安依凡， 曹洋， 毛文林， 何佶弦， 楊洋， 李斌

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 植物病毒/資源微生物實(shí)驗(yàn)室，陜西 楊凌 712100；2.四川省煙草公司廣元市公司，四川 廣元 628017； 3.四川省煙草公司宜賓市公司，四川 宜賓 644000；4.中國煙草總公司四川省公司，四川 成都 610000)

煙草赤星病是煙葉成熟期病害，1892年在美國首次發(fā)現(xiàn)[1]，其病原為鏈格孢菌，屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目鏈格孢屬。該屬真菌的分生孢子梗呈淡褐色至褐色，由菌絲上生出，與菌絲無明顯區(qū)別[2]，其分生孢子最適宜在煙葉表面萌發(fā)，易從葉毛基部細(xì)胞、葉緣和蟲咬傷口處侵入，有時(shí)也可從氣孔侵入[3]。

微生物拮抗作用是指一種微生物在其生命過程中，通過產(chǎn)生某些代謝產(chǎn)物而改變其他微生物的生存環(huán)境，從而使其他微生物的生長受到抑制，甚至致死的現(xiàn)象[4]。煙草赤星病孢子主要靠風(fēng)傳播，對(duì)于用微生物菌劑防止煙草赤星病菌侵染，需要配合劑型為可噴霧水劑的葉面噴霧拮抗菌劑來阻擋病菌侵染。

一般來講，在植物根系分泌物中，微生物的營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)有益菌和病菌都有吸引作用。利用微生物抑制病菌生長的一個(gè)思路是，首先找到植物根系分泌物中營養(yǎng)物質(zhì)所吸引的有益菌，比如某些芽孢桿菌，然后將其培養(yǎng)為數(shù)量占優(yōu)的頭領(lǐng)微生物[5]，再利用與植物和諧生長的該芽孢桿菌的殺菌和占位效應(yīng)來抑制病菌。王麗珍[6]從重慶市煙區(qū)煙草根際土壤中篩選出抗赤星病的生防菌巨大芽孢桿菌B-43-6；李安娜等[7]從山東煙田煙草根際和根圍土壤中篩選出抗赤星病的芽孢桿菌B102；張芬芬等[8]從甜羅勒根際篩選出對(duì)煙草赤星病菌具有抑制作用的枯草芽孢桿菌LL-16；王靜等[9]從煙草根際土壤中篩選出抗赤星病的生防菌[10]短小芽孢桿菌AR03。本研究進(jìn)行了拮抗赤星病菌的煙草根際細(xì)菌篩選，旨在判斷拮抗細(xì)菌YF-6是否具有研發(fā)煙草赤星病生防可噴霧水劑的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年8月，在陜西省漢中市南鄭縣新集鎮(zhèn)煙區(qū)和四川省廣元市劍閣縣普安鎮(zhèn)煙區(qū)采集健壯煙株根際土壤樣本。供試菌株有煙草赤星(Alternariaalternata)、辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)、蘋果炭疽(Colletotrichumgloeosporioides)、棉花枯萎(Fusariumoxysporum)、玉米大斑(Exserohilumturcicum)、枯草芽孢桿菌1號(hào)(Bacillussubtilis1)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物病毒和資源微生物試驗(yàn)室保存和提供，采用LB(luria-bertani)培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 根際細(xì)菌的分離與菌株制作

土樣采集。找到長勢(shì)旺盛、無病蟲害的煙草植株，從莖稈底部由中心向四周刨開土壤，使根系露出，收集根系周圍小顆粒的土壤，剪下部分根系，將土壤和根系裝入自封袋中。

根際細(xì)菌的分離。稱取土壤樣本10 g，倒入裝有90 mL無菌水的錐形瓶中[11]，于200 r·min-1振蕩20 min[12]，60 ℃水浴30 min，制成1∶10的土壤稀釋液，用移液槍吸取1 mL，加入9 mL無菌水充分振蕩，制成1∶102的土壤稀釋液。依此類推，分別制成1∶103、1∶104、1∶105、1∶106的土壤稀釋液。每個(gè)濃度的土壤稀釋液搖勻后用移液槍移取250 μL至LB平板上，用玻璃涂布器畫圈涂勻封口，在26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d。

挑取形態(tài)、顏色等特征不同的菌落畫線于提前制作好的LB斜面，每個(gè)不同的菌落畫線3個(gè)斜面，編號(hào)后在26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，待細(xì)菌沿斜面畫線完全生長，即完成菌株制作。

1.2.2 從根際細(xì)菌中篩選拮抗細(xì)菌

初篩。接種煙草赤星病菌至PDA平板，待其長滿后，用5 mm打孔器打孔，將菌餅移到對(duì)峙用PDA平板中央。對(duì)分離到的細(xì)菌按編號(hào)順序，每3個(gè)菌依次接種在距離病菌3 cm的3個(gè)對(duì)角上，另1個(gè)對(duì)角作為空白對(duì)照，重復(fù)2組。于26 ℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d，根據(jù)抑菌帶寬度確定拮抗程度，選取拮抗效果好的菌株，視為拮抗細(xì)菌。

復(fù)篩。將5 mm煙草赤星病菌的菌餅接種至PDA平板中央，對(duì)初篩選擇的拮抗細(xì)菌，單菌接種在距離病菌3 cm的兩點(diǎn)最遠(yuǎn)的對(duì)稱位置，重復(fù)2組。26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d，測(cè)量5 d樣本和12 d樣本的對(duì)峙試驗(yàn)數(shù)據(jù)[13]。篩選效果最好的1株拮抗細(xì)菌，對(duì)其12 d樣本進(jìn)行顯微鏡觀察，觀察靠近抑菌圈邊緣的病菌菌絲的生長情況，以遠(yuǎn)離抑菌圈的病菌菌絲為對(duì)照。

1.2.3 拮抗細(xì)菌的觀察與鑒定

制作YF-6 LB培養(yǎng)液，梯度稀釋找到Y(jié)F-6菌落，并觀察其形態(tài)。挑取少量YF-6菌株，分置于盛有100、500 μL無菌水的離心管內(nèi)，振蕩均勻，吸取2.5 μL涂于蓋玻片上，制作高濃度(100 μL)和低濃度(500 μL)蓋玻片樣本，在電鏡下對(duì)YF-6進(jìn)行觀察，并送第三方進(jìn)行菌種鑒定。

1.2.4 拮抗細(xì)菌的生測(cè)試驗(yàn)

施用對(duì)象為延安1號(hào)溫室煙苗，設(shè)為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四組，每組4株煙苗，保證所選16株煙苗大小接近。YF-6的10倍稀釋LB培養(yǎng)液(9×106mL-1)施用于Ⅰ組煙苗；YF-6的50倍稀釋LB培養(yǎng)液(1.8×106mL-1)施用于Ⅱ組煙苗；LB 50倍稀釋液施用于Ⅲ組煙苗；無菌水施用于Ⅳ組煙苗。

先進(jìn)行煙苗灌根試驗(yàn)，施用品施用量為每棵煙苗50 mL，灌根后觀察煙苗11 d。若灌根對(duì)煙苗無害，則重復(fù)試驗(yàn)設(shè)置，對(duì)煙苗進(jìn)行葉噴試驗(yàn)，3 d后重復(fù)葉噴，繼續(xù)觀察煙苗生長情況。若葉噴也對(duì)煙苗無害，則將煙草赤星病菌培養(yǎng)液等量噴淋于4組煙苗葉面上，以噴淋后7 d時(shí)間為觀察截點(diǎn)，評(píng)價(jià)YF-6的防病效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗細(xì)菌YF-6

從11份煙草根際土壤樣本中分離得到81種形態(tài)根際細(xì)菌，制作共計(jì)243支菌株斜面。初篩得到9株對(duì)煙草赤星病菌有拮抗效果的根際細(xì)菌。復(fù)篩得到1株拮抗效果最好的根際細(xì)菌YF-6。

比較對(duì)峙試驗(yàn)中赤星病菌的生長參數(shù)篩選根際細(xì)菌。在表1中，5 d抑菌直徑(對(duì)峙5 d病菌生長的最大長度減去最小長度)反映拮抗細(xì)菌的殺菌能力，12 d邊沿遠(yuǎn)端距離(對(duì)峙12 d病菌生長邊沿端點(diǎn)之間的直線距離)反映拮抗細(xì)菌的占位能力，12 d最小寬度(對(duì)峙12 d病菌生長的最小長度)反映病菌活性。光學(xué)顯微鏡下觀察(圖1、2)，在對(duì)峙試驗(yàn)中，細(xì)菌YF-6使煙草赤星病菌菌絲顏色加深，膨大變粗，且分支增多。

表1 有效菌株與參照菌株的復(fù)篩試驗(yàn)數(shù)據(jù)

圖1 YF-6細(xì)菌培養(yǎng)5 d(左)和12 d(右)復(fù)篩樣本

圖2 12 d樣本中對(duì)峙最近處(左)和對(duì)峙最遠(yuǎn)處(右)的煙草赤星病菌菌絲形態(tài)

2.2 YF-6的抑菌譜

圖3顯示，YF-6對(duì)辣椒疫霉病菌、蘋果炭疽病菌、棉花枯萎病菌、玉米大斑病菌均有良好的抑菌效果，YF-6具有抑菌廣譜性。

圖3 YF-6的抑菌譜

2.3 YF-6的形態(tài)

圖4顯示，YF-6菌落外圍呈淡黃色，邊沿處呈放射鋸齒狀生長，菌落中心呈奶白色，有兩圈輪紋凸起，大輪紋外密集分布細(xì)小白色顆粒，挑起時(shí)有黏稠感。電鏡下，YF-6單菌長1.3～1.5 μm，寬0.5～0.6 μm，呈近似桿狀的橢圓形，菌體一端較明亮，偶有尖銳突出，兩側(cè)有褶皺，中部有縱向隆起。經(jīng)青島正信檢測(cè)分析有限公司鑒定，YF-6為解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens。

圖4 YF-6菌落和電鏡照片

2.4 生測(cè)試驗(yàn)

圖5顯示，Ⅰ、Ⅱ組的溫室煙苗葉片深綠，有生長，未見煙草赤星病菌侵染；Ⅲ組和無菌水的溫室煙苗出現(xiàn)煙草赤星病菌侵染。

圖5 YF-6不同培養(yǎng)液的侵染情況

Ⅰ組的促生效果體現(xiàn)在以下3個(gè)指標(biāo)。Ⅰ組株高平均為14.2 mm，Ⅳ組平均為13.8 mm，Ⅰ組大于Ⅳ組3.1%；Ⅰ組最大葉長平均為14.2 mm，Ⅳ組平均為12.8 mm，Ⅰ組高于Ⅳ組10.6%；Ⅰ組最大葉展寬度平均為23.6 mm，Ⅳ組平均為20.7 mm，Ⅰ組大于Ⅳ組14.1%(表2)。

表2 YF-6 10倍稀釋培養(yǎng)液對(duì)延安1號(hào)溫室煙苗促生效果數(shù)據(jù)

3 小結(jié)與討論

本研究從采自四川、陜西的煙草根際土壤樣本中分離得到81種形態(tài)、243株根際細(xì)菌，對(duì)峙篩選出1株拮抗煙草赤星病菌效果最好的細(xì)菌YF-6，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。生測(cè)試驗(yàn)表明，YF-6 10倍稀釋培養(yǎng)液(9×106mL-1)可以防止煙草赤星病菌侵染，且對(duì)延安1號(hào)溫室煙苗有促進(jìn)生長的作用。

煙草赤星病是一類嚴(yán)重影響煙草生產(chǎn)的病害，煙草赤星病的防治可以分為農(nóng)業(yè)防治、抗性品種選擇、化學(xué)藥劑防治、生物防治[14]。依靠拮抗細(xì)菌防治煙草赤星病是煙草植保研究的一個(gè)方向[15]，芽孢桿菌因具有產(chǎn)芽孢、抗逆性強(qiáng)、容易在環(huán)境中存活與增殖的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為研發(fā)煙草赤星病生防菌劑的對(duì)象[16]。試驗(yàn)證明，本研究得到的煙草根際細(xì)菌解淀粉芽孢桿菌YF-6拮抗煙草赤星病菌，且具有研發(fā)成為預(yù)防煙草赤星病可噴霧水劑的潛力。