賀有超 趙超 于穎 周美琪 趙磊飛 石鑫鑫 石晶靜 和玉婷 趙鑫 王瑞 王超

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)廣泛存在于植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜中[1]，其在植物生長(zhǎng)的各個(gè)方面如木質(zhì)部分化[2-3]、根莖種子的發(fā)育中起重要作用[4]。該蛋白由富含典型氨基酸Hyp/Pro、Ala、Ser、Thr的蛋白質(zhì)和多糖鏈組成，并且在碳端通常具有一個(gè)糖基磷酸肌醇錨(GPI錨)[5-6]。成束狀阿拉伯半乳糖蛋白(FLAs)作為一類與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖蛋白，是阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPS)的一個(gè)亞族，含有阿拉伯半乳糖糖基化區(qū)域和假定的成束域(FAS)，F(xiàn)LA屬于非經(jīng)典型，其中都包含1～2個(gè)類AGP糖化域和1～2個(gè)成束域。具體而言，該成束域具有2個(gè)由110～150個(gè)氨基酸組成的高度保守區(qū)域(H1和H2)，每個(gè)區(qū)域由大約10個(gè)氨基酸組成[7-9]，其定位于細(xì)胞表面，存在于細(xì)胞壁質(zhì)膜或胞外基質(zhì)中[10]，暗示了其在植物生長(zhǎng)發(fā)育中有很重要的作用。目前，已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、楊樹(Populustremula)、桉樹(EucalyptusrobustaSmith)、小麥(TriticumaestivumL.)、亞麻(LinumusitatissimumL.)、白菜(Spinaciaoleracea)等多個(gè)物種中鑒定出FLA基因的存在。

FLA基因可以在大多數(shù)被子植物的莖中高效特異性表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，在草本植物擬南芥fla11、fla12雙敲除突變體當(dāng)中，當(dāng)拉伸強(qiáng)度降低，纖維素、阿拉伯半乳糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)就會(huì)下降，而木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和微纖絲角增加[11]，說明擬南芥中的AtFLA11和AtFLA12參與了木質(zhì)部中次生壁的生長(zhǎng)。此外在百日草中，ZeFLA11在木質(zhì)部導(dǎo)管及周圍薄壁細(xì)胞中高表達(dá)，使得細(xì)胞次生壁增厚[12]。木本植物中，在歐洲山楊和桉樹的莖中發(fā)現(xiàn)FLA基因的高度特異性表達(dá)，使其纖維素沉積發(fā)生變化，進(jìn)而影響木材的質(zhì)量[13-14]。當(dāng)給予相思樹壓力刺激時(shí)，PopFLA1～PopFLA10的表達(dá)水平會(huì)隨之發(fā)生變化[15]。在胡楊中PtrFLA1、PtrFLA9、PtrFLA10、PtrFLA11、PtrFLA17、PtrFLA21、PtrFLA24、PtrFLA26、PtrFLA28在莖和分化木質(zhì)部中高表達(dá)，說明它們可能與莖的次生壁發(fā)育相關(guān)；在毛果楊中，將PtrFLA31和PtrFLA34敲除之后，其木質(zhì)部細(xì)胞發(fā)生變化[10]；而將PtrFLA6敲除后，莖的硬度降低，木質(zhì)部中纖維素和木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，參與細(xì)胞壁合成的基因下調(diào)[16]。在小黑楊中，F(xiàn)LAs蛋白在應(yīng)拉木中大量表達(dá)，而在對(duì)應(yīng)木中幾乎不表達(dá)[17]。綜上所述，F(xiàn)LA家族基因在細(xì)胞壁的次生生長(zhǎng)以至木質(zhì)部發(fā)育中起著重要作用。

應(yīng)拉木(TW)是木本雙子葉植物莖干彎曲組織中位于外側(cè)的木質(zhì)組織，它本質(zhì)上是由于外力作用，使細(xì)胞壁內(nèi)部產(chǎn)生一種具有膠質(zhì)纖維的膠質(zhì)層(簡(jiǎn)稱G層)，其主要成分為結(jié)晶纖維素，與正常木(NW)相比，它的出現(xiàn)取代了次生細(xì)胞壁的S3層。有研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)拉木中導(dǎo)管的數(shù)量和尺寸都明顯減少，而且纖維和導(dǎo)管都較長(zhǎng)，其最明顯和最顯著的特點(diǎn)是纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，從而細(xì)胞壁增厚，纖維細(xì)胞壁的木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降，在纖維細(xì)胞內(nèi)形成G層[10，18]。在應(yīng)拉木處理中位于內(nèi)側(cè)的稱之為對(duì)應(yīng)木(OW)，其特點(diǎn)是木質(zhì)纖維短，管胞呈圓形，細(xì)胞壁較厚。由于應(yīng)力木中木質(zhì)部性狀的改變，使之成為研究木質(zhì)部發(fā)育和細(xì)胞壁形成的一種有利系統(tǒng)。

山新楊(Populusdavidiana×P.albavar.pyramidalis)系以山楊(Populnsdavidiana)為母本，新疆楊(PopulusbolleanaLauche)為父本雜交得到的優(yōu)良樹種，生長(zhǎng)速度較快，適應(yīng)性強(qiáng)，抗逆性好，果序自然脫落不飛絮，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和觀賞價(jià)值[19]。本研究鑒定了11個(gè)山新楊FLA基因，并對(duì)它們進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，用熒光定量RT-PCR測(cè)定了這些基因在根、莖、葉以及應(yīng)拉木、對(duì)應(yīng)木和直立木中表達(dá)量的變化情況。以期鑒定調(diào)控山新楊次生木質(zhì)部發(fā)育和次生細(xì)胞壁形成的關(guān)鍵FLA基因，為利用分子生物學(xué)手段改良山新楊材性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)材料選自黑龍江省齊齊哈爾市富?？h繁育基地的山新楊(Populusdavidiana×P.bolleana)，選取生長(zhǎng)環(huán)境相同、形態(tài)特征相同的5年生同一無性系山新楊樹苗30棵。組織特異性表達(dá)分析材料培養(yǎng)于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室組織培養(yǎng)室，溫度為25 ℃，光照16 h/8 h黑暗，光照強(qiáng)度400 μmol·m-2·s-1。

1.1 山新楊FLA家族基因的獲取

在擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中查找FLA家族基因，利用BioEdit軟件與本地山新楊基因組氨基酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源比對(duì)，將得到的同源序列通過NCBI中的CD Search功能進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，最終確認(rèn)山新楊PdbFLA家族基因序列，并統(tǒng)計(jì)FAS結(jié)構(gòu)域數(shù)量。

1.2 FLA基因生物信息學(xué)分析

通過SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預(yù)測(cè)氮端是否有信號(hào)肽，用PredGPI(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/cgi-bin/predictors/gpi/gpipe_1.4.cgi)預(yù)測(cè)碳端是否有GPI錨，利用在線軟件SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)和軟件SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)分別預(yù)測(cè)FLA家族基因蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和高級(jí)結(jié)構(gòu)；利用軟件BioEdit對(duì)山新楊與毛果楊的FLA蛋白進(jìn)行比對(duì)分析；利用MEAG-X對(duì)FLAs蛋白進(jìn)行進(jìn)化分析。利用BioEdit查找山新楊基因組中與山新楊FLA家族基因的同源序列，在編碼區(qū)上游選取1 500 bp，在PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)中進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析。

1.3 應(yīng)拉木的處理方法

將處理組的樹苗全部朝同一方向彎曲，將樹干頂端部分用繩子和膠帶固定于相鄰樹苗上，使樹干部分傾斜45°，應(yīng)拉木處理組和直立木對(duì)照組分別進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)包含5棵，共30棵，待處理2周之后取材。

1.4 切片材料選取及木質(zhì)部的采集

應(yīng)拉木處理2周之后處理組截取彎曲部分的樹干，對(duì)照組截取與處理高度一致的樹干部分。截取中間部分5 cm左右留作后期切片使用。其余部分剝除樹皮，用手術(shù)刀片輕輕刮取正在發(fā)育的木質(zhì)部，應(yīng)拉木處理組內(nèi)外側(cè)選取中間部分并分別收集，正常木組則收集到一起，用液氮速凍，-80 ℃中長(zhǎng)期保存。

1.5 切片的制備及染色觀察

將切片材料用FAA固定液(V(體積分?jǐn)?shù)50%乙醇)∶V(甲醛)∶V(冰乙酸)=90∶5∶5)固定，用萊卡硬組織切片機(jī)(Leica，1400)進(jìn)行切片，切片厚度為40 μm，挑選較完整切片制成裝片，待染色觀察。

染色劑的配置。番紅溶液：將4 g番紅與4 g醋酸鈉溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇和100 mL水配置的混合溶液中。固綠溶液：固綠0.5 g溶于100 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中。2%間苯三酚溶液：稱取2 g間苯三酚，用100 mL體積分?jǐn)?shù)95%乙醇溶解。以上溶劑溶解后均用濾膜過濾后使用。

染色方法。番紅固綠對(duì)染：1.滴入1滴無水乙醇。2.吸去無水乙醇，用體積分?jǐn)?shù)95%酒精沖洗，使其平鋪于玻片，酒精分散均勻。3.滴1滴蒸餾水于材料上，使材料包裹于水滴之中。4.滴入1滴番紅試劑，染色3 min。5.使用體積分?jǐn)?shù)95%酒精沖掉浮色與多余染色液。6.滴入少量固綠溶液，并迅速吸去，用無水乙醇沖洗掉多余固綠，操作在2 s內(nèi)完成。蓋上蓋玻片，等待觀察。

間苯三酚染色：吸等量濃鹽酸與間苯三酚溶液在空試管中混勻，滴適量混合液到切片上，待變色后用水沖洗，蓋上蓋玻片，使用體式顯微鏡(OLYMPUS SZX7)進(jìn)行觀察。

1.6 山新楊FLA基因的表達(dá)模式

RNA提取及cDNA的合成：用CTAB法對(duì)山新楊應(yīng)拉木、對(duì)應(yīng)木、直立木及根莖葉進(jìn)行RNA提取，每部分進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。每組進(jìn)行3次重復(fù)，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA。將RNA用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒(ReverTra Ace qPCR RT Kit)進(jìn)行cDNA的合成。反應(yīng)體系為10 μL：預(yù)先配置好混合液4×DN Master Mix與gDNA Remover以體積比1 000∶2混合。分裝RNA每管500 ng，65 ℃變性5 min，取出置于冰上，加混合液(4×DN Master Mix，gDNA Remover)2 μL，補(bǔ)充RNase-Free水到8 μL處，37 ℃ 5 min去DNA，取出置于冰上加5×RT Master Mix② 2 μL，在PCR儀中進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄程序37 ℃ 15 min，50 ℃ 5 min，98 ℃ 5 min。產(chǎn)物即為熒光定量RT-PCR模板,-20 ℃保存待用。

熒光定量RT-PCR：根據(jù)PdbFLA基因序列設(shè)計(jì)定量引物如表1，反應(yīng)體系為20 μL，引物F、R各1 μL、模板2 μL、去離子水6 μL和2×Power SYBR Green PCR master mix 10 μL，總體系為20 μL，3次重復(fù)，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性12 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、78.4 ℃讀板1 s，共45個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。在Bio-Rad Hercules.CA.USA.上完成該反應(yīng)。讀數(shù)分析其數(shù)據(jù)，運(yùn)用2-ΔΔCT方法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析[20]。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 PdbFLAs生物信息學(xué)

PdbFLAs序列鑒定與理化性質(zhì)。利用在擬南芥網(wǎng)站查找到的21個(gè)擬南芥FLA家族基因，與山新楊基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，去除重復(fù)基因后進(jìn)行氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析，將含有FLA特定保守結(jié)構(gòu)域FAS的基因命名為PdbFLA1-11。

PdbFLA基因保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)如圖1，編碼區(qū)長(zhǎng)度最短為540 bp，最長(zhǎng)為1 440 bp(表2)；蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度最短含有179個(gè)氨基酸，最長(zhǎng)含有479個(gè)氨基酸；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為19.03～53.27 ku；理論等電點(diǎn)為4.98～5.18；從預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)看PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA9十分相似，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10十分相似。PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA6、PdbFLA9、PdbFLA11具有1個(gè)FAS結(jié)構(gòu)域，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10具有2個(gè)FAS結(jié)構(gòu)域。PdbFLAs氨基酸鏈氮端均有信號(hào)肽存在。PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA3、PdbFLA4、PdbFLA6、PdbFLA7、PdbFLA10碳端均有GPI錨，除此之外其余PdbFLAs均沒有GPI錨。

表2 山新楊FLAs蛋白理化性質(zhì)

PdbFLAs蛋白結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(表3)，在所有PdbFLAs蛋白中無規(guī)則卷曲所占比例最高。其中，PdbFLA4延伸鏈含量大于α螺旋；而除PdbFLA4之外的PdbFLAs的α螺旋含量次之，延伸鏈比例最低。在FLAs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)元件分布中可以看出PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA9結(jié)構(gòu)相似，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10結(jié)構(gòu)相似(圖2)。

表3 山新楊FLAs蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，該家族蛋白由α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相互盤繞、折疊三維構(gòu)象，可以看出PdbFLA1與PdbFLA9，PdbFLA2與PdbFLA4蛋白結(jié)構(gòu)較保守；PdbFLA3與PdbFLA10，PdbFLA7與PdbFLA8部分蛋白結(jié)構(gòu)類似。

PdbFLAs序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育。在山新楊FLA蛋白的多序列比對(duì)分析當(dāng)中，將木本植物毛果楊的35個(gè)PtrFLA引入其中。從比對(duì)結(jié)果可以看出(圖4)，PdbFLAs含有與PtrFLAs一樣的高度保守區(qū)域，其中PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10具有2個(gè)FAS保守域(Type1和Type2)，與毛果楊一樣在2個(gè)含有10個(gè)氨基酸的H1和H2之間含有[Tyr/Phe]-His([Y/F]H)基序。

H1具有高度保守的T蘇氨酸(Thr)、I異亮氨酸(Ile)、F苯丙氨酸(Phe)、A丙氨酸(Ala)、P脯氨酸(Pro)、D天冬氨酸(Asp)，PdbFLA1、PdbFLA9完全保守，PdbFLA2、PdbFLA4完全保守，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10完全保守。

[Y/F]H中具有高度保守的H組氨酸(His)、P脯氨酸(Pro)，在Type1和Type2中,PdbFLA3、PdbFLA10、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8完全保守。

H2具有高度保守的V纈氨酸(Val)、D天冬氨酸(Asp)、L亮氨酸(Leu)、P脯氨酸(Pro)。其中PdbFLA2、PdbFLA4完全保守，在Type1和Type2中PdbFLA3、PdbFLA10；PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8完全保守。綜上，PdbFLA3、PdbFLA10；PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8在這3個(gè)區(qū)域內(nèi)均保守。

為了預(yù)測(cè)PdbFLAs可能參與的功能，將毛果楊(P.trichocarpa)、桉樹(E.robustaSmith)和擬南芥(A.thaliana)FLA蛋白序列與PdbFLAs進(jìn)行進(jìn)化分析。分析結(jié)果顯示(圖5)，毛果楊、擬南芥FLA蛋白聚為4組。PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA9與AtFLA11、AtFLA12、PtrFLA31、PtrFLA34、EgrFLA1、EgrFLA2、EgrFLA3聚為同一組；PdbFLA6與AtFLA1、AtFLA2、AtFLA3、AtFLA4、AtFLA5、AtFLA8、AtFLA10、AtFLA14、AtFLA19、PtrFLA20聚為一組；PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10、PdbFLA11與AtFLA15、AtFLA16、AtFLA17、AtFLA18聚為一組，且推測(cè)同組內(nèi)的FLA基因在功能上具有相似性。

PdbFLAs基序與啟動(dòng)子預(yù)測(cè)。為了進(jìn)一步揭示11個(gè)FLA蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及特定區(qū)域，利用MEME工具對(duì)這11個(gè)FLA蛋白序列進(jìn)行基序分析(圖6)。對(duì)不同數(shù)量的基序進(jìn)行了測(cè)試，最后根據(jù)基序的統(tǒng)計(jì)意義(E值=0.001)選擇了12個(gè)基序。根據(jù)基序分析得出的結(jié)果，將PdbFLA蛋白分為3組，PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA9為一組，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10、PdbFLA11為一組，PdbFLA6為一組。同一組中的蛋白質(zhì)大多表現(xiàn)出相似的基序分布，與系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析的一致，進(jìn)一步驗(yàn)證同一組中的PdbFLAs功能上的相似性。

通過PlantCARE在線軟件對(duì)山新楊FLA基因啟動(dòng)子進(jìn)行分析(圖7)，在PdbFLA11啟動(dòng)子中有4個(gè)與WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件(W-box)；在PdbFLA2、PdbFLA4啟動(dòng)子中有低溫響應(yīng)元件(LTR)，在PdbFLA3、PdbFLA8、PdbFLA10啟動(dòng)子中有參與干旱誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)，在PdbFLA1、PdbFLA3、PdbFLA4、PdbFLA8、PdbFLA9、PdbFLA10啟動(dòng)子中有乙烯響應(yīng)元件(ERE)；在PdbFLA4啟動(dòng)子中有參與防御和應(yīng)力響應(yīng)的順式作用元件(TC-rich)；在PdbFLA1、PdbFLA3、PdbFLA7、PdbFLA11啟動(dòng)子中有光響應(yīng)元件(GT1-motif)，其中脫落酸(ABA)響應(yīng)元件(ABRE)在PdbFLA1、PdbFLA3、PdbFLA4、PdbFLA5、PdbFLA6、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA9、PdbFLA10、PdbFLA11、PdbFLA12都有分布，其中PdbFLA3、PdbFLA8、PdbFLA10啟動(dòng)子中均含有ABRE、MBS、ERE這3個(gè)元件，但數(shù)量、位置不同。

2.2 山新楊應(yīng)拉木的表型分析

本研究將應(yīng)拉木處理組與對(duì)照組分別進(jìn)行切片染色，在體視顯微鏡2倍鏡下觀察應(yīng)拉木、對(duì)應(yīng)木、直立木三者的差異，如圖8所示。處理2周后，山新楊樹干產(chǎn)生了明顯的偏心生長(zhǎng)，應(yīng)拉木新生木質(zhì)部組織寬度顯著高于直立木和對(duì)應(yīng)木，直立木新生木質(zhì)部寬度稍高于對(duì)應(yīng)木。應(yīng)拉木組織中，導(dǎo)管數(shù)量變少，管腔變小。番紅固綠對(duì)染結(jié)果顯示(圖8A)，應(yīng)拉木被染成藍(lán)綠色，顯示較高的纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。鹽酸—間苯三酚染色結(jié)果顯示(圖8B)，應(yīng)拉木組織著色較淺，木質(zhì)化程度較低，而對(duì)應(yīng)木組織紅色較深，木質(zhì)化程度高于應(yīng)拉木。

2.3 PdbFLAs的組織特異性表達(dá)

為了驗(yàn)證系統(tǒng)進(jìn)化分析中A組中的PdbFLAs是否與木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)，對(duì)PdbFLAs在不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行了探究。如表4所示，PdbFLA1在莖中表達(dá)量顯著高于根和葉。PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA6表達(dá)模式相同，在莖中的表達(dá)量高于在根中的表達(dá)量，葉中表達(dá)量極低。PdbFLA3、PdbFLA11表達(dá)模式相同，在根中表達(dá)量最高，葉中表達(dá)量最低。PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10表達(dá)模式相同，在根和莖中表達(dá)量差異不明顯，在葉中表達(dá)量最低。綜上說明PdbFLAs基因在組織表達(dá)上具有特異性。結(jié)合表達(dá)水平說明，A組的PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4可能和山新楊木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)。

2.4 PdbFLAs在應(yīng)力木誘導(dǎo)下的表達(dá)模式

為了探究PdbFLAs在應(yīng)力木誘導(dǎo)下的表達(dá)情況，分別以應(yīng)拉木、對(duì)應(yīng)木、直立木為模板，利用熒光定量RT-PCR進(jìn)行PdbFLAs的表達(dá)模式分析，其中PdbFLA2、PdbFLA3、PdbFLA6、PdbFLA7在應(yīng)拉木、對(duì)應(yīng)木、直立木中均有表達(dá)，在應(yīng)拉木中表達(dá)量最高，對(duì)應(yīng)木中表達(dá)量最低。PdbFLA4、PdbFLA11在應(yīng)拉木、對(duì)應(yīng)木、直立木中均有表達(dá)，在直立木中表達(dá)量最高，對(duì)應(yīng)木中表達(dá)量最低。PdbFLA5在直立木中表達(dá)，在應(yīng)拉木中表達(dá)量低，在對(duì)應(yīng)木中幾乎不表達(dá)。PdbFLA8和PdbFLA10在應(yīng)拉木中表達(dá)量高，在直立木和對(duì)應(yīng)木中表達(dá)差異不明顯。PdbFLA9在直立木和對(duì)應(yīng)木中表達(dá)量高但是差異不明顯，在應(yīng)拉木中表達(dá)量低。PdbFLA1在應(yīng)拉木中的表達(dá)量顯著高于對(duì)應(yīng)木和直立木(表5)。綜上結(jié)合表達(dá)量水平，在應(yīng)力木誘導(dǎo)下PdbFLA1、PdbFLA10參與應(yīng)拉木的發(fā)育。

表4 山新楊FLA家族基因組織特異性表達(dá)

表5 山新楊FLA家族基因在應(yīng)拉木中的表達(dá)模式

3 討論

FLA蛋白作為一類與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖蛋白，是阿拉伯半乳聚糖(AGPs)的一個(gè)亞族，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期都起著重要作用[21]。本研究通過擬南芥FLA家族與山新楊基因組進(jìn)行比對(duì)并克隆得到11條PdbFLAs。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10；PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA9在理化性質(zhì)，二級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似。在高級(jí)結(jié)構(gòu)中，PdbFLA1、PdbFLA9；PdbFLA2、PdbFLA4最相似，PdbFLA3、PdbFLA10；PdbFLA7、PdbFLA8較相似。說明基因在行使功能時(shí)，翻譯出的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)是相關(guān)聯(lián)的，盡管一部分PdbFLAs的空間結(jié)構(gòu)十分保守或類似，但是不同結(jié)構(gòu)比例有所不同，也暗示不同的PdbFLAs在功能上也會(huì)有所不同。在序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)PdbFLAs在3個(gè)結(jié)構(gòu)域中均有不同程度的保守，也進(jìn)而揭示了PdbFLAs之間結(jié)構(gòu)的差異。

在系統(tǒng)進(jìn)化與基序分析中，PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA9聚為一組，PdbFLA3、PdbFLA5、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA10、PdbFLA11聚為一組，PdbFLA6單獨(dú)聚為一組，同一組中具有相同的基序分布。有研究表明，擬南芥AtFLA11、AtFLA12促進(jìn)次生細(xì)胞壁木質(zhì)化[22]，毛果楊ptrfla31、ptrfla34突變體使木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高，纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，說明PtrFLA31、PtrFLA34可改變次生細(xì)胞壁的組成成分，從而影響莖的木質(zhì)部發(fā)育[23]，PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA9與這些基因聚為一組，說明這些A組的基因可能在木質(zhì)部發(fā)育中有類似功能。

通過對(duì)PtrFLAs啟動(dòng)子元件進(jìn)行分析，在PdbFLA11啟動(dòng)子中有4個(gè)W-box元件，有研究表明轉(zhuǎn)錄因子WRKY通過與W-box結(jié)合從而提高了大豆的耐旱性[24]，推測(cè)PdbFLA11可能與植物的耐旱性也相關(guān)。在PdbFLA2、PdbFLA4啟動(dòng)子中有低溫響應(yīng)元件(LTR)[25]，推測(cè)此基因可能與植物耐寒有關(guān)。在PdbFLA3、PdbFLA8、PdbFLA10啟動(dòng)子中有參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點(diǎn)(MBS)。在PdbFLA1、PdbFLA3、PdbFLA4、PdbFLA8、PdbFLA9、PdbFLA10啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)乙烯響應(yīng)元件(ERE)。在PdbFLA4啟動(dòng)子中有參與防御和應(yīng)力響應(yīng)的順式作用元件(TC-rich)，說明該基因可能在應(yīng)力響應(yīng)中發(fā)揮重要作用，但是PdbFLA4在應(yīng)拉木中表達(dá)量卻不高。在PdbFLA1、PdbFLA3、PdbFLA7、PdbFLA11啟動(dòng)子中有光響應(yīng)元件(GT1-motif)，說明這些基因可能參與了光響應(yīng)。ABRE元件在PdbFLA1、PdbFLA3、PdbFLA4、PdbFLA5、PdbFLA6、PdbFLA7、PdbFLA8、PdbFLA9、PdbFLA10、PdbFLA11都有分布，在鹽、干旱、低溫等非生物脅迫下，植物體內(nèi)的ABA被顯著誘導(dǎo)合成，并啟動(dòng)一系列信號(hào)途徑激活植物抗逆機(jī)制[26]，推測(cè)這些PdbFLAs可能參與了ABA信號(hào)的響應(yīng)[27]，而這一結(jié)果與進(jìn)化分析中PdbFLA6預(yù)測(cè)結(jié)果一致。其中PdbFLA3、PdbFLA8、PdbFLA10啟動(dòng)子中均含有ABRE、MBS、ERE元件。在擬南芥中，AtFLA4與鹽離子耐受性，細(xì)胞膨脹相關(guān)，并可能與ABA產(chǎn)生協(xié)同作用[28]；在毛果楊當(dāng)中PtrFLA20可能參與抗鹽[29]。由于PdbFLA6與AtFLA4、PtrFLA20親緣性較近，且其啟動(dòng)子含有抗性相關(guān)元件，所以推測(cè)PdbFLA6也可能與植物抗性相關(guān)。

組織表達(dá)分析結(jié)果顯示，PdbFLA1在莖中高度表達(dá)，PdbFLA2、PdbFLA4在莖中的表達(dá)量要高于根和葉，因此我們推斷PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4與莖的發(fā)育相關(guān)，這一結(jié)果與進(jìn)化分析相吻合，它們與擬南芥中參與了細(xì)胞壁次生生長(zhǎng)的AtFLA11和AtFLA12[22]聚為一組。此外，ZeFLA11基因只能在分化的木質(zhì)部導(dǎo)管和薄壁細(xì)胞中表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞次生壁增厚[12]。在桉樹莖中發(fā)現(xiàn)FLA基因的高度特異性表達(dá)[13-14]，進(jìn)一步驗(yàn)證該組基因參與木質(zhì)部的發(fā)育。在應(yīng)力木誘導(dǎo)下，山新楊木質(zhì)部纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)和木質(zhì)化程度發(fā)生了改變。在小黑楊中，纖維素合成相關(guān)基因、FLA等細(xì)胞壁相關(guān)蛋白基因以及MYB等轉(zhuǎn)錄因子均在應(yīng)拉木中高表達(dá)，而木質(zhì)素合成相關(guān)基因在對(duì)應(yīng)木中表達(dá)量較高[17]，在楊樹中當(dāng)給予壓力刺激時(shí)PopFLA1-10的表達(dá)水平也會(huì)隨之發(fā)生變化[16]，本研究PdbFLA1在應(yīng)拉木中高度表達(dá)，由此可以推測(cè)PdbFLA1可能在應(yīng)拉木的形成發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

本研究鑒定了11條山新楊FLA基因，編碼區(qū)長(zhǎng)度為540～1 440 bp。蛋白結(jié)構(gòu)及基序分析將PdbFLAs蛋白分為3組，每一組中蛋白二、三維結(jié)構(gòu)及基序分布都具有極強(qiáng)的相似性。系統(tǒng)進(jìn)化分析分為4個(gè)組，PdbFLA1、PdbFLA2、PdbFLA4、PdbFLA9與木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)的擬南芥AtFLA11、AtFLA12和毛果楊FLA31、FLA34聚為一組。啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)了光、脫落酸(ABA)、脅迫響應(yīng)和次生壁形成相關(guān)的重要順式元件。PdbFLA1在山新楊莖和應(yīng)拉木中表達(dá)量顯著，說明PdbFLA1與山新楊木質(zhì)部發(fā)育相關(guān)。