林媚， 何風(fēng)杰， 徐小菊， 馮先桔， 王天玉， 姚周麟

(1.浙江省柑橘研究所，浙江 臺(tái)州 318026； 2.臺(tái)州市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 臺(tái)州 318000；3.溫嶺市農(nóng)業(yè)農(nóng)村和水利局，浙江 臺(tái)州 317500)

葡萄為我國(guó)的主產(chǎn)水果之一，味美可口，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。2016年全國(guó)葡萄總產(chǎn)量達(dá)1 374.5×104t，較2000年增加4.2倍[1]。我國(guó)的葡萄品種豐富，以歐美葡萄(巨峰、夏黑等)和歐亞葡萄(紅地球、無(wú)核白、玫瑰香、維多利亞等)占比最多，近幾年，一些新品種(陽(yáng)光玫瑰、金手指等)也獲得大面積發(fā)展[2]。2018年浙江溫嶺葡萄種植面積達(dá)4 000 hm2，主栽品種為維多利亞，因該品種比較古老，同時(shí)生產(chǎn)過(guò)程中存在農(nóng)戶片面追求產(chǎn)量、栽培措施不到位等問(wèn)題，導(dǎo)致葡萄品質(zhì)下降，價(jià)格下滑，效益不佳。為改變現(xiàn)狀，適應(yīng)市場(chǎng)的需求，通過(guò)引種新品種晨香進(jìn)行結(jié)構(gòu)調(diào)整，以提高農(nóng)民收益[3]。

果樹(shù)生產(chǎn)過(guò)程中有機(jī)肥的應(yīng)用較多，有機(jī)肥具有肥效長(zhǎng)、補(bǔ)充土壤肥力等優(yōu)點(diǎn)[4]。近年有關(guān)施用有機(jī)肥對(duì)葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)影響的相關(guān)研究較多[5-7]，合理施用有機(jī)肥有助于提高葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的有機(jī)肥來(lái)源廣泛，種類很多，常用的有羊糞、豬糞、雞糞、碳基生物肥、菜餅肥、生物菌肥、腐殖酸等，也有一些新型的有機(jī)復(fù)混肥在不斷開(kāi)發(fā)應(yīng)用[8]。魚(yú)肥是一種由菜餅肥、谷殼及魚(yú)罐頭深加工的固廢物按一定比例配制后腐熟而成的有機(jī)肥，目前在臺(tái)州沿海各地逐步推廣應(yīng)用，在改土提質(zhì)上效果明顯。

果實(shí)品質(zhì)是決定市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素。關(guān)于葡萄的品質(zhì)研究主要為單粒重、穗重、可溶性固形物、總酸和維生素等[9]，還有少數(shù)關(guān)于葡萄果實(shí)中氨基酸含量方面的研究報(bào)道[10-11]。氨基酸作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被人體吸收利用，是葡萄品質(zhì)的重要組成部分，同時(shí)參與果實(shí)其他組分的形成及風(fēng)味物質(zhì)的合成[12]，其存在形式主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)2種形式[13]。結(jié)合態(tài)氨基酸在食用過(guò)程中不能立即水解，對(duì)滋味影響不大；游離氨基酸是一類重要的味道活性成分[14-15]，可呈現(xiàn)各種獨(dú)特的滋味，其含量會(huì)直接影響風(fēng)味[16-18]。同時(shí)，果實(shí)中氨基酸的含量和種類對(duì)果實(shí)品質(zhì)有重要影響，可作為評(píng)價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)。因此，葡萄中的氨基酸特別是呈味氨基酸對(duì)果實(shí)的滋味具有重要貢獻(xiàn)[19]。同時(shí)，葡萄中氨基酸的含量會(huì)受品種、氣候、種植條件等因素的影響。因此，研究氨基酸組分含量對(duì)提高葡萄品質(zhì)具有重要意義[20]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)葡萄品種維多利亞和新引種的3年生貝達(dá)砧的晨香葡萄為供試品種。試驗(yàn)于2020年在溫嶺市陳菊蓮家庭農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行，亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，氣候溫和，溫濕適中，雨量充沛，光照適宜，無(wú)霜期約250 d。土壤pH 5.82，為自培土(土壤∶有機(jī)質(zhì)∶有機(jī)物1∶1∶1)。采用鋼架大棚、寬行起壟，H形架式種植，株行距為3.4 m×3.0 m，南北行向。采用雙頂膜覆蓋促早栽培，覆膜時(shí)間為2019年12月20日。

復(fù)合肥含N 15%、P2O515%、K2O 15%(湖北三寧化工)；魚(yú)肥為溫嶺本地自產(chǎn)，以水產(chǎn)品深加工中無(wú)法收回的魚(yú)肉等雜質(zhì)為主要原料，與谷殼或蘑菇泥等生物質(zhì)混合，在其中添加生物菌種，經(jīng)過(guò)10 d左右的高溫發(fā)酵而成。

儀器與試劑：RIGOL L3000高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技)；C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm；賽分Amethyst)；Thermo Micro CL 17R高速冷凍離心機(jī)(賽默飛世爾科技)；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；PAL-1數(shù)字手持折糖儀(日本愛(ài)拓公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；AR1502CN電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；旋渦混合器MS3(德國(guó)IKA公司)。

天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、蘇氨酸(Thr)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、胱氨酸(Cys)、纈氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、異亮氨酸(Ile)、賴氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、色氨酸(Trp)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)共18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma，純度≥99.9%)；HPLC級(jí)乙腈(J&K CHEMICAL LTD，純度≥99.9%)；正亮氨酸，三乙胺(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99.0%，優(yōu)級(jí)純)；異硫氰酸苯酯(Sigma，純度≥99.9%)；正己烷(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥97.0%，優(yōu)級(jí)純)；無(wú)水乙酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99%，優(yōu)級(jí)純)；鹽酸(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，36.0%～38.0%，優(yōu)級(jí)純)；冰醋酸(生工，純度≥98%)。

1.2 處理設(shè)計(jì)

以正常施用的復(fù)合肥為對(duì)照(CK)，以增施當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的魚(yú)肥為處理，對(duì)維多利亞和晨香成熟果實(shí)的品質(zhì)指標(biāo)及游離氨基酸各組分含量進(jìn)行檢測(cè)分析，再結(jié)合味道強(qiáng)度值(taste active value，TAV)分析各組分對(duì)風(fēng)味的影響，最終對(duì)施肥前后葡萄果實(shí)各指標(biāo)的變化進(jìn)行綜合評(píng)估。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目與方法

1.3.1 理化品質(zhì)指標(biāo)

隨機(jī)選取100粒果實(shí)用于測(cè)定果粒質(zhì)量，以及可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)含量，重復(fù)3次。果粒質(zhì)量采用電子天平測(cè)量；TSS含量用數(shù)顯手持糖度計(jì)測(cè)量；TA含量使用酸堿滴定法測(cè)定；固酸比為TSS與TA的比值。

1.3.2 游離氨基酸

參考衛(wèi)陽(yáng)飛等[21]的方法，略作改進(jìn)。隨機(jī)稱取葡萄樣品約300 g，去除果皮和種子，將果肉勻漿，取適量果汁離心，取上清液200 μL，分別置于2 mL EP管中，每個(gè)離心管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)液20 μL；再依次向每個(gè)EP管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL(確保pH>7)和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混勻后于25 ℃下放置1 h，然后加入正己烷400 μL至每個(gè)EP管中，搖晃后放置10 min，取下層溶液，采用0.22 μm針式過(guò)濾器過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

分離柱為賽分Amethyst C18-H(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254 nm，柱溫40 ℃，流速1 mL·min-1，進(jìn)樣體積10 μL。洗脫液A為乙酸鈉-乙腈溶液，B為80%乙腈水溶液，采用梯度洗脫，根據(jù)外標(biāo)和保留時(shí)間進(jìn)行氨基酸定性和定量測(cè)定，每樣品重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用Duncan’s法進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)，采用Excel 2017軟件制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 魚(yú)肥對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響

由表1可見(jiàn)，施用魚(yú)肥后，2種葡萄的單粒重均有顯著降低，晨香和維多利亞分別較CK下降4.81%和5.79%；晨香和維多利亞的可溶性固形物含量(TSS)顯著高于CK，分別較CK增加12.27%和32.67%；可滴定酸(TA)含量在2個(gè)品種上表現(xiàn)不一致，施用魚(yú)肥后，晨香的TA含量顯著低于CK，而維多利亞的TA含量與CK差異不顯著。

表1 施用魚(yú)肥對(duì)葡萄果實(shí)品質(zhì)的影響

生產(chǎn)上常以固酸比作為果實(shí)風(fēng)味的評(píng)價(jià)指標(biāo)。施用魚(yú)肥后，晨香和維多利亞的固酸比均顯著高于CK，分別提高51.93%和22.22%。綜合來(lái)看，雖然施魚(yú)肥后果實(shí)單粒重有所降低，但TSS含量和固酸比顯著提高，果實(shí)口味等綜合品質(zhì)得到顯著提升。

2.2 魚(yú)肥對(duì)葡萄果實(shí)游離氨基酸的影響

表2顯示了2種葡萄果實(shí)的18種游離氨基酸(FAA)組分檢測(cè)結(jié)果，包括8種必需氨基酸(EAA)、2種半必需氨基酸(CEAA)和8種非必需氨基酸(NEAA)。藥效氨基酸(MAA)則是通過(guò)氨基酸具有藥用功效進(jìn)行分類[22]。由表可見(jiàn)，施用魚(yú)肥前2種葡萄的總游離氨基酸(TFAA)含量整體較低，而施肥后TFAA的含量均顯著增加，晨香和維多利亞果實(shí)的TFAA含量分別較CK增加116.49%和220.15%。NEAA、CEAA、MAA含量均表現(xiàn)為施用魚(yú)肥后顯著增加，其中，晨香葡萄分別較CK增加41.07%、306.99%、190.38%，維多利亞則分別增加79.42%、376.60%、314.61%，且2個(gè)品種均以CEAA增幅最大，MAA次之。2種葡萄的必需氨基酸(EAA)含量很低，且試驗(yàn)效果不一致，晨香顯著降低，維多利亞顯著增加。

表2 魚(yú)肥對(duì)葡萄中游離氨基酸組分含量的影響 單位：mg·L-1

比較EAA、NEAA、CEAA及MAA在TFAA中的比例顯示，2種葡萄在施肥前后的EAA/TFAA、NEAA/TFAA均顯著下降，盡管2個(gè)品種的NEAA值較CK顯著增加，但由于施用魚(yú)肥的TFAA較CK增幅更大，造成NEAA/TFAA最終較CK下降；CEAA/TFAA和MAA/TFAA均顯著增加，其中，晨香較CK分別增加29.73和18.01百分點(diǎn)，維多利亞分別增加23.33和17.19百分點(diǎn)。由上可知，增施魚(yú)肥后，2個(gè)葡萄品種的TFAA、NEAA、CEAA、MAA以及CEAA/TFAA、MAA/TFAA均為增加。

2.3 果實(shí)游離氨基酸各組分含量的比較

由表2可見(jiàn)，晨香葡萄CK果實(shí)的18種FAA各組分含量排序?yàn)锳rg>Ala>Glu>His>Ser>Pro>Asp>Thr>Ile>Phe>Leu>Val>Tyr>Trp>Met>Lys>Gly>Cys，含量最高Arg為150.05 mg·L-1，相對(duì)較高的為Ala和Glu，分別為54.81和46.19 mg·L-1，Thr、Asp、Pro、Ser、His幾種含量為39.21～44.46 mg·L-1，其余均處于較低或極低水平；而該品種對(duì)應(yīng)的處理果的游離氨基酸各組分含量排序?yàn)锳rg>Pro>Ala>Asp>Thr>Ser>Glu>His>Ile>Val>Leu>Phe>Tyr>Gly>Trp>Lys>Cys>Met，最高為Arg，達(dá)766.45 mg·L-1，較對(duì)照增加410.80%，Arg/TFAA為61.48%，第二和第三的為Pro和Ala，分別較對(duì)照增加268.10%和32.37%。維多利亞葡萄中，CK果實(shí)游離氨基酸各組分含量排序?yàn)锳rg>Pro>Ala>Asp>Ile>Thr>His>Ser>Phe>Val>Leu>Glu>Gly>Tyr>Trp>Cys>Lys>Met，而其處理果含量排序?yàn)锳rg>Ala>Pro>Ser>Thr>Asp>His>Ile>Phe>Val>Leu>Glu>Tyr>Gly>Trp>Lys>Met>Cys，其中Arg、Ala和Pro分別較對(duì)照增加401.54%、97.28%、46.24%，且處理果中Arg/TFAA高達(dá)68.89%。另外，維多利亞葡萄處理果中含量相對(duì)較高的還有Ser，較對(duì)照果增加269.10%?？傊?，2種葡萄的FAA組分以Arg為主，其次為Pro和Ala，均較CK顯著增加。

2.4 不同呈味氨基酸的比較分析

葡萄中檢測(cè)出的18種FAA均為呈味氨基酸，根據(jù)其呈味特點(diǎn)分為4類，主要為鮮味氨基酸(delicious amino acid，DAA)、甜味氨基酸(sweet amino acid，SAA)、苦味氨基酸(bitter amino acid，BAA)和芳香族氨基酸(Aromatic amino acid，AAA)[22]。其中，DAA包括Glu、Asp、Lys，SAA包括Thr、His、Ser、Pro、Gly、Ala，BAA包括Val、Met、Leu、Ile、Arg、Trp，AAA包括Cys、Tyr、Phe。

由圖1可見(jiàn)，無(wú)論是試驗(yàn)還是CK，2種葡萄各呈味氨基酸組分含量由高到低的排序?yàn)锽AA>SAA>DAA>AAA，且2種葡萄增施魚(yú)肥處理均以BAA增幅為最大，晨香和維多利亞分別較CK增加268.26%和335.11%。同時(shí)，SAA也較CK有明顯增加，晨香和維多利亞葡萄分別較CK增加43.94%和104.40%。DAA在2種葡萄處理中含量均較低，且變化趨勢(shì)不一致。其中，晨香處理較CK減少，而維多利亞則略有增加。AAA在2種葡萄呈味氨基酸中含量均為最低，最大值為晨香葡萄的CK，其變化趨勢(shì)與DAA一致。

圖1 葡萄各呈味氨基酸的比較

2.5 不同呈味氨基酸的TAV值比較

由于各類呈味氨基酸的味覺(jué)閾值不同，意味著當(dāng)某種氨基酸含量較高時(shí)，對(duì)果實(shí)的風(fēng)味不一定產(chǎn)生影響，故采用TAV值進(jìn)行判定，每種呈味氨基酸的TAV值為其含量測(cè)定值與對(duì)應(yīng)味覺(jué)閾值的比值。一般情況下，當(dāng)TAV>1時(shí)，表示該物質(zhì)對(duì)樣品的呈味有影響，數(shù)值越大影響越大；當(dāng)TAV<1時(shí)，則該物質(zhì)對(duì)呈味貢獻(xiàn)不大[23]。

對(duì)比2種葡萄的試驗(yàn)果和CK果中18種FAA TAV值與其味覺(jué)閾值，由表3可見(jiàn)，各呈味氨基酸的TAV值均較小，只有晨香和維多利亞試驗(yàn)果中呈苦味的Arg的TAV值分別為1.53和1.94，表示該類氨基酸對(duì)葡萄的呈味有影響，其余各氨基酸組分對(duì)呈味的影響不大。

表3 葡萄游離氨基酸的TAV值

3 小結(jié)與討論

葡萄生產(chǎn)中大量化肥的不當(dāng)使用及大棚設(shè)施栽培等會(huì)帶來(lái)果實(shí)品質(zhì)下降和土壤板結(jié)、養(yǎng)分失調(diào)、酸化、鹽漬化等諸多問(wèn)題[24]，為此，近年出現(xiàn)不少關(guān)于施用有機(jī)肥對(duì)葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)影響的相關(guān)研究報(bào)道。韓建等[5]認(rèn)為，有機(jī)肥可顯著增加葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，且隨著施用年份的增加，有機(jī)肥對(duì)葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的提升趨勢(shì)會(huì)越來(lái)越明顯；陳青英等[6]開(kāi)展施用不同有機(jī)肥對(duì)土壤特性及紅地球葡萄生長(zhǎng)和品質(zhì)的影響，試驗(yàn)表明，冬季基肥中增施不同的有機(jī)肥，可提高果實(shí)品質(zhì)，其中以施用菜餅肥的果實(shí)綜合品質(zhì)最高；范曉暉等[7]研究認(rèn)為，減施化肥、增施有機(jī)肥不僅使得葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)得到提高，還能有效減少土壤大量元素的累積。這些關(guān)于葡萄施用有機(jī)肥的研究結(jié)果基本認(rèn)為有機(jī)肥的合理施用會(huì)有效增加土壤有機(jī)質(zhì)含量，緩解土壤板結(jié)及酸化，改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高肥料的利用率，使得果園土壤養(yǎng)分更加豐富，有助于提高葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究選擇當(dāng)?shù)赜写硇缘木S多利亞葡萄和新引種的晨香葡萄2個(gè)品種，研究冬季基肥施入本地生產(chǎn)的魚(yú)肥對(duì)葡萄品質(zhì)的影響。結(jié)果表明，2個(gè)品種的單粒果重均有所下降，但品質(zhì)指標(biāo)中可溶性固形物含量分別增加12.27%和32.67%，固酸比分別增加51.93%和22.22%，且差異顯著，綜合理化品質(zhì)明顯提高。

游離氨基酸作為人體維生素E、葉酸等營(yíng)養(yǎng)素的良好來(lái)源[25]，也是果實(shí)中重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的合成前體[26]，葡萄中氨基酸含量占總氮量的30%～40%[27]，游離氨基酸特別是呈味氨基酸對(duì)果實(shí)的滋味具有重要貢獻(xiàn)[19]。本試驗(yàn)中，晨香和維多利亞葡萄對(duì)照果的總游離氨基酸含量分別為575.81和439.24 mg·L-1，低于黃艷[28]研究的3個(gè)葡萄品種中含量最低的紅玫瑰葡萄；而施用魚(yú)肥后總游離氨基酸分別達(dá)到1 246.57和1 406.24 mg·L-1，較對(duì)照增加116.49%和220.15%，說(shuō)明可通過(guò)施肥的改變調(diào)控葡萄中游離氨基酸含量。Jogaiah等[29]研究認(rèn)為，Arg和Pro是所有鮮食和釀酒葡萄中的主要氨基酸，Bell等[30]也認(rèn)為，Arg是葡萄中的含量最高氨基酸，其次是Pro和Leu，且Arg是氮的主要儲(chǔ)存形式。本研究的結(jié)果為2種葡萄的試驗(yàn)果及CK果的Arg為各組分氨基酸中含量最高，且2種葡萄經(jīng)施魚(yú)肥后Arg大幅增加，分別為18種游離氨基酸總量的61.48%和68.89%。同時(shí)，含量相對(duì)較高的還有Pro和Ala，該研究結(jié)果與前人結(jié)論[29-30]相一致。對(duì)于游離氨基酸對(duì)食品風(fēng)味的影響，目前較多采用TAV值進(jìn)行判斷[22,31-32]。本研究結(jié)果顯示，只有晨香和維多利亞試驗(yàn)果中呈苦味的Arg的TAV值>1，說(shuō)明其對(duì)葡萄的風(fēng)味有貢獻(xiàn)。作為兒童必需氨基酸的Arg呈苦味，有助于增加呈味復(fù)雜性和提高鮮度[28,32]。另外，對(duì)柑橘中的苦味物質(zhì)風(fēng)味的相關(guān)研究[33-34]表明，少量苦味能賦予特定的風(fēng)味，使果汁風(fēng)味品質(zhì)更好?；谏鲜鲅芯坷碚?，結(jié)合Arg的呈味特點(diǎn)及其對(duì)葡萄的風(fēng)味影響，可以解釋在對(duì)這2種葡萄進(jìn)行口感評(píng)價(jià)時(shí)，增施魚(yú)肥的試驗(yàn)果除了較對(duì)照糖度高外，還會(huì)略帶鮮味，且口感風(fēng)味更好。

本研究結(jié)果表明，施用魚(yú)肥可以顯著提高晨香和維多利亞葡萄的可溶性固形物含量、固酸比、游離氨基酸總量，以及精氨酸、脯氨酸等組分，其中試驗(yàn)果的精氨酸對(duì)果實(shí)風(fēng)味有貢獻(xiàn)，使果實(shí)綜合品質(zhì)得以提高，風(fēng)味更好，值得在沿海地區(qū)推廣應(yīng)用。