邵賢麗, 王倩云, 劉國文, 趙華鋒, 方 育

(1.濰坊醫(yī)學院，山東 濰坊 261041 2.山東省濰坊市人民醫(yī)院兒科，山東 濰坊 261041 3.昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科, 云南 昆明 650032)

膿毒癥是臨床常見的危重癥，是兒童重癥監(jiān)護室(ICU)面臨的棘手難題，病因是由于顱內(nèi)、肺部等器官組織感染而導致宿主反應(yīng)失調(diào)，并引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，可導致一個或多個器官功能障礙，易進展為膿毒性體克，是ICU患兒死亡的主要原因[1,2]。且從長期隨訪調(diào)查顯示，在其后的歲月中部分存活患兒的認知及身體都可能受到不同程度的影響。因此，救治膿毒癥患兒一直都是ICU醫(yī)務(wù)工作者的巨大挑戰(zhàn)，備受重視。進入二十一世紀后，雖然醫(yī)療科技飛速發(fā)展，但小兒膿毒癥的發(fā)病率和死亡率仍居高不下，特別是嚴重膿毒癥患兒的救治十分困難。因此小兒膿毒癥的早期診斷，及時評估病情嚴重程度及預(yù)后，對指導治療、提高存活率至關(guān)重要。但目前臨床常用的降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、乳酸(Lac)等生物標記物及小兒危重病例評分法(PCIS)等評分系統(tǒng)仍難以滿足膿毒癥患兒早期診斷、危險分層及預(yù)后評估的需求，仍需不斷探索新的有價值的生物標記物以提高診斷和評估的準確性。血漿游離DNA是細胞壞死、凋亡釋放的游離DNA片段，其中可檢測到的主要有線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mt-DNA)、核DNA (Nuclear DNA,n-DNA)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展與線粒體損傷密切相關(guān)[4]，而mt-DNA 較之n-DNA因結(jié)構(gòu)簡單、長度短、拷貝數(shù)高受到的關(guān)注度更高。目前已有研究顯示，在成人膿毒癥患者中mt-DNA異常升高，且在膿毒癥的危險分層及預(yù)后評估中敏感度和特異度性和靈敏性優(yōu)于PCT,CRP等生物標記物，對成人膿毒癥死亡有較高的預(yù)測價值[5]。但國內(nèi)將其用于膿毒癥患兒危險分層及預(yù)后評估的研究較少。為此，本研究對mt-DNA水平與膿毒癥患兒病情嚴重程度及預(yù)后的相關(guān)性進行分析，旨在尋找更多的膿毒癥患兒危險分層及預(yù)測預(yù)后的生物標志物，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:我院2021年1月至2022年3月兒童重癥監(jiān)護室(ICU)膿毒癥患兒103例作為研究對象，根據(jù)嚴重程度分為普通膿毒癥組57例，嚴重膿毒癥組46例；同期性別、年齡匹配的ICU感染患兒50例設(shè)為感染組，同期性別、年齡匹配的健康兒童作為對照組，各組兒童平均年齡、性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組平均體溫、器官功能障礙數(shù)、感染部位構(gòu)成差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組間比較，感染組、膿毒癥組、重度膿毒癥組患兒平均體溫、感染部位構(gòu)成差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。感染組、膿毒癥組、重度膿毒癥組患兒器官功能障礙數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組患者基線資料比較

1.2納入及排除標準:經(jīng)院醫(yī)學倫理委員會批準。納入標準：①具有完整的病歷及輔助診斷資料；②年齡<14周歲；③符合國際兒科膿毒癥會議2012年膿毒癥診斷標準[6]，患兒家長知情同意研究方法，簽署知情同意書。排除標準：①合并血液系統(tǒng)疾病、肝腎疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病等患兒；②先天性代謝性疾病、先天性心臟病患兒。

1.3方 法

1.3.1研究方法：根據(jù)膿毒癥嚴重程度分為普通膿毒癥組57例，嚴重膿毒癥組46例，同期性別、年齡匹配的ICU感染患兒50例設(shè)為感染組，比較各組mt-DNA、降鈣素原(PCT)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、乳酸(Lac)水平；采用Spearman雙變量分析mt-DNA與PCT、CRP、Lac水平及嚴重程度、器官功能障礙、死亡風險的相關(guān)性。根據(jù)患兒入院后28d轉(zhuǎn)歸情況，分為存活組和死亡組，比較兩組血漿mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平，建立ROC曲線，分析血漿mt-DNA、PCT、CRP、Lac對膿毒癥患兒預(yù)后的預(yù)測價值。

1.3.2檢測方法：膿毒癥與重度感染患兒均于入ICU 24h采集外周血，于室溫下靜置30min離心取上層血漿。采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測mt-DNA，為了保證檢測結(jié)果的一致性，所有樣品均使用同一批次的微量柱離心式 QIAamp DNA blood Mini抽提試劑盒。采用膠體金法檢測PCT、CRP、Lac水平，試劑盒購自上海奧普生物醫(yī)藥有限公司。

1.3.3相關(guān)量表測評：采用小兒危重病例評分法(PCIS)評價病情嚴重程度，評分越低，病情越危重；采用第2代小兒器官功能障礙評分(PELOD-2)評價器官功能障礙，評分越高，病情越危重；采用第三代小兒死亡風險評分(PRISMⅢ)評價死亡風險，評分越高，死亡的風險越高。

2 結(jié) 果

2.1各組mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平比較:各組mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組間mt-DNA水平兩兩比較：重度膿毒癥組高于膿毒癥組、感染組、對照組；膿毒癥組高于感染組、對照組；感染組高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。組間PCT、CRP、Lac水平兩兩比較：重度膿毒癥組高于膿毒癥組、感染組、對照組；膿毒癥組、感染組高于對照組，膿毒癥組Lac水平高于感染組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。膿毒癥組與感染組PCT、CRP水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組mt-DNA PCT CRP Lac水平比較

2.2不同嚴重程度膿毒癥患兒PCIS、PELOD-2、PRISMIII評分:重度膿毒癥組患兒PCIS評分低于膿毒癥組，PELOD-2、PRISMIII評分高于膿毒癥組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

圖1 血漿mt-DNA與PCT的相關(guān)性

2.3相關(guān)性分析:血漿mt-DNA與 PCT、CRP、Lac及PELOD-2、PRISMⅢ評分呈正相關(guān)(r=0.877、0.904、0.875、0.923、0.870，P均=0.000)。血漿mt-DNA與PCIS評分呈負相關(guān)(r=-0.841，P=0.000)。詳見表4、圖1～6。

表3 兩組膿毒癥患兒PCIS PELOD-2 PRISMIII

表4 血漿mt-DNA與 PCT CRP Lac及PCIS PELOD-2

2.4不同預(yù)后膿毒癥患兒mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平比較:死亡組患兒血漿mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平均高于存活組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 膿毒癥生存組和死亡組患兒mt-DNA PCT CRP Lac水平比較

圖2 血漿mt-DNA與CRP的相關(guān)性

圖3 血漿mt-DNA與Lac的相關(guān)性

圖4 血漿mt-DNA與PCIS評分的相關(guān)性

圖5 血漿mt-DNA與PELOD-2評分的相關(guān)性

圖6 血漿mt-DNA與PRISMⅢ評分的相關(guān)性

2.5預(yù)測價值:建立ROC曲線，血漿mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平的Cut-off為1124.28pg/mL、18.49ng/mL、27.38mg/L、3.04mmoL/L時，Youden最高，AUC分別為0.817、0.716、0.607、0.759。血漿mt-DNA預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感度為80.95%，明顯高于PCT、CRP、Lac的71.43%、66.67%、76.19%；血漿mt-DNA預(yù)測膿毒癥預(yù)后的特異度為93.90%，明顯高于PCT、CRP、Lac的81.71%、75.61%、74.39%，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表6、圖7。

表6 血漿mt-DNA PCT CRP Lac對膿毒癥預(yù)后的預(yù)測價值

圖7 血漿mt-DNA、PCT、CRP、Lac預(yù)測膿毒癥患兒預(yù)后ROC曲線

3 討 論

目前國內(nèi)外文獻報道的與膿毒癥診斷、危險分層、監(jiān)控等相關(guān)的生物標記物多達上百種，而PCT、CRP、Lac等是臨床最常用的生物標志物[7]。但上述指標仍有一定的局限性。PCIS等評分系統(tǒng)在膿毒癥患兒的危險分層及預(yù)后判斷中有著一定的價值，但這些量表項目繁多，操作復雜，而且有一定的主觀性，限制了在臨床的應(yīng)用。所以目前仍缺乏有價值的生物標志物以提高預(yù)測膿毒癥患兒病情嚴重程度及預(yù)后準確性的生物標記物。研究發(fā)現(xiàn)[8]，在膿毒癥狀態(tài)下，大量細胞遭到破壞及凋亡，細胞中的線粒體受到損害后，大量線粒體DNA釋放到細胞質(zhì)中，致先天免疫反應(yīng)及不同識別的模式受體被激活，引起強烈的氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)，致細胞能量產(chǎn)生不足，繼而出現(xiàn)代謝紊亂，免疫和器官細胞凋亡，最終導致一個或多個器官功能衰竭甚至死亡。有研究結(jié)果[9]顯示，重度膿毒癥患者血漿mt-DNA水平高于全身炎癥反應(yīng)綜合癥，差異有統(tǒng)計學意義。本研究結(jié)果顯示，重度膿毒癥組和膿毒癥組血漿mt-DNA水平高于感染組和對照組；重度膿毒癥組血漿mt-DNA水平高于膿毒癥，差異均有統(tǒng)計學意義。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，血漿mt-DNA與PCT、CRP、Lac及PELOD-2、PRISMⅢ評分呈正相關(guān)，與PCIS評分呈負相關(guān)。提示感染及膿毒癥患兒血漿mt-DNA水平均會異常升高，且血漿mt-DNA水平與病情嚴重程度、臟器損傷程度、預(yù)后均呈線性相關(guān)。與Satoshi研究結(jié)果基本一致，提示血漿mt-DNA可作為膿毒癥患兒病情嚴重程度評估有價值的客觀指標。膿毒癥易合并多器官功能障礙，隨著病情的進展，發(fā)生膿毒癥體克直至死亡[10]。血漿mt-DNA可在一定程度上反應(yīng)病情嚴重程度及器官功能障礙，由此推測其可能在膿毒癥預(yù)后的評估中有較高的臨床價值。在成人膿毒癥的研究中[11]，血漿mt-DNA預(yù)測成人膿毒癥患者死亡中敏感度優(yōu)于CRP、PCT、Lac。本研究結(jié)果顯示，雖然死亡組患兒血漿mt-DNA、PCT、CRP、Lac水平均高于存活組，但血漿mt-DNA預(yù)測膿毒癥預(yù)后的敏感度和特異度明顯高于PCT、CRP、Lac，差異有統(tǒng)計學意義，說明血漿mt-DNA對膿毒癥患兒預(yù)后的預(yù)測價值較高。mt-DNA存在于所有的器官組織細胞中，一旦出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)或器官組織損傷，受損的器官組織中必然會釋放mt-DNA，且mt-DNA釋放量與全身炎癥反應(yīng)或器官組織損傷程度成線性相關(guān)，檢測mt-DNA水平不僅可反應(yīng)膿毒癥患兒全身炎癥反應(yīng)，還可反應(yīng)器官的累積損傷程度。另外當膿毒癥發(fā)生后，一方面隨著病情的加重，凋亡的細胞逐漸增多，線粒體受損，細胞中mt-DNA釋放入血增加。另一方面清除mt-DNA的器官可能出現(xiàn)功能障礙，致mt-DNA不能及時被清除，導致血漿mt-DNA水平升高。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，血漿mt-DNA可作為膿毒癥患兒病情嚴重程度及預(yù)后判斷的潛力的生物標志物，且與PCT、CRP、Lac相關(guān)，且在預(yù)后的預(yù)測價值高于PCT、CRP、Lac。本研究的不足在于為單中心研究，結(jié)果可能存在偏倚。