婁永慶 陳紅躍

甲狀腺癌(thyroid cancer, TC)是內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一,約占每年全世界確診癌癥的3.4%,其中以甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)最為常見,占85% ～90%[1,2]。 本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),夏枯草能夠有效抑制PTC 細(xì)胞的惡性行為,呈現(xiàn)濃度依賴性,然而其具體的分子機(jī)制目前尚不清楚[3]。 既往多篇研究報(bào)道,long non-coding RNA BANCR 在肺癌和膀胱癌中發(fā)揮著抑癌的功能,在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌和胃癌中卻作為致癌角色存在,而其在PTC 中的表現(xiàn)也相當(dāng)復(fù)雜[4～13]。 目前,夏枯草與BANCR 之間的研究報(bào)道較少,因此,本研究通過體外培養(yǎng)B-CPAP 細(xì)胞實(shí)驗(yàn),探究夏枯草通過BANCR 對(duì)B-CPAP 細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響及其具體的作用機(jī)制,為夏枯草應(yīng)用于PTC 的防治提供一定的理論根據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株：人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞株(B-CPAP)購(gòu)自中國(guó)上海iCell Bioscience 公司;正常人甲狀腺細(xì)胞株(Nthy-ori 3-1)購(gòu)自北納(北京)生物技術(shù)研究院。

2.實(shí)驗(yàn)藥物：夏枯草配方顆粒購(gòu)自四川新綠藥業(yè)有限公司,批號(hào)：1809025,規(guī)格為5 克/盒,每克顆粒相當(dāng)于生藥夏枯草8g。 順鉑,貨號(hào)：HY-17394,購(gòu)自中國(guó)上海百舜生物科技有限公司,規(guī)格是100 毫克/瓶,純度大于99%。

3.實(shí)驗(yàn)主要試劑與設(shè)備：胎牛血清、RPMI-1640、PBS、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自以色列Biological Industries 公司;青鏈霉素雙抗混合液、高效RIPA 裂解液、DMSO、PMSF 蛋白酶抑制劑、ECL 超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、NC 膜購(gòu)自中國(guó)北京索萊寶公司;CCK-8 試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海同仁化學(xué)科技公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)公司;蛋白電泳凝膠制備試劑盒購(gòu)自中國(guó)西安晶彩生物技術(shù)有限公司);MMP2、MMP9、GAPDH 抗體、兔抗購(gòu)自中國(guó)-武漢三鷹科技科技有限公司;lncRNA BNACR抑制劑、negative control、lncRNA BNACR RT 引物、lncRNA BNACRqPCR 引物、GAPDH 引物購(gòu)自中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司;RNA 快速提取試劑盒購(gòu)自北京金百特生物科技有限公司;mRNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、mRNA 擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;Transwell 細(xì)胞共培養(yǎng)小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司;超凈工作臺(tái)(JB-CJ-2FC 型)購(gòu)自中國(guó)蘇州馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司;柜式恒溫培養(yǎng)箱(HZ150L 型)購(gòu)自中國(guó)武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司;超速低溫離心機(jī)(SIGMA3-K 型)購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司;全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀(Varioskan Flash 型)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;日立超速離心機(jī)(HITACHⅠ型)購(gòu)自中國(guó)上海妙生科貿(mào)有限公司;蛋白凝膠成像系統(tǒng)(XBCX-S-044 型)購(gòu)自中國(guó)上海艾研生物科技有限公司等。

4.siRNA 的引物合成和qRT-PCR 干擾BANCR：lncRNA BANCR 的有效干擾序列上游引物：5'-CCACAUAUCAGCUUGGUUUTT-3',下游引物：5'-AAACCAAGCUGAUAUGUGGTT-3';控制序列si-NC 序列上游引物： 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3',下游引物：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行BANCR 的上游引物：5'-ACAGGACTCCATGGCAAACG-3',下游引物：5'-ATGAAGAAAGCCTGGTGCAGT-3';內(nèi)部參考GAPDH 上游引物：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGG-3,下游引物：5'-TCGCCCCACTTGATTTTGA-3'。 以上序列由中國(guó)上海生工生物工程股份有限公司合成。

5.細(xì)胞培養(yǎng)與人甲狀腺癌細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染：使用10%FBS 培養(yǎng)基培養(yǎng)B-CPAP 與Nthy-ori 3-1 細(xì)胞,培養(yǎng)瓶置于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。 當(dāng)細(xì)胞濃度生長(zhǎng)到70% 左右時(shí),按照轉(zhuǎn)染和說明書的指導(dǎo),將lncRNA BANCR siRNA 和si-NC 分別作用于細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)分為正常甲狀腺細(xì)胞(N)組、甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(B0)組、中藥夏枯草干預(yù)(B1.0)組、陰性對(duì)照(Bnc)組、siRNA 干預(yù)(Bsi)組、中藥夏枯草+siRNA 干預(yù)(B1.0 + si)組和順鉑干預(yù)的陽性對(duì)照(Bs)組。

6.夏枯草溶液的制備：取1g 夏枯草顆粒充分溶解于20ml RPMI-1640 完全培養(yǎng)液中,震蕩混勻,置于超聲儀器上處理30min,超速離心機(jī)2000r/min,離心10min,初步去除沉渣雜質(zhì),0.22mm 超微過濾器正壓抽濾除菌,制得濃度為40mg/ml 的夏枯草原液,4℃分裝保存?zhèn)溆谩?/p>

7.qRTPCR 技術(shù)方法檢測(cè)lncRNA BANCR 表達(dá)水平的變化：轉(zhuǎn)染劑作用48h、夏枯草24h 以后,提取各組細(xì)胞所含總RNA,RNA 的純度及濃度測(cè)定后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,儲(chǔ)存在-80℃冰箱備用。 GAPDH作為內(nèi)參,qRT-PCR 檢測(cè)lncRNA BANCR 的表達(dá)含量[20μl 反應(yīng)體系：2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μl,分別加入0.4μl(10μmol/L)上下游引物,2μl 的cDNA,體積不足20μl 用ddH2O補(bǔ)充]反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10min,然后95℃15s、60℃1min,共40 個(gè)循環(huán)。 結(jié)果以2-△△CT方法來統(tǒng)計(jì),表示lncRNA BANCR 的表達(dá)量。

8.Western blot 法檢測(cè)MMPs 表達(dá)水平的變化：轉(zhuǎn)染劑作用48h、夏枯草24h 以后,提取各組細(xì)胞所含總蛋白,BCA 法測(cè)定蛋白濃度,用于后續(xù)配置樣品,然后用SDS-PAGE 電泳將蛋白轉(zhuǎn)移至NC 膜上,并使用5%脫脂乳密封蛋白質(zhì)。 然后,將兔抗MMP2、兔抗MMP9(1∶2000 稀釋)孵育蛋白條帶,并將條帶置于4℃冰箱過夜。 洗膜,孵育二抗(兔抗∶5%脫脂乳=1∶2000 稀釋),室溫?fù)u床上放置1.5h,再次洗膜3 遍,30min 后,ECL 顯色,成像儀曝光拍攝。 采用Image J 軟件檢測(cè)各組條帶的灰度值,表示MMP2/9的相對(duì)表達(dá)含量高低。

9.通過CCK-8 法檢測(cè)甲狀腺癌細(xì)胞株的增殖：以10000 個(gè)/孔的濃度將B-CPAP 細(xì)胞接種在96 孔板中,配置每孔體積在100μl,每組需設(shè)立5 個(gè)副孔。放置37℃恒溫箱24h 后,細(xì)胞貼壁,甩去板內(nèi)原液體,PBS 沖洗兩遍,并使用siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 48h 后,中藥組使用1.0mg/ml 濃度夏枯草溶液,每孔100μl的體積注入。 72h 后,甩去板內(nèi)的夏枯草溶液,PBS沖洗兩遍,然后用移液器每孔打入8μl CCK-8 溶液,剩余用純培養(yǎng)基補(bǔ)充至100μl,置于培養(yǎng)箱中孵育1 ～6h,打開自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀,波長(zhǎng)調(diào)整為450nm,記錄吸光度(A)值,整理數(shù)據(jù)。

10.Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B-CPAP 細(xì)胞侵襲能力的變化：將干擾序列和對(duì)照組的序列轉(zhuǎn)染到B-CPAP 細(xì)胞中,當(dāng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長(zhǎng)到80% ～90%且狀態(tài)良好時(shí),用胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來,加入2%無鏈紅霉素培養(yǎng)基配置成細(xì)胞懸液,顯微鏡下計(jì)數(shù)、統(tǒng)計(jì),調(diào)整細(xì)胞濃度為3 ×105個(gè)/毫升,將細(xì)胞懸液100μl 加入到Transwell 小板的上室內(nèi),依照原先設(shè)計(jì)的分組緩慢向下層小室加入夏枯草、順鉑溶液各500μl,每組設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔,37℃條件下反應(yīng)24h。 小室底層的細(xì)胞用4%組織細(xì)胞固定液固定30min,結(jié)晶紫染色10 ～20min。 隨機(jī)選取5 個(gè)視野,拍照計(jì)數(shù)。

11.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B-CPAP 細(xì)胞遷移能力的變化：轉(zhuǎn)染劑作用細(xì)胞48h 后,在培養(yǎng)板各孔劃出6 道“1”字樣劃痕,PBS 清洗兩遍,加入夏枯草(1.0mg/ml)、順鉑(10μg/ml)各2ml,置于ZOOM 顯微鏡下拍照,每6h 拍攝1 次,48h 后取出。 采用Image J 軟件對(duì)劃痕面積進(jìn)行分析。

12.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用GraphPad Prism8.3 作圖,組間差異用單因素方差分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR 表達(dá)的影響：qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常甲狀腺細(xì)胞比較,B-CPAP 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA BANCR 高表達(dá),而夏枯草作用于B-CPAP 細(xì)胞24h 后,lncRNA BANCR 的表達(dá)水平出現(xiàn)了顯著降低,各實(shí)驗(yàn)組與B0組結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖1)。

圖1 各組細(xì)胞lncRNA BANCR 表達(dá)水平

2.夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞中MMP2、MMP9 表達(dá)的影響：Western blot 法檢測(cè)結(jié)果顯示,B-CPAP 細(xì)胞中MMP2、MMP9 高表達(dá),正常甲狀腺細(xì)胞中低表達(dá)(圖2)。 夏枯草作用于B-CPAP 細(xì)胞24h 及沉默了lncRNA BANCR 后能夠明顯下調(diào)MMP2、MMP9 的表達(dá)量,各實(shí)驗(yàn)組與B0 組結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖3)。

圖2 夏枯草作用后各組蛋白印跡結(jié)果

圖3 夏枯草作用后各組相關(guān)蛋白表達(dá)水平

3.夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞生存率的影響：B0組、Bnc 組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,而在加入了1.0mg/ml 的夏枯草后,B1.0 組細(xì)胞存活率顯著降低,隨后敲低了B-CPAP 中l(wèi)ncRNA BANCR 的表達(dá),其對(duì)B-CPAP細(xì)胞增殖的抑制效果更為明顯。 各實(shí)驗(yàn)組與B0 組結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖4,圖5)。

圖4 夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)

圖5 夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞存活率的影響

4.夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞遷移力的影響：夏枯草作用于B-CPAP 和沉默BANCR 后的細(xì)胞株在12、24h,ZOOM 顯微鏡拍攝到的各組愈合過程的情況(圖6)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相同時(shí)間段內(nèi),各實(shí)驗(yàn)組較甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(B0)組,劃痕愈合率均出現(xiàn)不同程度降低,24h 與12h 比較,差異性更加明顯(P＜0.05)。

圖6 夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞遷移力的影響(×200)

5.夏枯草對(duì)B-CPAP 細(xì)胞侵襲力的影響：Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,加入1.0mg/ml 的夏枯草和轉(zhuǎn)染抑制劑的B-CPAP 細(xì)胞透膜量降低了約1/2,兩者同時(shí)作用效果更加明顯,各實(shí)驗(yàn)組與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞(B0)組結(jié)果比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖7)。

圖7 光鏡下各組細(xì)胞透膜數(shù)(×200)

討 論

近年來,隨著甲狀腺彩超、細(xì)針穿刺活檢(FNA)及基因檢測(cè)技術(shù)的迅速發(fā)展,早期甲狀腺癌的診斷準(zhǔn)確率大大提升,過去10 多年間,我國(guó)甲狀腺癌術(shù)后5年生存率從67.5%提高至84.3%,但仍遠(yuǎn)低于西方歐美國(guó)家(98.7%)[14]。然而,隨著甲狀腺癌發(fā)生率的不斷增長(zhǎng),因術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及并發(fā)癥所導(dǎo)致的死亡人數(shù)也在快速增加[15]。 因此,我們更加迫切希望尋求一味能夠有效抑制突變型PTC 細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物。 夏枯草作為一味軟堅(jiān)、消腫、散結(jié)常用的中藥,其在甲狀腺疾病的防治方面已有超過千年的歷史[16]。 臨床治療結(jié)果證實(shí),夏枯草在治療甲狀腺慢性、亞急性炎癥、甲狀腺腫及甲狀腺結(jié)節(jié)方面效果顯著[17,18]。 結(jié)合相關(guān)臨床數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)資料來看,夏枯草在甲狀腺疾病防治方面具有極高的研究?jī)r(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)過程中還發(fā)現(xiàn)夏枯草作用于沉默了BANCR 的B-CPAP 細(xì)胞后,MMP2、MMP9 表達(dá)水平下降及其對(duì)B-CPAP 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲作用的抑制效果更加明顯,因此證實(shí)夏枯草除了通過BANCR 調(diào)節(jié)MMP2、MMP9 的表達(dá)抑制PTC 細(xì)胞的惡性行為外,還可以通過別的途徑發(fā)揮其抑癌的作用。

綜上所述,夏枯草能夠有效抑制PTC 細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移的過程,作用機(jī)制可能與通過下調(diào)lncRNA BANCR 來減少M(fèi)MP2、MMP9 的表達(dá)相關(guān),本研究為將夏枯草作為新型抗癌中草藥在臨床中推廣奠定了理論基礎(chǔ)。