顏康婷，韓沂芳，王林琳，丁 凡，蘭玉彬*，張亞莉2, *

1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)電子工程學(xué)院、 人工智能學(xué)院，廣東 廣州 510642 2. 國(guó)家精準(zhǔn)農(nóng)業(yè)航空施藥技術(shù)國(guó)際聯(lián)合研究中心，廣東 廣州 510642 3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510642

引 言

阿維菌素屬十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物，是一種具有殺蟲(chóng)、 殺螨、 殺線蟲(chóng)活性的廣譜性殺蟲(chóng)劑。常用于防治果樹(shù)紅蜘蛛、 薊馬，蔬菜菜青蟲(chóng)、 小菜蛾等蟲(chóng)害，能達(dá)到較高的防治效果。但阿維菌素的過(guò)度使用會(huì)造成農(nóng)作物的農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，影響消費(fèi)者身體健康及生態(tài)環(huán)境[1]。因而，實(shí)現(xiàn)對(duì)阿維菌素農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)對(duì)于保證農(nóng)產(chǎn)品的食品安全和發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)具有重要的研究意義。目前，常用于阿維菌素農(nóng)藥含量檢測(cè)的方法為高效液相色譜法(HPLC)、 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)等[2]。這些檢測(cè)方法的靈敏度、 準(zhǔn)確度高，但前期處理復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留的在線實(shí)時(shí)檢測(cè)。而熒光光譜分析具有選擇性好、 靈敏度高、 檢出限低的特點(diǎn)，且其不需復(fù)雜的前期處理，操作簡(jiǎn)單，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)作物農(nóng)藥殘留的在線快速檢測(cè)[3-7]。

本研究對(duì)阿維菌素原藥溶液及兩種來(lái)自不同生產(chǎn)廠家的阿維菌素制劑溶液進(jìn)行熒光分析，通過(guò)三維熒光光譜及相關(guān)Excitation Emission Matrix(EEM)數(shù)據(jù)，分析原藥及制劑溶液熒光特征峰區(qū)域。通過(guò)獲得的最佳激發(fā)波長(zhǎng)，掃描二維熒光光譜數(shù)據(jù)，獲得熒光強(qiáng)度值隨溶液濃度變化的規(guī)律，建立預(yù)測(cè)模型，從而檢驗(yàn)熒光分析對(duì)阿維菌素含量進(jìn)行快速檢測(cè)的可行性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

熒光掃描儀器：FP8300熒光分光光度計(jì)(日本JASCO)；純水制備系統(tǒng)：Milli-Q Direct純水/超純水一體化系統(tǒng)(皇河儀器科技有限公司)。

1.2 樣品及溶液配制

阿維菌素原藥(湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)采用一種即溶于水的有機(jī)化合物DMSO作為溶劑進(jìn)行溶解得到母液，再取不同量的母液加純水稀釋獲得24個(gè)濃度梯度的阿維菌素原藥溶液。實(shí)驗(yàn)中使用兩種來(lái)自不同生產(chǎn)廠家(制劑1：河南勇冠喬迪農(nóng)業(yè)科技有限公司、 制劑2：河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司)的阿維菌素制劑，劑型為乳油，有效成分含量均為1.8%。阿維菌素制劑通過(guò)不同比例的制劑：純水配比獲得23個(gè)不同濃度的阿維菌素制劑溶液。阿維菌素原藥溶液及制劑溶液相關(guān)濃度配制如表1所示。

表1 阿維菌素原藥及制劑溶液配制濃度梯度Table 1 Concentration gradient of abamectin technicaland preparation solution preparation

1.3 方法

實(shí)驗(yàn)中激發(fā)波長(zhǎng)(Ex)掃描間隔為5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)(Em)掃描間隔為10 nm，每個(gè)樣品重復(fù)掃描三遍取平均值；進(jìn)行熒光檢測(cè)的具體步驟為：超聲波充分震蕩溶液，使用移液槍分別從不同階梯濃度的阿維菌素溶液中吸取3 mL的溶液至10 mm×10 mm×42 mm的石英器皿中；再將石英器皿置于熒光分光光度計(jì)中指定的位置；操作JASCO Spectra Manager軟件進(jìn)行熒光光譜掃描獲取EEM數(shù)據(jù)及二維熒光光譜數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 阿維菌素原藥溶液熒光光譜分析

三維熒光光譜具有獨(dú)特的指紋性[8-11]，為分析阿維菌素原藥的熒光效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)對(duì)6個(gè)階梯濃度阿維菌素原藥溶液(10，15，20，25，30和35 mg·L-1)進(jìn)行三維熒光光譜掃描。其中，20 mg·L-1的阿維菌素原藥溶液的三維熒光光譜圖如圖1所示。

從三維熒光光譜圖及EEM數(shù)據(jù)分析可知，6個(gè)濃度梯阿維菌素原藥溶液在Ex：250～300 nm，Em：280～320 nm處出現(xiàn)熒光特征峰區(qū)域，其中熒光峰1的激發(fā)波長(zhǎng)均為Ex=270 nm。因此，選定Ex=270 nm作為阿維菌素原藥溶液的最佳激發(fā)波長(zhǎng)，對(duì)6個(gè)阿維菌素原藥溶液進(jìn)行二維熒光光譜掃描，相關(guān)數(shù)據(jù)如表2所示。分析可知，6個(gè)濃度梯度的阿維菌素原藥溶液在Ex=270 nm，Em=297.5～298 nm處獲得熒光峰特征峰值，熒光強(qiáng)度值隨著阿維菌素原藥溶液濃度的增加而增強(qiáng)。此結(jié)果與Ji等[12]在基于熒光光譜的水果汁阿維菌素殘留檢測(cè)的研究結(jié)果相近。

圖1 20 mg·L-1阿維菌素原藥溶液三維熒光光譜圖 1：Ex/Em=270 /297 nm；Int.=111.772Fig.1 Three-dimensional fluorescence spectrum of20 mg·L-1 abamectin technical solution 1：Ex/Em=270 /297 nm；Int.=111.772

其中，實(shí)驗(yàn)采用DMSO作為溶劑對(duì)阿維菌素原藥母液進(jìn)行配制，為討論DMSO的熒光效應(yīng)，對(duì)純水及純水+DMSO溶液進(jìn)行三維熒光光譜掃描。分析可得，純水熒光強(qiáng)度值為55.9，純水+DMSO的熒光強(qiáng)度值為54.5。兩種溶液的熒光強(qiáng)度值均小于阿維菌素原藥溶液熒光強(qiáng)度值，因而不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)分析造成影響。

表2 阿維菌素原藥溶液二維熒光光譜相關(guān)數(shù)據(jù)Table 2 Two-dimensional fluorescence spectroscopydata of abamectin technical solution

為進(jìn)一步討論阿維菌素?zé)晒夥逄師晒鈴?qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系，以Ex=270 nm為最佳激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)阿維菌素原藥溶液校正集進(jìn)行二維熒光光譜掃描，獲得發(fā)射波長(zhǎng)范圍為285～600 nm的發(fā)射光譜圖。利用Origin 2019b對(duì)阿維菌素原藥溶液的濃度、 熒光強(qiáng)度相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸擬合，結(jié)果顯示其皮爾遜相關(guān)系數(shù)r=0.995，R2=0.990，擬合結(jié)果如圖2所示。由擬合結(jié)果可知，利用Ex=270 nm作為最佳激發(fā)波長(zhǎng)進(jìn)行二維熒光光譜掃描，r=0.995，說(shuō)明阿維菌素原藥溶液濃度可以解釋利用最佳激發(fā)波段掃描得到的熒光特征峰值處熒光強(qiáng)度99.5%的變異性，兩者存在線性關(guān)系。

利用驗(yàn)證集對(duì)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)精度進(jìn)行檢驗(yàn)，采用origin 2019b對(duì)阿維菌素原藥溶液驗(yàn)證集中的預(yù)測(cè)值及實(shí)測(cè)值進(jìn)行線性擬合分析，結(jié)果如圖3所示。擬合結(jié)果R2=0.999，RMSE=0.359 mg·L-1。接近1的R2及較小的RMSE說(shuō)明擬合效果良好，表明該預(yù)測(cè)模型對(duì)于濃度范圍10～35 mg·L-1內(nèi)的阿維菌素原藥溶液具有良好的預(yù)測(cè)精度，能夠通過(guò)熒光峰值處的熒光強(qiáng)度來(lái)反映對(duì)應(yīng)的溶液濃度值。

圖2 阿維菌素原藥溶液線性擬合曲線Fig.2 Fitting curve of abamectin technical solution

圖3 阿維菌素原藥驗(yàn)證集中預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值線性擬合

2.2 阿維菌素制劑溶液熒光光譜分析

2.2.1 阿維菌素制劑溶液熒光峰分布規(guī)律

實(shí)驗(yàn)分別對(duì)兩種阿維菌素制劑的三個(gè)階梯濃度的溶液進(jìn)行三維熒光光譜掃描(1∶2 100，1∶1 000，1∶650)，其中制劑：純水配比為1∶1 000的三維熒光光譜掃描結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，阿維菌素制劑溶液三維熒光光譜圖出現(xiàn)兩個(gè)較明顯的熒光特征峰區(qū)域(1：Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm；另一個(gè)區(qū)域在Ex=250～400 nm，Em=380～470 nm)。對(duì)比可知，熒光峰1與阿維菌素原藥溶液三維熒光光譜中所出現(xiàn)的熒光峰1相似，判斷為阿維菌素有效成分的熒光效應(yīng)。而在另一個(gè)熒光特征峰區(qū)域在阿維菌素原藥溶液的三維熒光光譜中并未出現(xiàn)，認(rèn)為是阿維菌素制劑中的其他成分，填充劑或助劑所產(chǎn)生。比較阿維菌素原藥、 制劑溶液的三維熒光光譜可知，制劑中的阿維菌素有效成分依然保持其熒光特性，并產(chǎn)生了跟阿維菌素原藥溶液相似的熒光峰1，對(duì)應(yīng)Ex均為270 nm。

圖4 1∶1 000阿維菌素制劑溶液三維熒光光譜圖 (a)：制劑1；(b)：制劑2Fig.4 1∶1 000 abamectin pharmaceutical solutionthree-dimensional fluorescence spectrum (a)：Formulation 1; 1：Ex/Em=270/291.5 nm，Int.=2 901.22 (b)：Formulation 2；1：Ex/Em=270/291 nm，Int.=2 774.06

2.2.2 阿維菌素制劑溶液熒光強(qiáng)度變化規(guī)律

以Ex=270 nm作為最佳激發(fā)波長(zhǎng)分別掃描5個(gè)濃度阿維菌素制劑溶液(10.02，15.45，20.88，24.64和32.16 mg·L-1)得到二維熒光光譜，相關(guān)數(shù)據(jù)如表3所示。分析可知，隨著阿維菌素制劑溶液濃度的增大，熒光峰1熒光強(qiáng)度值呈負(fù)增長(zhǎng)狀態(tài)，與阿維菌素原藥中溶液濃度與熒光強(qiáng)度值的正相關(guān)關(guān)系不同。查閱相關(guān)資料可知，在進(jìn)行溶液的熒光檢測(cè)時(shí)會(huì)存在濃度效應(yīng)[13]，其會(huì)造成內(nèi)濾效應(yīng)、 溶質(zhì)間相互作用等現(xiàn)象從而影響溶液熒光強(qiáng)度。經(jīng)分析，認(rèn)為阿維菌素制劑溶液中出現(xiàn)的負(fù)增長(zhǎng)趨勢(shì)是由于溶液內(nèi)濾效應(yīng)引起。即當(dāng)溶液濃度過(guò)高時(shí)，溶液中的雜質(zhì)對(duì)入射光的吸收作用增強(qiáng)，降低激發(fā)光的強(qiáng)度。阿維菌素制劑溶液中除了阿維菌素有效成分外，其余雜質(zhì)成分較多，因而阿維菌素有效成分濃度相當(dāng)?shù)脑幦芤号c制劑溶液相比，制劑溶液的內(nèi)濾效應(yīng)會(huì)更加明顯。

為進(jìn)一步討論阿維菌素制劑溶液濃度與相應(yīng)熒光強(qiáng)度值之間的關(guān)系，以Ex=270 nm為最佳激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)阿維菌素制劑溶液校正集進(jìn)行二維熒光光譜掃描，利用origin 2019b分別對(duì)兩個(gè)校正集中15個(gè)樣品的濃度及對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行擬合分析。

表3 阿維菌素原藥溶液二維熒光光譜相關(guān)數(shù)據(jù)

查閱資料，溶液熒光強(qiáng)度的理論計(jì)算公式為：If=2.303YfI0εbc。其中If為熒光強(qiáng)度，Yf為物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率，I0為入射光強(qiáng)度，ε為摩爾吸光系數(shù)。在一定的頻率及強(qiáng)度的激發(fā)光照射下，溶液熒光強(qiáng)度和溶液的濃度呈線性關(guān)系；如果εbc≥0.05時(shí)，則熒光強(qiáng)度和溶液的濃度不呈線性關(guān)系，應(yīng)考慮冪級(jí)數(shù)中的二次方甚至三次方[13]。

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合：制劑1進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合分析，制劑2進(jìn)行線性擬合分析，均符合關(guān)于溶液熒光強(qiáng)度的理論計(jì)算分析，擬合結(jié)果如圖5所示。制劑1、 2的擬合結(jié)果R2分別為0.969和0.963，表明模型的擬合結(jié)果較好，制劑溶液濃度與對(duì)應(yīng)熒光強(qiáng)度具有良好的相關(guān)性。

圖5 阿維菌素制劑溶液擬合曲線 (a)：制劑1；(b)：制劑2Fig.5 Fitting curve of abamectin preparation solution (a)：Formulation 1; (b)：Formulation 2

利用驗(yàn)證集中8個(gè)濃度梯度阿維菌素制劑溶液分別對(duì)兩種制劑的預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)精度進(jìn)行檢驗(yàn)，其分析結(jié)果如圖6所示。制劑1、 2驗(yàn)證集中預(yù)測(cè)模型的濃度預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值線性擬合結(jié)果分別為，R2=0.935，R2=0.985，RMSE=1.945 mg·L-1，RMSE=0.858 mg·L-1。接近1的R2和較小的RMSE表明，通過(guò)最佳激發(fā)波長(zhǎng)Ex=270nm進(jìn)行二維熒光光譜掃描獲取相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)測(cè)模型建立，利用預(yù)測(cè)模型對(duì)阿維菌素制劑溶液進(jìn)行溶液濃度值預(yù)測(cè)具有較好的預(yù)測(cè)精度。

圖6 阿維菌素制劑驗(yàn)證集中預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值線性擬合曲線 (a)：制劑1；(b)：制劑2

綜合以上分析，發(fā)現(xiàn)阿維菌素原藥溶液及阿維菌素制劑溶液的三維熒光光譜圖在Ex約為250～290 nm，Em約為280～320 nm區(qū)域內(nèi)均出現(xiàn)了熒光特征峰區(qū)域。在組分更為復(fù)雜的阿維菌素制劑溶液中阿維菌素有效成分仍然能表現(xiàn)出熒光效應(yīng)，但其會(huì)受到內(nèi)濾效應(yīng)的影響而呈現(xiàn)區(qū)別于阿維菌素原藥溶液的變化規(guī)律；阿維菌素原藥及兩種制劑溶液驗(yàn)證集中預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值線性擬合的R2分別為0.999，0.935和0.985，RMSE分別為0.359，1.945和0.858 mg·L-1，具有較好的預(yù)測(cè)精度。

3 結(jié) 論

(1)阿維菌素原藥溶液的三維熒光光譜圖出現(xiàn)明顯熒光峰1，其熒光峰區(qū)域范圍約為Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm。熒光峰1的峰值均在Ex=270 nm取得。確定Ex=270 nm為阿維菌素的最佳激發(fā)波長(zhǎng)，此熒光峰區(qū)域?yàn)榘⒕S菌素的熒光特征峰區(qū)域。

(2)阿維菌素制劑溶液的三維熒光光譜圖出現(xiàn)兩個(gè)明顯的熒光峰區(qū)域(1：Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm；另一區(qū)域：Ex=250～400 nm，Em=380～470 nm)。熒光峰1與阿維菌素原藥溶液產(chǎn)生的熒光特征峰相近，判斷為制劑中阿維菌素有效成分產(chǎn)生的熒光效應(yīng)。另一熒光特征峰區(qū)域判斷為制劑溶液中其他填充劑及輔助劑所產(chǎn)生的熒光效應(yīng)。

(3)由阿維菌素原藥溶液及兩種不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)的阿維菌素制劑溶液所出現(xiàn)的相同熒光特征峰區(qū)域Ex=250～290 nm，Em=280～320 nm，可以判斷阿維菌素有效成分的熒光效應(yīng)在組分更為復(fù)雜的制劑溶液中能夠不被其他成分所掩蓋。以此熒光峰區(qū)域內(nèi)的最大熒光強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)溶液濃度建立關(guān)系，能夠得到相應(yīng)的預(yù)測(cè)模型。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了利用熒光光譜檢測(cè)阿維菌素含量的可行性，為實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中阿維菌素農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)提供數(shù)據(jù)參考。