章建紅， 沈登鋒， 洪春桃， 焦云， 魏斌， 潘存德

(1.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 林業(yè)研究所，浙江 寧波 315040； 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與園藝學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

光合作用是所有植物生存生長的基礎(chǔ)。高鹽環(huán)境會(huì)影響植物光合作用的正常進(jìn)行，主要表現(xiàn)為氣孔抑制與非氣孔因素抑制，一般表現(xiàn)為植物在鹽脅迫環(huán)境中的葉片胞間二氧化碳濃度升高，并通過調(diào)節(jié)氣孔開度以降低其CO2濃度。槲櫟在鹽脅迫環(huán)境中光合作用受限，主要與氣孔抑制有關(guān)[1]；枸杞受到鹽脅迫后，短期內(nèi)光合作用受限是由于氣孔因素導(dǎo)致，長期鹽脅迫致使光合作用能力下降則為非氣孔因素所導(dǎo)致[2]；這一結(jié)果與對(duì)海濱錦葵的研究結(jié)果一致[3]；張會(huì)慧等[4]發(fā)現(xiàn)，桑樹在鹽脅迫下其葉黃素循環(huán)受到抑制，PSⅡ反應(yīng)中心正常功能受影響導(dǎo)致光合作用的下降。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)研究表明，鹽環(huán)境下植物的電子傳遞效率[5]和PSⅡ活性[6]同樣受到影響。然而，不同植物或相同植物在不同生理時(shí)期和試驗(yàn)環(huán)境下的光合作用受影響的程度有一定差異。薄殼山核桃原產(chǎn)于北美，目前在我國廣泛種植[7]，但薄殼山核桃Pawnee在鹽脅迫下的抗性表現(xiàn)還不是很清楚。本研究以一年生薄殼山核桃Pawnee幼苗為試驗(yàn)材料，采用水培法比較不同濃度的NaCl對(duì)其葉綠素含量、光合特性及葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響，探討薄殼山核桃Pawnee耐鹽性的生理機(jī)制，以期為健全薄殼山核桃濱海地區(qū)鹽堿地栽培技術(shù)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以一年生薄殼山核桃品種Pawnee容器苗為供試材料，試驗(yàn)于2019年4—11月在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)業(yè)高新技術(shù)園區(qū)溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。

1.2 處理設(shè)計(jì)

配置不同濃度水平的NaCl溶液(0、0.3%、0.6%、0.9%)對(duì)一年生薄殼山核桃Pawnee的容器苗進(jìn)行鹽脅迫處理，視干濕情況每隔2～5 d澆1次NaCl溶液，每次澆NaCl溶液定量為1.5倍容器的容量，重復(fù)3次，每處理含30株幼苗，按0、1、10、30、45、75、105 d處理時(shí)間點(diǎn)采集葉片樣品用于后續(xù)檢測分析。

1.3 觀察和測定

1.3.1 葉綠素含量

每處理組分別從5個(gè)以上植株隨機(jī)剪取1張葉片(頂部開始往下第三輪全功能葉)作為1個(gè)樣品，重復(fù)3次。將采回的新鮮葉片剔除中脈剪碎混勻，稱取0.2 g樣品浸泡于5 mL 95%乙醇中，室溫暗環(huán)境放置48 h后(至葉片完全發(fā)白)，對(duì)樣品進(jìn)行短暫離心，棄去管底部的葉片殘?jiān)Ａ羯锨逡?。用紫外可見分光光度?jì)(UV-1800PC，Mapada，Shanghai)并參照相關(guān)文獻(xiàn)中的方法[8]，測定葉片中葉綠素和類胡蘿卜素含量。

1.3.2 光合作用與葉綠素?zé)晒鈪?shù)

每處理固定2個(gè)植株，不作其他采樣處理，對(duì)其相同部位的全功能葉片，使用便攜式光合測定系統(tǒng)(LI 6400XT，USA)，CO2濃度為400 μmol·mol-1，光照強(qiáng)度設(shè)置為1 000 μmol·m-2·s-1，參考Wang等[9]方法測定光合作用參數(shù)，測定在上午8:30—11:30進(jìn)行，每處理重復(fù)測6次。同時(shí)，葉綠素?zé)晒鈪?shù)采用PAM-2500便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，Germany)，測定前用夾子夾住葉片，暗適應(yīng)處理30 min，參照高麗麗等[10]方法測定有關(guān)參數(shù)，每處理重復(fù)測定6次。

1.3.3 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

取不同處理組植株葉片的相同部位(避開葉脈位置)，用去離子水沖洗干凈后，將葉片切成2 mm見方的小塊，置于磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)配制的2.5%戊二醛離心管中，抽真空使葉片沉于戊二醛底部，放在4 ℃下固定過夜。小心吸出戊二醛，用1.0 mL磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)對(duì)樣品進(jìn)行漂洗，每次15 min，重復(fù)3次。棄去漂洗液，在通風(fēng)櫥環(huán)境中加入1.0 mL由磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)配制的1%鋨酸，對(duì)樣品固定2 h；棄去鋨酸溶液，加入1 mL磷酸緩沖液(0.1 mmol·L-1，pH 7.0)對(duì)樣品漂洗，每次30 min，重復(fù)4次。再參照Guo等[11]的方法，用透射電鏡(Hitachi H-7650，Japan)觀察葉綠體的超微結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均匯總至Excel 2016，并利用DPS v 14.10軟件[12]對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用鄧肯新復(fù)極差檢驗(yàn)法進(jìn)行多重比較，在α=0.05水平進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，使用OriginPro軟件2021版繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量

如圖1所示，與CK相比，0.3%NaCl處理的總?cè)~綠素含量呈先下降后上升再下降的趨勢，在處理30 d時(shí)總?cè)~綠素含量開始高于CK，且在45 d時(shí)達(dá)到最大值，隨后又開始逐漸降低并顯著的低于CK；而對(duì)于0.6%NaCl處理，總?cè)~綠素含量趨勢上先上升而后下降，在處理1 d后總含量迅速上升并超過CK，約為CK的1.2倍，隨后開始隨著處理時(shí)間的延長而逐漸慢慢降低，并顯著低于CK。對(duì)于0.9%NaCl處理，在處理1 d后總?cè)~綠素含量便顯著低于CK，并隨著處理時(shí)間的延長逐漸降低，并始終低于CK。

同天數(shù)比較柱上無相同小寫字母者表示組間差異顯著(P<0.05)。圖2～3同。

此外，不同處理組中葉綠素a、b含量的變化與總?cè)~綠素含量的變化趨勢是類似的，同時(shí)，與CK相比，0.3%和0.6%NaCl處理的葉綠素a/b比值在處理前30 d差異不顯著，而之后顯著低于CK，而0.9%NaCl處理在10 d差異不顯著，之后顯著低于CK(表1)。NaCl處理下的胡蘿卜素含量隨處理時(shí)間的增加而逐漸的低于CK。由此可見，短期內(nèi)低濃度水平(0.3%NaCl)處理可能使植株葉綠素的含量有所增加，但長期處理下3種濃度水平的NaCl處理均會(huì)導(dǎo)致葉綠素含量的降低。

表1 不同濃度NaCl處理下葉片中葉綠素a/b比值

2.2 光合參數(shù)

如圖2所示，與CK相比，0.3%NaCl處理的凈光合速率(Pn)呈先下降后上升再下降的趨勢，在處理前30 d，Pn值持續(xù)下降，而后Pn值開始回升，至處理45 d時(shí)達(dá)到峰值，并達(dá)到近似CK的水平，且一直持續(xù)到75 d，其Pn值一直與CK無顯著差異。對(duì)于0.9%NaCl處理，其Pn值隨著處理時(shí)間的延長呈下降趨勢，但前期降幅較為緩和，在處理30 d時(shí)降為CK的83%，之后降幅迅速增加，到45 d時(shí)僅有1.49 μmol·m-2·s-1。由此表明，薄殼山核桃幼苗在0.3%NaCl短期處理下，光合作用會(huì)呈現(xiàn)一定的適應(yīng)性，但3種濃度的NaCl長期處理均會(huì)使得Pn值降低，且降幅隨著處理濃度和時(shí)間的延長而增加。此外，0.6%NaCl處理的細(xì)胞間隙CO2濃度(Ci)在處理1 d 后，增長為CK的1.61倍，并在后期處理中一直顯著高于CK。而0.9%NaCl處理在1 d后增長為CK的1.35倍，并隨著處理時(shí)間的延長而一直增長，在處理45 d時(shí)增長為CK的1.77倍，這意味著高水平鹽濃度(0.6%和0.9%)處理下會(huì)使薄殼山核桃葉片的Ci值顯著增加。同此，0.9%NaCl處理的蒸騰速率(Tr)值在處理1 d后便增長為CK的1.11倍，在處理10 d后達(dá)到峰值，為CK的1.43倍，直到鹽處理后期(植株發(fā)生萎蔫時(shí))才低于CK。這表明鹽脅迫會(huì)顯著影響薄殼山核桃的蒸騰速率，尤其是高鹽濃度顯著加劇了蒸騰速率。值得注意的是，0.9%NaCl處理的氣孔導(dǎo)度(Gs)在處理1 d后就上升為CK的1.24倍，并一直保持高于CK，而該組中各數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差較大，意味著高鹽濃度下可能會(huì)由于離子平衡的紊亂使得薄殼山核桃氣孔導(dǎo)度增加，且氣孔開張的波動(dòng)性較大。

圖2 不同濃度NaCl處理對(duì)葉片光合作用的影響

2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

由圖3可知，0.3%NaCl處理在前45 d，其PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)的值與CK無明顯差異，在處理75 d時(shí)略微超過CK，但在處理105 d時(shí)降為CK的94%，這意味著該濃度水平鹽脅迫對(duì)薄殼山核桃PSⅡ的活性影響較小。而高鹽濃度水平(0.6%、0.9%)處理會(huì)迅速減弱PSⅡ的活性，但在處理后期，F(xiàn)v/Fm又可恢復(fù)到正常水平，暗示著PSⅡ在該濃度下(0.6%、0.9%)受到的損傷是可逆的。類似的，0.6%和0.9%NaCl處理的非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ值)均呈先下降后上升的趨勢，在處理前10 d均低于CK，而處理30 d后NPQ值迅速上升，并顯著高于CK，并一直持續(xù)到鹽處理后期，這意味著植株以熱耗散形式散失的能量增多，減輕了PSⅡ光抑制程度，同時(shí)減緩了光合系統(tǒng)的損傷，可能是薄殼山核桃應(yīng)對(duì)鹽脅迫的一種保護(hù)機(jī)制。此外，在0.3%和0.6%NaCl處理的前期，通過降低光化學(xué)猝滅系數(shù)(qP值)，減小PSⅡ的開放程度，降低光合速率，而處理后期通過qP值的升高增加PSⅡ的開放程度，進(jìn)而減緩了光合速率的下降。

圖3 不同濃度NaCl處理對(duì)葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.4 葉綠體超微結(jié)構(gòu)

利用透射電鏡對(duì)不同濃度NaCl處理10 d的葉片進(jìn)行切片觀察。圖4顯示，CK的葉綠體呈長橢圓形或橄欖球形，球體飽滿，類囊體片層整齊，層數(shù)多，排列緊密，淀粉粒飽滿積累在葉綠體中，葉綠體被膜清晰；0.3%NaCl處理下類囊體片層排列雖整齊緊密，但葉綠體膜已開始出現(xiàn)與細(xì)胞壁分離，葉綠體膜與細(xì)胞壁之間出現(xiàn)空隙；0.6%NaCl處理下葉綠體萎縮與細(xì)胞壁分離，類囊體片層排列不整齊、松散；0.9%NaCl處理下葉綠體扭曲呈扁圓形或球形，類囊體片層排列不整齊、稀疏。由此可見，不同濃度的NaCl處理均對(duì)葉綠體的結(jié)構(gòu)造成一定程度的損壞，且受損程度隨著NaCl濃度水平的增加而變得嚴(yán)重。

A、B、C、D分別為CK、0.3%NaCl、0.6% NaCl、0.9%NaCl處理，各處理中的左右圖比例尺分別為2μm和1μm。1～8分別為中央大葉泡、細(xì)胞核、葉綠體、類囊體片層、線粒體、淀粉粒、噬鋨顆粒和細(xì)胞壁。

3 小結(jié)與討論

鹽脅迫會(huì)對(duì)植物的光合作用造成一定的影響[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在0.6%和0.9%濃度處理下，薄殼山核桃Pawnee幼苗的Pn值整體上隨著處理時(shí)間的延長而逐漸降低；而在0.3%NaCl短期時(shí)間處理下Pn值呈現(xiàn)一定的上升趨勢并恢復(fù)到CK水平，光合作用會(huì)表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性，但在處理105 d時(shí)又低于CK，說明三種濃度的NaCl長期處理均會(huì)使得Pn值降低，且降低幅度隨著處理濃度與處理時(shí)間的延長而增加。此外，NaCl脅迫條件下，光合作用的下降主要由氣孔因素與非氣孔因素兩個(gè)原因所引起[15]。氣孔因素主要是通過Gs的降低或關(guān)閉而引起CO2的供應(yīng)不足，使光合速率下降，如低鹽濃度下擬南芥、小麥光合速率的下降可歸結(jié)于此類原因[16-17]。而非氣孔因素則是通過改變光系統(tǒng)及碳同化過程關(guān)鍵酶活性等影響光合作用，如一定鹽濃度下黃瓜、野生大豆光合作用的降低屬于此類原因[18-19]。鹽脅迫對(duì)光合作用的限制因素會(huì)隨著NaCl濃度的不同而改變。在0.3%、0.6%NaCl處理下，酸柚苗Pn下降的主要原因是氣孔限制，在0.9%NaCl處理下的Pn下降的主要原因是非氣孔因素[20]。與酸柚苗相似的是，薄殼山核桃Pawnee在0.3%NaCl處理下，其Pn、Ci和Gs的變化趨勢基本相同，說明在該濃度下，氣孔因素可能是限制其光合作用的主要因素。對(duì)于0.6%NaCl處理組，其Gs隨處理時(shí)間而變化的規(guī)律性不強(qiáng)，波動(dòng)性較大；而0.9%NaCl處理組的Ci和Gs整體上隨著處理時(shí)間的增加而增大，但Pn值卻呈下降趨勢，表明在高鹽濃度(0.6%和0.9%)下，可能通過非氣孔因素抑制其光合作用。

另外，葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，在光能吸收過程中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，葉片葉綠素含量也是反映植物生理狀態(tài)的重要指標(biāo)之一[21-22]。鹽脅迫條件下會(huì)使葉綠素發(fā)生降解，并降低植物光系統(tǒng)的活性[23-24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)低濃度水平NaCl處理會(huì)使植株的葉綠素含量有所增加，這可能是對(duì)NaCl脅迫的一種適應(yīng)性的表現(xiàn)，但長期處理下，3種濃度的NaCl處理依然會(huì)導(dǎo)致葉綠素含量發(fā)生不同程度的降低。因此，NaCl脅迫處理對(duì)薄殼山核桃PSⅡ的活性也造成一定影響。葉綠素?zé)晒鈗P值的變化表明，在0.3%和0.6%NaCl處理的前期，可能通過減小PSⅡ的開放程度，降低光合速率；在鹽脅迫處理后期，通過增加PSⅡ開放程度，可減緩光合速率的降低；0.9%NaCl則主要通過抑制qP值而減小PSⅡ的開放程度，降低光合速率。值得注意的是，在3種濃度NaCl處理的后期，F(xiàn)v/Fm值又可以恢復(fù)到正常水平，表明PSⅡ的最大光化學(xué)效率是可以恢復(fù)的，PSⅡ并未受到非可逆性的損傷。此外，前期研究結(jié)果表明，鹽脅迫會(huì)破壞葉綠體的結(jié)構(gòu)，損壞光系統(tǒng)活性中心，使電子運(yùn)輸速率和碳同化速率顯著降低，最終使植物的光合作用受到抑制[25-27]。本研究中透射電鏡結(jié)果表明，3種濃度水平的NaCl處理均損壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)，且受損程度隨著NaCl濃度的增加而更加嚴(yán)重，從而進(jìn)一步解釋了鹽脅迫造成薄殼山核桃葉片光合作用降低的原因。