朱勇， 李永華

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315040； 2.寧波市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，浙江 寧波 315000)

氟苯尼考(florfenicol)作為常規(guī)藥物，別稱氟甲砜霉素，是氯霉素類第3代廣譜抗菌藥物[1]，氟苯尼考胺是最主要的代謝產(chǎn)物[2]。在禽類養(yǎng)殖中氟苯尼考主要用于防治大腸埃希氏菌及傳染性漿膜炎等敏感菌所致疾病，有較強的抗菌活性，對耐氯霉素和甲砜霉素的大腸埃希氏菌、沙門氏菌及克雷伯菌也有良好抗菌作用[1]。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》[3]的規(guī)定，家禽肌肉中氟苯尼考檢出限量為100 μg·kg-1，產(chǎn)蛋期禁用。雖然產(chǎn)蛋期禁用理解為雞蛋中不得檢出氟苯尼考還存在爭議，但是日常監(jiān)管中一般以雞蛋中氟苯尼考不得檢出為判斷依據(jù)。

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、市場監(jiān)管總局、公安部、最高人民法院、最高人民檢察院、工業(yè)和信息化部、國家衛(wèi)生健康委等七部門的《食用農(nóng)產(chǎn)品“治違禁控藥殘促提升”三年行動方案》[4]，雞蛋是重點治理品種，而氟苯尼考(含氟苯尼考胺)是寧波地區(qū)雞蛋不合格的重要原因之一。本研究根據(jù)寧波蛋雞養(yǎng)殖習(xí)慣投喂氟苯尼考，在蛋雞開產(chǎn)前、開產(chǎn)后額外投喂氟苯尼考，模擬蛋雞養(yǎng)殖過程中正常用藥與違規(guī)用藥行為，檢測用藥后的雞蛋中氟苯尼考(含氟苯尼考胺)的含量，分析殘留規(guī)律，為養(yǎng)殖戶制定合理的棄蛋期，為政府監(jiān)管雞蛋質(zhì)量安全提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

LC-MS/MS(Waters)，色譜柱LeapsilC18(2.1×150 mm，2.7 μm)，勻質(zhì)器(IKA T25)，高速離心機(Sigma 3K15)，恒溫振蕩器(IKA KS 4000ic)，旋渦混合器(IKA GENIUS3)，以及離心管、電子天平等。

1.2 試劑和材料

乙腈、甲醇(色譜純，美國默克公司)；乙酸銨(99.99%，阿拉丁公司)；氨水(優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)：乙酸乙酯(色譜純，美國天地試劑公司)；氟苯尼考和氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Dr.Ehrenstorfer)；氟苯尼考-D3和氟苯尼考胺-D3內(nèi)標(biāo)(TRC)。

1.3 養(yǎng)殖基地及試驗動物品種

養(yǎng)殖基地在寧波市鎮(zhèn)海岳軍特種養(yǎng)殖場，蛋雞品種為北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司培育的京紅1號。

1.4 試驗藥物

試驗所用氟苯尼考藥物采購于當(dāng)?shù)剞r(nóng)資店。先后使用了2家公司生產(chǎn)的藥物，分別為浙江伊科拜克動物保健品有限公司(每袋1 kg，含量10%)和義烏雙峰藥業(yè)有限公司(每袋100 g，含量20%)。

1.5 蛋雞養(yǎng)殖用藥試驗

該批試驗蛋雞2021年6月30日為1日齡。按養(yǎng)殖基地日常飼養(yǎng)蛋雞方式進行養(yǎng)殖，進行常規(guī)的用藥和打疫苗。雛雞階段用藥1次，連續(xù)用藥4 d(7月22—25日)，將160 g氟苯尼考(浙江伊科拜克動物保健品有限公司生產(chǎn))混入200 kg水中(實際濃度0.08 g·kg-1)，雛雞通過飲水，將藥物帶入體內(nèi)。育成期用藥2次，每次連續(xù)用藥4 d(9月9—12日，10月24—27日)，將400 g氟苯尼考(義烏雙峰藥業(yè)有限公司)混入400 kg水中(實際濃度0.2 g·kg-1)，小雞通過飲水，將藥物帶入體內(nèi)。正常養(yǎng)殖蛋雞，此后不再使用氟苯尼考，以遵照GB 31650—2019規(guī)定，產(chǎn)蛋期禁止使用氟苯尼考。

本研究模擬2類違規(guī)用藥情況，分別是開產(chǎn)前用藥和開產(chǎn)后用藥，試驗濃度分3檔，中濃度為獸醫(yī)推薦使用濃度。

在開產(chǎn)前模擬用藥1次，連續(xù)用藥4 d(11月19—22日)。在正常養(yǎng)殖蛋雞中隨機選擇63只，分低、中、高3檔，每檔各21只，分開籠養(yǎng)。按50、100、150 kg飼料中均加入100 g氟苯尼考粉(義烏雙峰藥業(yè)有限公司)濃度比例，形成高、中、低3類試驗濃度(實際濃度為2、1、0.67 g·kg-1)，將藥物加入2 kg飼料中，給高、中、低各檔(21只)蛋雞喂食。在開產(chǎn)后模擬用藥1次，連續(xù)用藥4 d(12月20—23日)。再次在正常養(yǎng)殖蛋雞中選擇63只，形成高、中、低3檔，每檔各21只，分開籠養(yǎng)。按50、100、150 kg飼料中均加入100 g氟苯尼考粉(義烏雙峰藥業(yè)有限公司)濃度比例，形成高、中、低3類試驗濃度(實際濃度2、1、0.67 g·kg-1)，將藥物加入2 kg飼料中，給高、中、低各檔(21只)蛋雞喂食。

用藥后的雞蛋按高、中、低3類分類進行收集，收集的雞蛋全部勻漿進行檢測，直至含量低于檢出限，停止收集。

1.6 檢測方法

1.6.1 樣品前處理

將收集的雞蛋全蛋勻漿，稱取新鮮勻漿后雞蛋樣品5 g置于50 mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)20 μL(1 mg·kg-1)后，加入15.0 mL乙酸乙酯和0.5 mL氨水，勻漿，振蕩30 min后離心5 min，殘渣再加入15 mL乙酸乙酯和0.5 mL氨水(洗刀頭)重復(fù)提取，合并提取液，取12 mL氮吹，用甲醇水溶液(水∶甲醇=9∶1)定容至1 mL，冷凍離心13 000 r·min-1、10 min，過0.22 μm濾膜后供LC-MS/MS測定。

1.6.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制濃度氟苯尼考、氟苯尼考胺均為0.020 0 mg·L-1。

1.6.3 檢測條件

色譜條件。色譜柱為LeapsilC18 (2.1 mm×150 mm，2.7 μm)，柱溫40 ℃，樣品室溫度10 ℃，進樣體積10 μL，流動相為10 mmol·L-1的乙酸銨溶液(A)和乙腈(B)。

梯度洗脫程序。0～1.0 min，流動相A∶B為9∶1；1.0～4.0 min，流動相A∶B為3∶7；4.0～5.2 min，流動相A∶B為0∶100；5.2～7.5 min，流動相A∶B為9∶1。流速保持穩(wěn)定均為0.3 mL·min-1。

質(zhì)譜條件。電噴霧離子源；正離子掃描模式；電離電壓0.5 kV(氟苯尼考胺)；負離子掃描模式；電離電壓-2.5 kV(氟苯尼考)；霧化氣流速1 000 L·h-1；錐孔氣流速50 L·h-1；離子源溫度150 ℃；霧化溫度500 ℃；氟苯尼考母離子為356.1(m/z)，子離子為184.96(m/z，定量)、335.98 (m/z)，駐留時間0.059 s，錐孔電壓28 V，碰撞電壓20 eV；氟苯尼考胺母離子為248.1 (m/z)，子離子為130.14(m/z，定量)、117.86(m/z)、91.01(m/z)，駐留時間0.059 s，錐孔電壓42 V，碰撞電壓根據(jù)上述子離子分別為20、36、44 eV。

2 結(jié)果與分析

2.1 雛雞、育成期用藥藥物殘留及消解規(guī)律

正常蛋雞養(yǎng)殖時，在雛雞、育成期階段都會用藥，最后一次用藥在育成期(10月27日)，間隔22日之后，開始陸續(xù)下蛋。研究組于11月18—21日隨機選擇開產(chǎn)前階段下的10枚蛋為1個批次進行檢測，均未檢出氟苯尼考和氟苯尼考胺。一般雞蛋均選擇開產(chǎn)后能穩(wěn)定供應(yīng)才進行商品買賣。所以，按照正常的養(yǎng)殖方式，在雛雞階段、育成期階段用藥，不會對正常商品蛋產(chǎn)生影響。

2.2 開產(chǎn)前用藥藥物殘留及消解規(guī)律

11月18—21日對開產(chǎn)前的蛋雞進行用藥試驗。隨著用藥的進行，雞蛋中同時能檢出氟苯尼考和氟苯尼考胺，且濃度遞增。在用藥停止后第1天(22日)達到峰值，高濃度用藥的氟苯尼考為1.07×103μg·kg-1，氟苯尼考胺為318 μg·kg-1，隨后下降。第6天氟苯尼考為55.5 μg·kg-1，首次降至100 μg·kg-1以下，此時氟苯尼考胺也降至71.0 μg·kg-1；第11天氟苯尼考降至1 μg·kg-1以下，為0.469 μg·kg-1，氟苯尼考胺第一次未檢出；第16天氟苯尼考第一次未檢出(<0.1 μg·kg-1)。數(shù)據(jù)詳見表1。由于中、低濃度處理的蛋雞未能在用藥結(jié)束后立刻產(chǎn)蛋，故數(shù)據(jù)無法體現(xiàn)整個過程，最早產(chǎn)蛋為第5天，濃度明顯低于高濃度處理同一天的數(shù)據(jù)。用藥的第8天，中低濃度處理的氟苯尼考含量降至1 μg·kg-1以下，氟苯尼考胺第一次未檢出(<1 μg·kg-1)；第12天氟苯尼考第一次未檢出(<0.1 μg·kg-1)。數(shù)據(jù)詳見表1。

表1 開產(chǎn)前用藥雞蛋中藥物殘留情況

在停藥后，雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺含量隨著時間逐漸減少，蛋雞在開產(chǎn)前按藥品推薦濃度用藥，從試驗的中低濃度用藥的情況看，第12天雞蛋中未檢出氟苯尼考；如果用藥濃度高于推薦值，則大約需要15 d。從模擬的用藥濃度看，大約需要半個月(2周)的時間雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺才都未檢出，符合安全要求。

由于開產(chǎn)后用藥試驗未做，故一直對產(chǎn)下的雞蛋進行收集，發(fā)現(xiàn)在雞蛋合格的15～19 d后，又重新檢出來氟苯尼考(未檢出氟苯尼考胺)，含量均低于0.5 μg·kg-1，基本在0.1～0.2 μg·kg-1，含量較低。這次氟苯尼考的出現(xiàn)，將間隔期延長至用藥結(jié)束后的40 d才能安全。這與陳大偉等[5]的研究相同，殘留消解規(guī)律存在個別不確定性。

2.3 開產(chǎn)后用藥藥物殘留及消解規(guī)律

12月20—23日連續(xù)4 d對開產(chǎn)后的蛋雞進行用藥試驗。由于開產(chǎn)后蛋雞已經(jīng)穩(wěn)定產(chǎn)蛋，3個試驗濃度均能采集雞蛋。從檢測的結(jié)果看，不同濃度處理的氟苯尼考(氟苯尼考胺)含量隨時間推移均呈下降趨勢。數(shù)據(jù)詳見表2。氟苯尼考含量降至100 μg·kg-1以下，低、中、高濃度組分別需要2、3、6 d時間；降至1 μg·kg-1以下，低、中、高濃度組均用了10 d時間，此時氟苯尼考胺也降至1 μg·kg-1(未檢出)；氟苯尼考含量降至0.1 μg·kg-1以下，低濃度組需要11 d，中濃度組需要12 d時間，高濃度組需要19 d的時間。此外，消解規(guī)律的個別不確定性又在高濃度組出現(xiàn)，第15、16天的2次檢測結(jié)果短暫的出現(xiàn)未檢出后，又在第17、18天陸續(xù)檢出，第19天后一直未檢出。

表2 開產(chǎn)后用藥雞蛋中藥物殘留情況

3 小結(jié)

正常養(yǎng)殖方式下，在雛雞階段和育成期使用氟苯尼考不會對開產(chǎn)后的商品雞蛋質(zhì)量安全產(chǎn)生影響。在本研究用藥條件下，開產(chǎn)前蛋雞生病需要使用氟苯尼考，最好能做到40 d的安全間隔期，才能將所產(chǎn)雞蛋作為商品蛋供應(yīng)市場，以確保雞蛋的質(zhì)量安全；開產(chǎn)后蛋雞生病需要使用氟苯尼考，用藥結(jié)束后，為確保雞蛋的質(zhì)量安全，至少要做到20 d的棄蛋期，才能將所產(chǎn)雞蛋作為商品蛋供應(yīng)市場。