馬全民， 劉王梅， 聶復(fù)禮， 張堯， 汪娟

(1.浙江惠松制藥有限公司，浙江 杭州 310000； 2.浙江科技學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023)

藍(lán)莓是一種甜味多汁、營(yíng)養(yǎng)健康的深藍(lán)色漿果，具有抗氧化、抗癌、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解視覺疲勞等多種功效，是世界糧農(nóng)組織推薦的5種健康水果之一，被譽(yù)為“水果皇后”[1-2]。藍(lán)莓富含酚酸、木質(zhì)素、單寧等酚類化合物和花青素、黃烷醇等黃酮類化合物，其中花青素含量在所有水果和蔬菜中最高[3]?；ㄇ嗨厥且环N廣泛存在于植物中的天然色素，由牽牛花色素、錦葵色素、飛燕草色素、矢車菊色素、芍藥色素等花青素苷元及這些苷元與乙酰阿拉伯糖、半乳糖、乙酰葡萄糖、葡萄糖、阿拉伯糖連接所形成的花青素糖苷組成[4]?；ㄇ嗨匾蚱渚哂星宄杂苫?、抗氧化應(yīng)激、抗炎癥、抗輻射、保護(hù)視網(wǎng)膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等多種功能而備受關(guān)注[5]。將藍(lán)莓中花青素提取出來作為膳食補(bǔ)充劑，不僅可以充分利用其生理功能，而且可以解決藍(lán)莓不耐貯藏、易腐爛等問題，提高藍(lán)莓的商品價(jià)值。因此，藍(lán)莓花青素的提取和制備工藝受到研究人員的關(guān)注。

超聲輔助提取法是利用超聲波振動(dòng)帶來的空化效應(yīng)，強(qiáng)大的壓力使植物細(xì)胞壁瞬間破裂，從而促進(jìn)胞內(nèi)活性物的溶出[6]。超聲和酶的聯(lián)合使用結(jié)合了超聲提取和酶法提取的優(yōu)點(diǎn)，提取時(shí)間短、效率高，且能保持提取物的活性，已被廣泛用于提取活性物質(zhì)[7]。本研究以藍(lán)莓為對(duì)象，采用Plackett-Burman(篩選試驗(yàn))設(shè)計(jì)法、最陡爬坡路徑法和Box-Behnken(盒狀試驗(yàn))設(shè)計(jì)中的響應(yīng)面分析法，對(duì)酶輔助超聲提取藍(lán)莓花青素工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藍(lán)莓原料購(gòu)自本地農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，-20 ℃冷凍保存。果膠酶和纖維素酶購(gòu)自南寧龐博生物工程有限公司。矢車菊素-3-O-葡萄糖購(gòu)自上海百靈威，其他試劑購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

儀器與設(shè)備：榨汁機(jī)，九陽股份有限公司出品；BAS224S電子天平和PB-10精密pH計(jì)，德國(guó)Sartorius出品；Primor高速離心機(jī)和MK3酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司出品；FreeZone2.5L冷凍干燥儀，美國(guó)Labconco出品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

藍(lán)莓用榨汁機(jī)打漿，分別精確稱取藍(lán)莓果漿10 g于燒杯中，采用超聲法，以酸水溶液為溶劑，分別考察酶種類(果膠酶、纖維素酶、混合酶、無酶)，超聲溫度(20、30、40、50、60 ℃)，酶量(0.33、0.67、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mg·g-1)，超聲時(shí)間(5、10、15、20、25 min)，料液比(0.20、0.25、0.33、0.50、1.00 g·mL-1)，pH(0.3、0.5、0.7、0.9、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0)等對(duì)花青素提取的影響，加入無水乙醇至相應(yīng)的乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)，繼續(xù)超聲攪拌10 min，提取液在4 500 r·min-1條件下離心10 min。過濾，濾液定容到50 mL，通過pH示差法測(cè)定花青素含量。

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過Minitab軟件的顯著因素篩選，按照3因素3水平進(jìn)行Box-Behnken中心試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.3 花青素含量測(cè)定

以矢車菊素-3-O-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，通過pH示差法測(cè)定花青素含量[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響

2.1.1 酶種類

花青素主要存在于藍(lán)莓果皮之中，簡(jiǎn)單的溶劑提取很難將花青素完全提取出來，而酶會(huì)降解藍(lán)莓果皮的細(xì)胞壁，使細(xì)胞中的花青素成分迅速擴(kuò)散到溶液中, 從而有效提高藍(lán)莓花青素的提取率[9]。圖1顯示，與無酶處理相比，酶解法明顯提高了花青素的含量，其中，果膠酶效果最好，纖維素酶次之，混合酶(果膠酶∶纖維素酶1∶1)效果最差。

混合酶為果膠酶∶纖維素酶1∶1。

2.1.2 酶量

以果膠酶進(jìn)行藍(lán)莓花青素提取，研究酶量對(duì)花青素含量的影響，結(jié)果如圖2所示。從圖中可知，花青素含量呈現(xiàn)出先增后降的變化趨勢(shì)，因此，選擇3.00 mg·g-1的酶量進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2 酶量對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

2.1.3 超聲溫度

超聲溫度對(duì)花青素穩(wěn)定性、提取率及果膠酶活性都有影響。本研究考察了不同溫度對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響(圖3)，結(jié)果表明，藍(lán)莓花青素的含量隨溫度的降低而增加，說明在酶解和超聲輔助提取時(shí)，20 ℃即可有效提取花青素。研究[6,10]表明，長(zhǎng)時(shí)間處在熱溶劑中，容易造成花青素等活性成分降解和生理活性降低，超聲波輔助提取實(shí)現(xiàn)了低溫條件下活性物的提取，是一種非常有效的提取方法。

圖3 超聲溫度對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

2.1.4 料液比

考察了料液比對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響，結(jié)果如圖4所示。隨著料液比降低，花青素含量呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，料液比0.50 g·mL-1時(shí)含量最高。

圖4 料液比對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

2.1.5 超聲時(shí)間

在超聲過程中，超聲波會(huì)產(chǎn)生一定的空化效應(yīng)和熱效應(yīng)，使細(xì)胞壁更快破碎，加快花青素的釋放和溶解，從而提高花青素的提取率。但如果提取時(shí)間過長(zhǎng)，花青素的結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生一定程度的變化，導(dǎo)致提取率降低[11]。本研究考察了超聲提取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響(圖5)，隨著超聲時(shí)間的增加，藍(lán)莓花青素的含量逐漸降低，這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，花青素的結(jié)構(gòu)因?yàn)槌暥l(fā)生改變，從而降低了花青素含量。超聲提取時(shí)間5 min時(shí)含量最高。

圖5 超聲時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

2.1.6 pH

花青素在中性和弱堿性溶液中不穩(wěn)定，在pH大于6的堿性環(huán)境中易降解，生成活性較低的酚類和醛類，而在酸性條件下穩(wěn)定性較好[12]。同時(shí)，酸性溶劑能破壞植物細(xì)胞膜，使水溶性色素更好地溶解，有利于花青素的提取。圖6結(jié)果表明，隨著pH的增加，藍(lán)莓花青素含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，在pH 0.5時(shí)藍(lán)莓花青素含量達(dá)最高點(diǎn)，因此，以pH 0.5進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖6 pH對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

2.1.7 乙醇體積分?jǐn)?shù)

藍(lán)莓花青素是水溶性黃酮，常用的提取溶劑為酸化乙醇、甲醇、丙酮等強(qiáng)極性溶劑或它們的混合溶劑[13]。圖7表明，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的提高，藍(lán)莓花青素含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，含量最高點(diǎn)在乙醇體積分?jǐn)?shù)50%處，此后隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，花青素提取率逐漸降低，因此，以乙醇體積分?jǐn)?shù)50%進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定顯著影響因素

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定藍(lán)莓花青素提取的初步條件：使用果膠酶，pH(A因素)0.5，超聲溫度(B因素)20 ℃，超聲時(shí)間(C因素)5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)(D因素)50%，料液比(E因素)0.5 g·mL-1，酶量(F因素)3.0 mg·g-1。為確定顯著影響因素，選用12個(gè)處理組合的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，來考察A、B、C、D、E、F因素-1、1水平對(duì)花青素含量的影響，結(jié)果如表1所示。

應(yīng)用Minitab軟件對(duì)表1數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、擬合，結(jié)果模型的F值為6.10，表明模型的擬合顯著性好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)各因素P值(表2)確定對(duì)藍(lán)莓花青素提取率的顯著影響因素為pH、料液比和酶量。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

2.2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定因素水平

通過Plackett-Burman試驗(yàn)得出影響藍(lán)莓花青素含量的顯著因素后，需要通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝參數(shù)。根據(jù)表2中A、E、F因素的系數(shù)項(xiàng)效應(yīng)可知，pH、料液比為負(fù)效應(yīng)，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)應(yīng)當(dāng)依次減?。幻噶繛檎?yīng)，在設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案時(shí)應(yīng)當(dāng)依次增大。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，隨著pH、料液比的不斷減小和酶量的不斷增加，藍(lán)莓花青素含量呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)pH為0.3，料液比0.3 g·mL-1，酶量為4.33 mg·g-1時(shí)，花青素含量達(dá)到最大值(0.506 mg·g-1)。因此，以處理組合8作為中心值進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素效應(yīng)

表3 最陡爬坡路徑試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

2.2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

通過最陡爬坡路徑法確定3個(gè)顯著影響因子之后，以pH為0.3，料液比為0.3 g·mL-1，酶量為4.33 mg·g-1作為試驗(yàn)中的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化藍(lán)莓花青素提取工藝。其中，Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

應(yīng)用Minitab軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析、擬合，結(jié)果二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2=97.14%，表明僅有2.86%的變異不能由此模型解釋?；貧w模型的F值為26.45，表明模型的擬合顯著性好，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。失擬因素的F值為0.31，表明失擬不顯著，即可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

對(duì)試驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行二階回歸模擬，得到回歸方程：花青素含量=-4.584 81-2.125 39A+3.087 21F-5.490 75E+0.784 09AF-5.25AE+2.413 64FE-0.233 25A2-0.480 56F2-7.715 75E2。

此外，從回歸方程的方差分析可以看出，料液比的一次項(xiàng)影響極顯著(F=40.58**)，pH、酶量的一次項(xiàng)影響不顯著。這表明料液比對(duì)花青素含量有較大影響；pH、酶量的變化對(duì)花青素含量也有影響，但相對(duì)料液比而言并不顯著。模型的響應(yīng)面圖及其等高線圖如圖8所示。

圖8 Box-Behnken設(shè)計(jì)藍(lán)莓花青素提取的響應(yīng)面

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

由軟件分析可知，pH 0.5、酶量4.13 mg·g-1、料液比0.15 g·mL-1時(shí)預(yù)測(cè)花青素含量最大，為0.578 mg·g-1。

為證實(shí)模型預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，在該條件下進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，實(shí)際檢測(cè)花青素含量為0.606 mg·g-1，與理論值相比，相對(duì)偏差為4.84%，重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果說明，可利用回歸方程對(duì)提取結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)。

3 小結(jié)

本研究通過單因素試驗(yàn)，分析各因素對(duì)藍(lán)莓花青素含量的影響；在此基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)確定影響藍(lán)莓花青素含量的3個(gè)顯著因素(pH、料液比和酶量)，通過最陡爬坡試驗(yàn)得出3個(gè)因子的最大響應(yīng)值區(qū)域；最后，通過Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)面得出最優(yōu)提取工藝：使用果膠酶，提取液pH 0.5，超聲溫度20 ℃，超聲時(shí)間5 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，料液比0.15 g·mL-1，酶量4.13 mg·g-1。

在最優(yōu)提取工藝條件下，實(shí)際測(cè)得花青素含量為0.606 mg·g-1，優(yōu)化結(jié)果與實(shí)際提取結(jié)果相對(duì)偏差為4.84%。