夏 秦 陳臨琪 宋浩潔 陳秀麗 謝蓉蓉 王鳳云 吳海瑛 孫 輝 張丹丹 陳 婷

Graves 病(Graves' disease,GD)是由遺傳和環(huán)境因素的相互作用導(dǎo)致免疫耐受喪失,自身免疫系統(tǒng)攻擊甲狀腺所引起的疾病。 GD 是兒童甲狀腺功能亢進(jìn)癥最常見(jiàn)的原因,在兒童時(shí)期相對(duì)發(fā)生率不高,為(0.9 ～14.1)/10 萬(wàn),在青春期達(dá)到高峰,女性多于男性[1～4]。 目前已報(bào)道的與GD 相關(guān)的環(huán)境因素主要包括碘、硒、輻射、吸煙、感染、維生素D、壓力、雌激素、免疫調(diào)節(jié)劑和甲狀腺化學(xué)干擾物等[5]。 這些環(huán)境因素主要通過(guò)直接影響甲狀腺功能或引起自身免疫反應(yīng),間接破壞甲狀腺組織來(lái)誘發(fā)疾病的發(fā)生[6]。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UHPLC-QTOF/MS)分析初診未治GD 兒童血清中低分子環(huán)境干擾物水平,并與正常兒童比較,以期發(fā)現(xiàn)影響GD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的新環(huán)境干擾物。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象：選取2017年3月～2018年10月首次就診于蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院的初診GD 患兒30例作為實(shí)驗(yàn)組(GD 組),同時(shí)收集同期在筆者醫(yī)院行健康體檢,其年齡、性別與GD 組相匹配的健康兒童30 例作為對(duì)照組。 所有研究對(duì)象均長(zhǎng)期生活在蘇州市內(nèi)。 GD 診斷參考《中國(guó)甲狀腺疾病診治指南——甲狀腺功能亢進(jìn)癥》和《European Thyroid Association Guideline for the Management of Graves' Hyperthyroidism》[9,10]。 所有受試者均進(jìn)行一般性體格檢查和實(shí)驗(yàn)室評(píng)估,排除肝功能異常、心血管并發(fā)癥或其他內(nèi)分泌及免疫性疾病。 另外受試者均為青春期前兒童。通過(guò)Tanner 分期來(lái)評(píng)估青春期發(fā)育,只有睪丸體積＜4ml的男孩和乳房發(fā)育為T(mén)anner Ⅰ期的女孩被納入研究[1]。 本研究通過(guò)蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)審批(倫理審批號(hào)：2020CS020),在研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)的基礎(chǔ)上,進(jìn)行血樣本的采集。

2.一般資料及臨床指標(biāo)：本研究收集就診時(shí)患兒年齡、性別、體重、甲狀腺功能及甲狀腺自身抗體指標(biāo)。甲狀腺功能及抗體均利用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。 于早晨8：00時(shí)抽取空腹靜脈血2ml,置于-80℃保存,待集中檢測(cè)。

3.質(zhì)譜法檢測(cè)低分子物質(zhì)：采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法(UHPLC-QTOF/MS)測(cè)定血清中的低分子代謝物水平。

4.儀器與試劑：超高效液相(1290UHPLC)購(gòu)自美國(guó)Agilent 公司,;高分辨質(zhì)譜(Triple TOF 6600)購(gòu)自美國(guó)AB Sciex 公司;離心機(jī)(Heraeus Fresco17)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司;天平(BSA124S-CW)購(gòu)自德國(guó)Sartorius 公司;純水儀(明澈D24 UV)購(gòu)自德國(guó)Merck Millipore 公司;超聲儀(PS-60AL)購(gòu)自深圳市雷德邦電子有限公司;色譜柱(ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm 2.1 × 100mm)購(gòu)自美國(guó)Waters 公司。 實(shí)驗(yàn)用甲醇、乙腈、乙酸銨、氨水(來(lái)自CNW Technologies),L-2-氯苯丙氨酸購(gòu)自上海恒柏生物科技有限公司,實(shí)驗(yàn)用水為純水。

5.實(shí)驗(yàn)過(guò)程[11]：取100μl 樣本,加入400μl 含有內(nèi)標(biāo)的提取液(甲醇∶乙腈體積比為1∶1,內(nèi)標(biāo)濃度為2μg/ml),渦旋混勻30s;超聲5min(冰水浴);-20℃靜置1h;將樣本4℃,12000r/min 離心15min;取出425μl 上清于EP 管中;在真空濃縮器中干燥提取物;向干燥后的代謝物加入100μl 提取液(乙腈∶水體積比為1∶1)復(fù)溶;渦旋30s,冰水浴超聲10min;將樣本4℃,12000r/min 離心15min;取出60μl 上清于2ml LC/MS 進(jìn)樣瓶,每個(gè)樣本各取10μl 混合成QC 樣本,再取60μl 進(jìn)行UHPLC-QTOF-MS 分析。

6.利用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)測(cè)定血清中的總碘,實(shí)驗(yàn)方法參考既往研究[12]。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：兩組間篩選的低分子代謝物數(shù)據(jù)利用多元變量統(tǒng)計(jì)分析和單變量統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行聯(lián)合分析,本項(xiàng)目使用的卡值標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05,同時(shí)OPLS-DA 模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the projection, VIP) ＞1.2,且該物質(zhì)在該組對(duì)比兩組實(shí)驗(yàn)間的倍數(shù)關(guān)系(fold change,FC) ＞1.20 或＜0.83。 兩組間總碘水平的對(duì)比利用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)方法,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示;不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料均采用秩和檢驗(yàn),以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(Q1,Q3)]表示。 之后采用Logistic回歸分析找出與GD 發(fā)病最相關(guān)的物質(zhì)。差異低分子環(huán)境干擾物與GD 組臨床指標(biāo)之間的關(guān)系利用Spearman相關(guān)性分析,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.一般資料：對(duì)GD 組和對(duì)照組一般資料進(jìn)行對(duì)比分析,兩組間性別、年齡未見(jiàn)明顯差異,GD 組體重明顯低于對(duì)照組[24.86(20.38,28.25)kg vs 26.48(22.73,29.16)kg,P＜0.001]。 另外,GD 組FT3(17.57 ± 9.24pmol/L vs 6.02 ± 0.49pmol/L,P＜0.001)水平明顯高于對(duì)照組,FT4(55.86 ±31.09pmol/L vs 17.67 ± 2.06pmol/L,P＜0.001)水平明顯高于對(duì)照組,TSH (0.0067 ± 0.0039mIU/L vs 2.6100 ±1.3100mIU/L,P＜0.001)水平明顯低于對(duì)照組。

2.總碘水平的差異：用非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)不符合正態(tài)分布的碘離子進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得出碘離子濃度在GD組為115.90 (78.70,143.28) μg/L,在對(duì)照組為70.02(55.18,83.25)μg/L,GD 組明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.基于非靶向代謝組學(xué)篩選GD 組與對(duì)照組間差異環(huán)境干擾物：基于非靶向代謝組學(xué)技術(shù)篩選出21 種差異低分子環(huán)境干擾物。 與正常對(duì)照組比較,有15 種低分子干擾物在GD 組升高,6 種在GD 組降低(圖1)。

圖1 兩組間顯著性差異低分子環(huán)境干擾物

4.GD 環(huán)境干擾物的Logistic回歸分析：用單變量二元邏輯回歸來(lái)分析差異低分子環(huán)境干擾物及總碘與GD 之間的相關(guān)性(表1),在排除來(lái)源不明、標(biāo)準(zhǔn)差過(guò)大或Exp(β)值接近于1 的物質(zhì)后,對(duì)符合條件的6 種物質(zhì)(包括黃酮、D-來(lái)蘇糖、密葉辛木素、3-烯丙基-4-羥基苯乙酮、3-己酮和葡萄甾酮A)進(jìn)行多因素二元Logistic逐步前進(jìn)回歸分析(表2)。 結(jié)果提示密葉辛木素是GD 的獨(dú)立保護(hù)因素,P=0.002,Exp(β) =0.001;松甾酮A 是GD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,P=0.007,Exp(β) =14.136。

表1 環(huán)境低分子干擾物的單因素二元Logistic 回歸分析

表2 GD 顯著相關(guān)環(huán)境干擾物的多因素二元Logistic 逐步回歸分析

5.GD 組中差異環(huán)境干擾物與甲狀腺臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析：用Spearman對(duì)以上兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的環(huán)境干擾物與臨床指標(biāo)之間進(jìn)行統(tǒng)相關(guān)性分析(P＜0.05,圖2)。 根據(jù)相關(guān)系數(shù)＞0.4 進(jìn)行篩選,結(jié)果表明,黃酮、1-萘酚、對(duì)甲酚、密葉辛木素和5,6,7,8-四羥基-2-萘甲酸與TPOAb呈負(fù)相關(guān),呋喃妥因和反式-3-香豆酸與TPOAb 呈正相關(guān)。茴香烯與TRAb 呈正相關(guān)。 7-甲基黃嘌呤與TSH 和TGAb 呈負(fù)相關(guān),泛昔洛韋與FT4呈正相關(guān),5, 6,7,8-四羥基-2-萘甲酸與TT3、FT4、TT4呈正相關(guān),D-來(lái)蘇糖與TT3呈負(fù)相關(guān),與FT4呈負(fù)相關(guān),3-烯丙基-4-羥基苯乙酮與FT3、TT3呈負(fù)相關(guān)。

圖2 GD 組差異性低分子環(huán)境干擾物與甲狀腺功能及自身抗體之間的相關(guān)性分析

討 論

GD 的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)和病情進(jìn)展受到多種環(huán)境因素影響,有研究者認(rèn)為,輻射、碘攝入和環(huán)境毒物與GD易感性最相關(guān)[5,14]。 基于UHPLC-QTOF/MS 的非靶向技術(shù)可對(duì)有機(jī)體內(nèi)代謝物進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析,實(shí)時(shí)揭示機(jī)體生理病理狀態(tài),并能夠從廣泛大量的數(shù)據(jù)中提取有用的差異數(shù)據(jù)[15]。 該技術(shù)既往在多種自身免疫性疾病,如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或多發(fā)性硬化中均有應(yīng)用[16,17]。 但鮮有研究將該技術(shù)應(yīng)用于與兒童GD 篩查環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。

本研究結(jié)果表明,松甾酮A 在GD 組明顯升高,并作為GD 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 松甾酮A 屬于蛻皮激素的一種,來(lái)源于羅漢松等植物及蟹等甲殼類動(dòng)物[18,19]。 既往雖然尚無(wú)松甾酮A 與甲狀腺疾病之間相關(guān)性的報(bào)道,但其他的水產(chǎn)(如劍魚(yú))被證明是產(chǎn)后甲狀腺炎的危險(xiǎn)因素[20,21]。 本研究對(duì)象均生活在蘇州市,蘇州市作為水鄉(xiāng),盛產(chǎn)魚(yú)、蝦、蟹,當(dāng)?shù)鼐用耧嬍持写祟愂澄锵妮^大。 因此,松甾酮A 可能是蘇州市當(dāng)?shù)谿D 的一個(gè)特異性危險(xiǎn)因素,但該結(jié)論尚需更大樣本量的研究證實(shí)。 本研究還發(fā)現(xiàn),密葉辛木素可作為GD 獨(dú)立保護(hù)因素,并與TPOAb 呈明顯負(fù)相關(guān)。 密葉辛木素屬于倍半萜類天然產(chǎn)物,植物苔類是其豐富來(lái)源[22]。 既往研究發(fā)現(xiàn),密葉辛木素作為中藥的成分具有抗三陰性乳腺癌作用和密葉辛木素抗菌活性[23,24]。 目前尚缺乏密葉辛木素與甲狀腺之間關(guān)系的研究。 其具體機(jī)制尚需開(kāi)展進(jìn)一步動(dòng)物研究進(jìn)行驗(yàn)證。

黃酮類化合物包括木犀草素和芹菜素等物質(zhì),廣泛存在于水果、蔬菜和堅(jiān)果等食物中,與日常生活息息相關(guān)[25]。 黃酮具有多種生物活性,如抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏、抗氧化等,并在動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病及癌癥等疾病中起保護(hù)作用[26]。 研究表明,黃酮可以調(diào)節(jié)甲狀腺激素(thyroid hormone,TH)的合成和分泌。 Sartelet 等[27]研究發(fā)現(xiàn),黃酮與甲基硫氧嘧啶結(jié)構(gòu)相似,能夠抑制TPO 活性。 Panda 等[28]研究發(fā)現(xiàn),在四氧嘧啶誘發(fā)的糖尿病小鼠模型中,芹菜素可以有升高TH 水平的作用,而在正常小鼠中則使TH 水平降低。 另外類異黃酮也被證明與甲狀腺功能相關(guān),一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),女性異黃酮的攝入量與TSH 升高存在相關(guān)性[29]。 此外,異黃酮作為一種植物雌激素,大量補(bǔ)充還可以使亞臨床甲狀腺功能減退癥發(fā)展成為甲狀腺功能減退癥的概率增加[30]。 本研究發(fā)現(xiàn),GD 組黃酮濃度明顯較對(duì)照組降低,與既往研究結(jié)果一致,由此推測(cè)黃酮可能通過(guò)抑制TH 合成對(duì)兒童GD 起到保護(hù)作用。 此外,本研究還發(fā)現(xiàn),GD 組黃酮與TPOAb 水平呈負(fù)相關(guān),后者作為一種氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)因子,可反映GD 患者的OS 水平[31]。 推測(cè)TPOAb 與黃酮水平的負(fù)相關(guān)可能與黃酮的抗氧化活性有關(guān)。黃酮在GD 患者中的抗氧化作用及潛在的有益作用有待于進(jìn)一步研究予以證實(shí)。

呋喃妥因是一種廣譜抗生素,既往是預(yù)防尿路感染復(fù)發(fā)的一線用藥,也常被置于飲用水或飼料中喂養(yǎng)牲畜魚(yú)類[32]。 雖然中國(guó)已經(jīng)禁止畜牧業(yè)和漁業(yè)中呋喃妥因的濫用,但呋喃妥因在水產(chǎn)品中超標(biāo)的事件仍屢有報(bào)道。 呋喃妥因可誘發(fā)患者出現(xiàn)多種自身免疫性疾病,包括自身免疫性肝臟和肺疾病,ANCA 相關(guān)性血管炎以及亞臨床紅斑狼瘡等[33～35]。 呋喃妥因作用于體液免疫和細(xì)胞免疫,使自身抗體生成增加,也可以刺激Th 細(xì)胞生成,并影響其與抑制性T 細(xì)胞之間的平衡[36,37]。 目前甲狀腺疾病與呋喃妥因之間的關(guān)系尚不明確。 本研究結(jié)果表明,呋喃妥因在GD 組中水平升高,并與TPOAb 水平呈正相關(guān)。 呋喃妥因?qū)D 病情的影響還有待于進(jìn)一步研究明確。

綜上所述,GD 是一種受遺傳和環(huán)境因素共同影響的復(fù)雜疾病。 除既往已報(bào)道的環(huán)境因素外,仍有很多與GD 發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)或疾病進(jìn)程相關(guān)的環(huán)境干擾物尚待發(fā)現(xiàn)。 在本研究中,筆者通過(guò)質(zhì)譜方法篩查出幾個(gè)可能參與兒童GD 發(fā)病機(jī)制的新因素,深入研究其具體的分子機(jī)制有助于為GD 的預(yù)防或治療提供新的思路。