靶點基因。通過分析中藥-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)獲得該網(wǎng)絡(luò)中與靶點聯(lián)系最為密切的成分為槲皮素、山奈酚、柚皮素。（見表2）

圖2 蠲痹湯加減中藥-有效分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

表2 與靶點聯(lián)系最密切的有效成分及相關(guān)信息

2.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)建立與核心靶點的篩選 將已獲得的交集基因靶點導(dǎo)入String在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，設(shè)定置信度≥0.9，隱藏游離基因靶點得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖中“邊”代表交集基因間的關(guān)聯(lián)，“邊”的粗細(xì)代表其結(jié)合度的大小，“邊”越粗，其結(jié)合度越大；節(jié)點為作用的交集基因。共得到節(jié)點數(shù)量157個，626條邊，平均節(jié)點度為7.97，平均局部聚類系數(shù)為0.493。使用Cytoscape3.7.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行拓?fù)浞治?，得到核心靶點，Degree值排在前10位的為TP53、JUN、MAPK3、FOS、STAT3、MYC、MAPK1、ESR1、MAPK14、MAPK8。（見圖3）

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（A）和PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點的篩選（B）

2.1.5 GO富集分析 通過對交集靶點的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）進(jìn)行GO富集分析，繪制條形圖，條形柱的長度表示基因的數(shù)目，柱子越長說明富集在GO上基因的數(shù)目越多，柱子的顏色代表富集的顯著性（即P值），顏色越紅則說明富集到該功能的顯著性越高。（見圖4）結(jié)果顯示，交集靶點主要涉及氧化應(yīng)激應(yīng)答（response to oxidative stress）、脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、細(xì)菌來源分子應(yīng)答（response to molecule of bacterial origin）、氧化應(yīng)激（cellular response to oxidative stress）等生物過程；主要參與膜筏（membrane raft）、膜微區(qū)（membrane microdomain）、蛋白激酶復(fù)合物（protein kinase complex）等細(xì)胞成分的組成；主要發(fā)揮DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合（RNA polymerase Ⅱ-specific DNA-binding transcription factor binding）、核受體活性配體激活（nuclear receptor activity ligand-activated）、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性（DNA-binding transcription activator activity，RNA polymerase Ⅱ-specific）等分子功能。

圖4 GO 富集分析條形圖

2.1.6 交集靶點的KEGG富集分析 通過對交集靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，繪制氣泡圖，氣泡的大小表示基因的數(shù)目，氣泡越大說明富集在該通路上基因的數(shù)目越多，氣泡的顏色代表富集的顯著性，顏色越紅則說明在該通路上富集越顯著。結(jié)果顯示，蠲痹湯加減可能通過PI3K/Akt、AGE/RAGE、TNF、IL-17、雌激素受體、Th17細(xì)胞分化等通路發(fā)揮其對RA的治療作用。（見圖5）

圖5 KEGG 富集分析氣泡圖

2.2 分子對接結(jié)果 將槲皮素（Quercetin）、柚皮素（Naringenin）及山奈酚（Kaempferol）化合物結(jié)構(gòu)與JUN、MAPK3、TP53靶點蛋白進(jìn)行分子對接。結(jié)果表明，多數(shù)化合物與蛋白的結(jié)合能＜-6 kcal/mol，存在較強的結(jié)合作用。（見表3）將對接后化合物與蛋白形成的復(fù)合物利用Pymol 2.1軟件進(jìn)行可視化，得到化合物與蛋白的結(jié)合模式，可清晰地顯示化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基?；衔锱c靶點蛋白結(jié)合較好，存在多種相互作用，與靶蛋白活性位點的匹配度較高，是潛在的活性化合物小分子。（見圖6）

表3 化合物與靶蛋白對接結(jié)果

圖6 分子對接模擬圖

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為RA屬于“痹證”范疇。機體正氣不足，又合時感風(fēng)寒濕之邪，三氣挾雜入侵機體，痹阻經(jīng)絡(luò)、關(guān)節(jié)、筋骨而發(fā)病。蠲痹湯加減以羌活、獨活為君藥，散一身上下之風(fēng)濕，通利關(guān)節(jié)而止痹痛。臣以海風(fēng)藤祛風(fēng)通絡(luò)，止痹痛；桑枝祛風(fēng)濕，利關(guān)節(jié)；秦艽祛風(fēng)濕，清濕熱，止痹痛，三藥合用，共助君藥祛風(fēng)濕止痛。佐以桂枝通經(jīng)絡(luò)、利關(guān)節(jié)以止痛；當(dāng)歸、川芎活血又補血，以防濕邪壅聚、痹阻脈道成為瘀血；乳香通經(jīng)絡(luò)、止痹痛；木香行氣通滯。使以甘草溫調(diào)和緩。全方共奏祛風(fēng)除濕、活血通絡(luò)、行氣止痛之功。

本研究共篩選出有效成分172個，從活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果中得知其關(guān)鍵活性成分主要有槲皮素、柚皮素及山奈酚等。從各味藥有效成分來看，其中獨活、羌活、當(dāng)歸、川芎、桂枝、秦艽中均含有β-谷甾醇，木香含有谷甾醇。研究發(fā)現(xiàn)，β-谷甾醇可發(fā)揮抗炎作用，β-谷甾醇及其糖苷還可以增加T-淋巴細(xì)胞增殖，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[4]。多味藥物共同發(fā)揮作用，能明顯增強其抗炎、免疫調(diào)節(jié)作用?；ぱ资荝A的主要表現(xiàn)，即滑膜受到外界刺激，出現(xiàn)大量增生，形成炎癥；FIRESTEIN G S等[5]認(rèn)為RA組織滑膜異常增生的原因可能是滑膜細(xì)胞凋亡機制障礙。有研究表明羌活醇和異歐前胡素能抑制大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖，并具有抗炎的功效[6-7]。本研究顯示，羌活、獨活均含有異歐前胡素，且羌活最主要的成分即為羌活醇和異歐前胡素。本方以羌活、獨活為君藥，既散風(fēng)寒、通利關(guān)節(jié)，又抑制滑膜增生、抗炎，可對RA起到關(guān)鍵治療作用。桑枝為臣藥，其主要成分為山奈酚、桑色素等，其中桑色素可通過抑制PI3K/AKT/NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而山奈酚可通過調(diào)控bFGF-FGFR3-RSK2信號抑制滑膜細(xì)胞TNF-α、IL-17、IL-21表達(dá)[8]。當(dāng)歸、海風(fēng)藤、木香中含有豆甾醇成分，可助君藥治療骨關(guān)節(jié)炎[9]。此外，木香中的菜薊苦素可抑制炎癥介質(zhì)和淋巴細(xì)胞增殖，可能是木香抑制TNF-α的主要成分[10]。乳香中含有乳香酸成分，在體外實驗中被證明有抗炎作用[11]。桂枝的有效成分花旗松素、表兒茶素均具有良好的抗炎作用，可作為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的新藥進(jìn)行研究[12-13]。使藥甘草中含有槲皮素、柚皮素等成分。有研究證實，槲皮素可通過抑制Th17/Treg平衡，抑制IL-17A、IL-21、TNF-α等細(xì)胞因子的表達(dá)而減輕關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)[14]；柚皮素可通過抑制TNF-α、IL-6等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，抑制脾臟Th1和Th17細(xì)胞分化及NF-κB、MAPK等通路而改善關(guān)節(jié)炎小鼠或大鼠炎癥浸潤[15]。

GO及KEGG分析顯示，蠲痹湯加減治療RA可能與調(diào)控PI3K/AKT、AGE/RAGE、TNF、IL-17、雌激素受體、Th17細(xì)胞分化等通路有關(guān)。研究顯示，PI3K/AKT對RA慢性滑膜增生、血管翳形成及骨破壞3個病理環(huán)節(jié)均有促進(jìn)作用[16]。AGE/RAGE信號通路可通過活化HMGB1進(jìn)而活化NF-κB，介導(dǎo)RA炎癥細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致RA發(fā)生發(fā)展[17]。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17、IL-21等炎癥細(xì)胞因子，具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞進(jìn)程等多重效應(yīng)[18]。

分子對接結(jié)果顯示，槲皮素、柚皮素及山奈酚與JUN、MAPK3、TP53等RA核心靶點蛋白具有較好的結(jié)合能力。TP53是RA的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，TP53缺失可使滑膜細(xì)胞過度增殖，Treg分化受損，從而導(dǎo)致RA的發(fā)生發(fā)展[19]。JUN、MAPK3激酶是MAPK家族成員。MAPK通路是介導(dǎo)RA關(guān)節(jié)局部炎癥和骨質(zhì)破壞的重要信號通路之一，對機體炎癥反應(yīng)有抑制作用[20]。這些相互作用可以提高化合物的穩(wěn)定性，可能是治療RA的潛在靶標(biāo)。

綜上，蠲痹湯加減可能通過方中藥物的多種活性小分子，作用于免疫調(diào)節(jié)、抗炎等多個環(huán)節(jié)而發(fā)揮其整合效應(yīng)治療RA。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多為預(yù)測性結(jié)果，旨在給予研究者相關(guān)的分子研究方向。后期研究應(yīng)注重對預(yù)測關(guān)鍵靶標(biāo)及通路進(jìn)行相關(guān)藥理學(xué)研究以確證。