劉貴珍，楊瑞紅，李寶連

(1.山西省呂梁市人民醫(yī)院婦科，山西 呂梁 033000 2.山西省腫瘤醫(yī)院分子生物室，山西 太原 030000)

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。我國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)病例達(dá)13萬(wàn)例，死亡達(dá)5.3萬(wàn)例，嚴(yán)重威脅我國(guó)女性身體健康[1]。近年來隨著宮頸脫落細(xì)胞學(xué)、HPV及陰道鏡等篩查的普及，使得許多早期宮頸癌患者得到早期診治。對(duì)于早期宮頸癌患者主要采用宮頸癌根治術(shù)治療，但部分患者術(shù)后仍會(huì)發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)的現(xiàn)象，對(duì)于術(shù)后復(fù)發(fā)的患者再次治療的療效較差，5年生存率僅13%[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)DLX6-AS1編碼基因位于人類7號(hào)染色體。據(jù)報(bào)道，lncRNA DLX6-AS1在膀胱癌、乳腺癌等腫瘤中發(fā)揮致癌作用，其通過激活RAS/RAF信號(hào)通路，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成及轉(zhuǎn)移[3]。輔肌動(dòng)蛋白4(Actinin-4)是ACTN家族成員，其與絲狀肌動(dòng)蛋白交聯(lián)，以維持細(xì)胞骨架的完整性并控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。研究表明，Actinin-4在乳腺癌、前列腺癌多種癌癥中表達(dá)顯著升高，其表達(dá)上調(diào)能夠降低細(xì)胞之間粘附性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲、轉(zhuǎn)移[4,5]。本研究通過研究宮頸癌患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)，分析兩者表達(dá)與臨床病理特征及術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1臨床資料:選取自2016年2月至2018年2月期間行宮頸癌根治術(shù)的120例宮頸癌患者為研究對(duì)象(宮頸癌組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次診治，既往無抗腫瘤治療；②接受宮頸癌根治術(shù)治療的ⅠA～ⅡA期宮頸癌者；③病理檢查確診為宮頸癌；④臨床病理資料及隨訪完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他惡性腫瘤者；②患者不能配合相關(guān)檢查及治療；③合并嚴(yán)重心肺肝腎臟器功能衰竭者，④中途失訪丟失者。年齡25～67歲，平均(44.35±5.18)歲；腫瘤直徑：≤4cm者73例，>4cm者47例；病理類型：鱗癌85例，腺癌35例；病理分級(jí)：高中分化82例，低分化38例；FIGO分期：IA～I(xiàn)B期78例，ⅡA期42例；間質(zhì)浸潤(rùn)深度：≤1/2者45例，>1/2者75例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無97例，有23例。以同期健康體檢的50例健康人為對(duì)照組，年齡24～64歲，平均(43.98±5.20)歲。兩組年齡之間無明顯差異(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者及其家屬已簽署知情同意書。

1.2方 法

1.2.1血清lncRNA DLX6-AS1表達(dá)檢測(cè) 取宮頸癌患者及對(duì)照組查體時(shí)清晨空腹靜脈血5mL，3000rpm/min離心10min(離心半徑10cm)，保留上層血清。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清lncRNA DLX6-AS1表達(dá)水平。儀器為ABI7500型熒光定量PCR儀(ABI公司，美國(guó))。采用Trizol試劑提取血清中總RNA，經(jīng)Narodrp1000鑒定濃度及純度，OD260/OD280=1.8～2.1之間。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參基因,反應(yīng)條件:94℃ 5 s 、58 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s、45個(gè)循環(huán),引物購(gòu)于上海生工公司。 lncRNA DLX6-AS1上游序列為5’-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3’，下游序列為5’-ATTGACATGTTAGTGCCCTT-3’；GAPDH上游序列為5’- GAGTCCACTGGCGTCTTCAC-3’，下游序列為5’-ATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT-3’。采用2-△△CT法計(jì)算lncRNA DLX6-AS1的相對(duì)表達(dá)水平。依據(jù)lncRNA DLX6-AS1的相對(duì)表達(dá)量平均數(shù)2.24將患者分為lncRNA DLX6-AS1高表達(dá)組、lncRNA DLX6-AS1低表達(dá)組。

1.2.2血清中Actinin-4表達(dá)水平檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清Actinin-4表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物公司。簡(jiǎn)要步驟：反應(yīng)板設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，每孔加入對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本50μL，分別加入酶結(jié)合物100μL，混勻后封板膜封板，37℃恒溫箱孵育30min。加入150μL洗滌液反復(fù)洗滌5次，分別加底物A液、B液各50μL，混勻后封板膜封板，37℃恒溫箱孵育15min，每孔加終止液50μL，充分混勻。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD450nm值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度的OD值，對(duì)應(yīng)計(jì)算每孔樣品的濃度值。根據(jù)Actinin-4表達(dá)平均數(shù)48.95pg/mL，將患者分為Actinin-4高表達(dá)組、Actinin-4低表達(dá)組。

1.2.3隨訪:以宮頸癌患者出院后開始進(jìn)行隨訪，以電話或門診方式進(jìn)行隨訪，連續(xù)隨訪3年，第一年每三個(gè)月隨訪一次，第2、3年每六個(gè)月進(jìn)行一次隨訪,以隨訪過程中是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)為終點(diǎn),隨訪終點(diǎn)為腫瘤復(fù)發(fā)或隨訪結(jié)束。根據(jù)復(fù)發(fā)時(shí)間計(jì)算患者的無進(jìn)展生存時(shí)間。依據(jù)是否復(fù)發(fā)將研究對(duì)象分為復(fù)發(fā)組(19例)和無復(fù)發(fā)組(101例)兩組。

2 結(jié) 果

2.1宮頸癌組與對(duì)照組患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)比較:宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1相對(duì)表達(dá)量、Actinin-4水平分別為(2.24±0.37)、(48.95 ± 11.65)pg/mL，對(duì)照組分別為(1.31±0.25)、(30.84 ± 7.16)pg/mL。與對(duì)照組相比，宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.278、15.844，P=0.000、0.000)。

2.2宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)的相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)分析結(jié)果，宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1與Actinin-4的表達(dá)呈顯著正相關(guān)性(r=0.560、P=0.000)。

2.3宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系:不同F(xiàn)IGO分期、病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同年齡、腫瘤直徑及病理類型之間，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 宮頸癌血清lncRNA DLX6-AS1 Actinin-4表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.4宮頸癌組血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)對(duì)宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的影響:120例宮頸癌患者隨訪過程中，隨訪期間無失訪，復(fù)發(fā)19例，3年復(fù)發(fā)率為15.83%(19/120)。lncRNA DLX6-AS1高表達(dá)組3年無進(jìn)展生存率為75.86%(44/58)，顯著低于低表達(dá)組91.94%(57/62)(Log-rank χ2=4.846，P=0.000)；lncRNA DLX6-AS1高表達(dá)組無進(jìn)展生存時(shí)間平均為(32.75±1.29)個(gè)月，明顯短于低表達(dá)組(34.14±1.47)個(gè)月(t=5.500，P=0.000)。Actinin-4高表達(dá)組3年無進(jìn)展生存率為72.88%(43/59)，顯著低于低表達(dá)組95.08%(58/61)(Log-rank χ2=5.124，P=0.000)；Actinin-4高表達(dá)組無進(jìn)展生存時(shí)間平均為(32.68±1.56)個(gè)月，明顯短于低表達(dá)組(34.14±1.60)個(gè)月(t=5.056，P=0.000)，見圖1。

圖1 ROC曲線分析血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)對(duì)宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的影響

2.5單因素及多因素COX回歸分析影響宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的因素:單因素分析結(jié)果，無復(fù)發(fā)組與復(fù)發(fā)組之間在間質(zhì)浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、FIGO分期、lncRNA DLX6-AS1及Actinin-4之間(均P<0.05)，兩組在年齡、腫瘤直徑、病理類型之間無明顯差異(均P>0.05)。見表2。以是否發(fā)生復(fù)發(fā)為因變量(t=時(shí)間，1=復(fù)發(fā)，0=無復(fù)發(fā))，將單因素分析中有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素包括間質(zhì)浸潤(rùn)深度(賦值：1=>1/2，0=≤1/2)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(賦值：1=有，0=無)、病理分級(jí)(賦值：1=低分化，0=高中分化)、FIGO分期(賦值：1=ⅡA，0=ⅠA～ⅠB)、lncRNA DLX6-AS1(賦值：1=高表達(dá)，0=低表達(dá))及Actinin-4(賦值：1=高表達(dá)，0=低表達(dá))納入多因素COX比例回歸模型，結(jié)果顯示,病理分級(jí)低分化、FIGO分期ⅡA期、lncRNA DLX6-AS1高表達(dá)﹑Actinin-4高表達(dá)是影響宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)。見表3。

表2 單因素分析影響宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的因素

表3 多因素COX回歸分析影響宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素

3 討 論

目前對(duì)于早期宮頸癌以手術(shù)治療為主，宮頸癌根治性術(shù)是主要的術(shù)式。研究表明，對(duì)于ⅠB～ⅡA的宮頸癌患者，宮頸癌根治治術(shù)術(shù)后患者的5年生存率可達(dá)75%以上，但仍有部分患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)[6]。影響宮頸癌根治術(shù)術(shù)后復(fù)發(fā)的因素包括腫瘤分期、分級(jí)等臨床病理因素，但臨床中發(fā)現(xiàn)，宮頸癌具有較大的異質(zhì)性，即使相同臨床分期的患者也具有不同的復(fù)發(fā)傾向。lncRNA是一種長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄物，可作為癌基因或抑制基因，參與人類腫瘤、炎癥及免疫等疾病的病理生理學(xué)過程。國(guó)內(nèi)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者血清LncRNA SRA水平與患者的臨床預(yù)后關(guān)系密切，可作為評(píng)估宮頸癌預(yù)后的生物標(biāo)志物[7]。深入研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找能夠預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)的血清LncRNA腫瘤標(biāo)志物，能夠輔助臨床醫(yī)師對(duì)高?；颊哂枰苑e極治療及密切隨訪，以降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，改善患者臨床預(yù)后。

LncRNA DLX6-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤促進(jìn)作用的新的LncRNA分子，在膀胱癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均參與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖及轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)過程，可能是新的腫瘤診斷及生物治療的靶點(diǎn)[3]。本研究中，宮頸癌患者血清lncRNA DLX6-AS1表達(dá)明顯升高，并且其表達(dá)與FIGO分期、病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示lncRNA DLX6-AS1可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。宮頸癌中表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中H3組蛋白第4位賴氨酸一甲基化能夠顯著激活lncRNA DLX6-AS1基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)腫瘤對(duì)順鉑耐藥性形成[8]。此外，lncRNA DLX6-AS1能夠作為內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性RNA，抑制微小RNA-16-5p，導(dǎo)致下游環(huán)腺苷酸調(diào)節(jié)的磷酸化蛋白19過度激活，促進(jìn)腫瘤的惡性增殖及轉(zhuǎn)移[9]，而在宮頸癌細(xì)胞中敲除lncRNA DLX6-AS1的表達(dá)后，其下游癌基因FUS表達(dá)顯著受到抑制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力降低[10]。因此，lncRNA DLX6-AS1表達(dá)升高參與促進(jìn)宮頸癌的腫瘤進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，血清lncRNA DLX6-AS1高表達(dá)患者無進(jìn)展生存率明顯較低，并且lncRNA DLX6-AS1高表達(dá)是影響宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明檢測(cè)血清lncRNA DLX6-AS1表達(dá)有助于判斷宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)后，是一種新的預(yù)后判斷的腫瘤標(biāo)志物。宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)與腫瘤細(xì)胞的血管及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。研究表明，lncRNA DLX6-AS1的表達(dá)升高能夠通過誘導(dǎo)糖基轉(zhuǎn)移酶LARGE的甲基化，沉默LARGE的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移[11]。

Actinin-4是ACTN家族成員，作為一種細(xì)胞骨架蛋白，其在N端有一個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合域，能與肌動(dòng)蛋白交聯(lián)，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)及參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)。近年來發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中Actinin-4作為一種促癌基因，通過激活A(yù)kt/GSK3β信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，是新的腫瘤標(biāo)志物[5]。本研究中，宮頸癌患者血清Actinin-4水平明顯高于對(duì)照組，提示Actinin-4可能參與宮頸癌的腫瘤發(fā)生。分析其機(jī)制，可能與宮頸癌中Actinin-4蛋白穩(wěn)定性增加有關(guān)。研究表明，宮頸癌腫瘤細(xì)胞中Na+/H+交換調(diào)節(jié)因子1表達(dá)顯著下調(diào)，導(dǎo)致其對(duì)Actinin-4蛋白泛素化能力降低，Actinin-4蛋白經(jīng)蛋白酶體途徑降解減少，進(jìn)而激活下游Wnt通路，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移[12]。尚有研究表明，宮頸癌中Actinin-4基因啟動(dòng)子存在擴(kuò)增的現(xiàn)象，導(dǎo)致Actinin-4蛋白過度表達(dá)激活，導(dǎo)致患者血清Actinin-4水平升高[13]。本研究中，血清Actinin-4表達(dá)與FIGO分期、病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示Actinin-4的表達(dá)升高可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌腫瘤細(xì)胞中Actinin-4能夠促進(jìn)癌細(xì)胞干性表型轉(zhuǎn)化，不僅促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)，還能通過結(jié)合ATP結(jié)合盒家族G2，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥性的形成[14]。本研究中，血清Actinin-4高表達(dá)患者無進(jìn)展生存率明顯較低，并且血清Actinin-4高表達(dá)是影響宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明檢測(cè)血清Actinin-4水平有助于評(píng)估宮頸癌患者術(shù)后的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，是一種新的預(yù)后相關(guān)血清標(biāo)志物。目前臨床上宮頸癌的血清標(biāo)志物包括鱗狀細(xì)胞癌抗原，糖類抗原125及癌胚抗原等。但不同臨床研究由于研究對(duì)象，分期分級(jí)等因素，難以取得一致的結(jié)果，因而目前尚無一種血清標(biāo)志物用于宮頸癌術(shù)后預(yù)后的判斷。臨床上部分早期宮頸癌患者根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)與切除區(qū)域外仍有腫瘤的微轉(zhuǎn)移有關(guān)，而目前影像學(xué)等檢查并不能早期發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4作為新的血清標(biāo)志物，有助于反映宮頸癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，臨床醫(yī)生對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)復(fù)發(fā)的患者提供個(gè)性化的輔助化療，減少術(shù)后復(fù)發(fā)的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌血清lncRNA DLX6-AS1與Actinin-4的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，提示兩者可能共同參與宮頸癌腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。目前其機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA DLX6-AS1能夠作為分子海綿結(jié)合并抑制微小RNA-142-3p的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞干性表型的維持，而腫瘤中微小RNA-142-3p的表達(dá)降低導(dǎo)致其下游的Actinin-4表達(dá)異常升高，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[15]。但宮頸癌中是否存在lncRNA DLX6-AS1對(duì)Actinin-4的表達(dá)調(diào)控，有待今后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索。

綜上所述,宮頸癌患者血清lncRNA DLX6-AS1、Actinin-4表達(dá)升高，兩者的表達(dá)與FIGO分期、病理分級(jí)、間質(zhì)浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，是影響宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,可能成為宮頸癌病情及復(fù)發(fā)預(yù)后評(píng)估的血清腫瘤標(biāo)志物。本研究的不足之處在于為單中心研究，樣本量有限，有待今后設(shè)計(jì)多中心前瞻性臨床研究進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論，并對(duì)兩者的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行深入探討。