毛文軍 蔡 薇

麝香保心丸是目前國內(nèi)普遍用于治療冠心病的中成藥,有效組分包括人參提取物、人工麝香、冰片、肉桂、蟾酥、牛黃、蘇合香7 種,通過合理的配伍,可起到“芳香溫通,益氣強心”的作用,具有抑制血管壁炎性反應(yīng),促進微血管新生的效用[1]。 冰片是麝香保心丸中具有揮發(fā)性的一種藥材,冰片具有降低心率、減少心肌耗氧量、增加冠狀動脈血流量的作用[2]。 有研究表明,冰片可作用于大鼠下丘腦,抑制交感神經(jīng)興奮性,減少兒茶酚胺類物質(zhì)如腎上腺素及去甲腎上腺素釋放入血,起到預防心血管疾病的作用[3,4]。

血管內(nèi)皮細胞的損傷是心血管疾病最主要的病變基礎(chǔ),氧化應(yīng)激反應(yīng)是導致細胞損傷的關(guān)鍵,其主要機制是體內(nèi)活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)和活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)生成過多,機體代謝能力不足,失代償引起體內(nèi)氧化反應(yīng)體系的失衡,導致細胞功能障礙[5,6]。 線粒體是生物體內(nèi)能量代謝的主要細胞器,是生成活性氧自由基ROS 的主要部位,也是氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷的主要靶點之一,線粒體損傷是導致心血管疾病、代謝綜合征等多種疾病的重要機制[6]。 因此保護線粒體功能,減少氧化應(yīng)激反應(yīng)的損傷,有助于改善心血管疾病的預后。

過氧化氫(H2O2)是活性氧自由基ROS 及其衍生物的組分之一,過氧化氫含量升高可導致氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。 本實驗通過建立H2O2導致的CMECs 氧化應(yīng)激損傷模型,加入冰片干預處理,檢測細胞內(nèi)LDH、MDA、氧化呼吸鏈NADP + /NADPH、谷胱甘肽的含量,測定部分影響線粒體功能的基因mRNA 及蛋白的表達量,探究冰片對氧化應(yīng)激損傷及線粒體功能的保護作用。

材料與方法

1.材料及試劑：大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞CMECs 購自上海雅吉生物科技有限公司;天然冰片購自吉安聚鵬天然香料油有限公司;1001 內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基(endothelial cell medium,ECM)購自美國Sciencell 公司;cell counting kit-8(CCK-8)試劑盒、MDA(malondialdehyde)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒、GSH 和GSSG檢測試劑盒、NADP + /NADPH 檢測試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司;DMSO、RNA 提取試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。 anti-FACL4 抗體[EPR8640](ab155282)、anti-Glutathione Peroxidase 4(GPX4)抗體(ab231174)、anti-β actin 抗體[mAbcam 8224]-Loading Control(ab8224)購自英國Abcam 公司。 反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit(DRR037A)、SYBR Premix Ex TaqTM(DRR081A)

購自日本TaKaRa 公司。 PCR 擴增引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2.CCK-8 法檢測實驗各組細胞的活力：在培養(yǎng)板每個孔中加入內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基100μl,預培養(yǎng)24h,加入10μl 待測物,于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,再于每孔中加入CCK-8 溶液10μl,靜置于細胞培養(yǎng)箱4h,用酶標儀測定450nm 處各組細胞的吸光度(A)值。 本實驗設(shè)定對照組細胞活力為100%,各實驗組的相對細胞活力分別為該組與對照組A值的百分比。

3.過氧化氫損傷CMECs 模型的建立：首先將CMECs 分為5 組,其中1 組為對照組,其余4 組為H2O2損傷組,損傷組用濃度分別為200、400、600、800μmol/L 的 H2O2持續(xù)作用于 CMECs 12h, 用CCK-8 法檢測各組細胞活力,確定本實驗中合適的H2O2損傷濃度為400μmol/L。

4.冰片對CMECs 細胞活力的影響：將冰片溶解于0.1%DMSO 中,稀釋到一定濃度。 實驗分為對照組、0.1%DMSO 組及濃度分別為5、10、15、20、50μg/ml 的冰片組,分別作用12h 后,CCK-8 法檢測各組細胞活力。

5.冰片對H2O2損傷后CMECs 細胞活力的影響：首先將CMECs 分為6 組,對照組為內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)36h;H2O2損傷組為用含400μmol/L H2O2的內(nèi)皮細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)36h;冰片治療組為用含400μmol/L H2O2的培養(yǎng)液培養(yǎng)12h 后,再用含400μmol/L H2O2及不同濃度冰片的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h,冰片濃度梯度分別為5、10、15、20μg/ml,同樣用CCK-8 法檢測各組細胞活力,確定冰片治療濃度為15μg/ml。

6.分組：①對照組：用內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)CMECs 36h;②H2O2損傷組：在內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基中加入濃度為400μmol/L 的 H2O2,加入CMECs 培養(yǎng)36h;③冰片治療組：含400μmol/L H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)CMECs 12h 后,加入天然冰片,濃度為15μg/ml,繼續(xù)培養(yǎng)24h。 然后檢測各組的細胞活力,線粒體功能及氧化應(yīng)激損傷相應(yīng)指標。

7.LDH 的檢測：將各組的培養(yǎng)液于96 孔培養(yǎng)板中離心5min,加入PBS 緩沖液稀釋后的LDH 檢測試劑,放入培養(yǎng)箱中孵育1h,再離心5min 取上清液。按照LDH 檢測試劑盒說明書進行操作,根據(jù)相應(yīng)公式計算得出結(jié)果。

8.MDA 含量檢測：將各組CMECs 離心、收集細胞沉淀,冰浴中用PBS 緩沖液洗滌,冰浴條件下離心5min,取上清液。 根據(jù)MDA 檢測試劑盒說明書的相應(yīng)公式計算并得出結(jié)果。

9.NADP + /NADPH 的檢測：在各組CMECs 中加入NADP + /NADPH 提取液,再加入細胞裂解液,冰浴條件下離心10min,收集上清液。 按照說明書進行檢測,并計算得出相應(yīng)結(jié)果。

10.GSH 及 GSSG 的檢測： 將分組處理后的CMECs 經(jīng)PBS 洗滌、離心、收集細胞沉淀,加入蛋白去除試劑M,用液氮及37℃水浴快速凍融連續(xù)兩次,冰浴中靜置5min,再離心10min 取上清液。 按照試劑盒說明書的公式計算出相應(yīng)結(jié)果。

11.RT-PCR 檢測：FACL4 上游引物：5'-AAGGAACAAAGGAGACTATG-3',下游引物：5'-TATTGCCAGTCTTTTAGCTTA-3';GPX4 上游引物：5'-GAGGCAGGAGCCAGGAAGT-3', 下游引物：5'-ACAGTGGGTGGGCATCGTC-3';β-actin 上游引物：5'-GGACCTGACTGACTACCTC-3',下游引物：5'-TCATACTCCTGCTTGCTG-3'。 用RNA 提取試劑盒提取CMECs 樣本中的RNA,冰浴條件下配制RNA 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系,反應(yīng)液共10μl,反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃15min,85℃5s,4℃保存。 冰浴條件下配制PCR 反應(yīng)液共25μl,PCR 擴增程序為：95℃ 30s,60℃ 45s,40個循環(huán),4℃保存。 以β-actin 為內(nèi)參,計算mRNA的相對表達量。

12.蛋白免疫印跡：提取蛋白樣本,經(jīng)上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜封閉后,分別加入對應(yīng)抗體一抗孵育過夜,第2天室溫下復溫30min,二抗孵育1h,經(jīng)顯色及成像后進行條帶分析。 采用相對定量法,以β-actin 為內(nèi)參,目的蛋白的相對表達量為該蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值。

13.統(tǒng)計學方法：應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計學軟件對各實驗組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,對差異顯著的數(shù)據(jù)用最小顯著差異法進行多重對比分析,實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)表示,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.H2O2對CMECs 細胞活力的影響：各組濃度的H2O2干預CMECs 12h 后,CCK-8 法檢測細胞活力的變化。 結(jié)果顯示,H2O2導致CMECs 細胞活力降低,并與劑量呈相關(guān)性,H2O2濃度≥200μmol/L 時,細胞活力隨H2O2濃度增加而降低,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖1)。 本研究后續(xù)實驗中選取的H2O2濃度為400μmol/L,損傷后細胞活力約為對照組的66%。

圖1 不同濃度H2 O2 對CMECs 細胞活力的影響

2.冰片對CMECs 細胞活力的影響：用濃度分別為5、10、15、20μg/ml 的冰片作用于CMECs 后,各組細胞活力與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義,而冰片濃度為50μg/ml 時,細胞活力出現(xiàn)下降,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 0.1%DMSO 作用于CMECs后,細胞活力無明顯改變。 本實驗說明50μg/ml 冰片對CMECs 存在毒性不良反應(yīng),而0.1%DMSO 和5、10、15、20μg/ml 的冰片對細胞活力無明顯毒性不良反應(yīng),后續(xù)實驗中冰片均溶解于0.1%DMSO 中(圖2)。

圖2 不同濃度冰片及0.1%DMSO 對CMECs細胞活力的影響

3.冰片對H2O2損傷后CMECs 細胞活力的影響：H2O2損傷濃度為400μmol/L。 不同濃度冰片干預后,經(jīng)H2O2損傷后的CMECs 活性較前明顯升高,且冰片濃度為5、10、15μg/ml 時,細胞活力的上升程度與濃度呈正相關(guān),當冰片濃度增至20μg/ml 時,細胞活力與15μg/ml 冰片濃度時基本相同,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義;與H2O2組比較,差異有統(tǒng)計學意義(圖3)。 后續(xù)實驗中冰片治療濃度為15μg/ml,相對細胞活力約為對照組的80%。

圖3 不同濃度冰片對H2 O2 損傷后CMECs 細胞活力的影響

4.冰片對H2O2損傷后CMECs 內(nèi)LDH 含量的影響：與對照組比較,H2O2損傷組的LDH 含量明顯升高,約為對照組的4 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),而15μg/ml 冰片治療組,CMECs 內(nèi)LDH 含量明顯降低,較H2O2損傷組下降約59%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖4)。

圖4 冰片對LDH 含量的影響

5.冰片對H2O2損傷后CMECs 內(nèi)MDA 含量的影響：與對照組比較,H2O2損傷組的MDA 含量明顯升高,約為對照組的5.2 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而冰片治療后,細胞內(nèi)MDA 含量明顯降低,較H2O2損傷組下降約46%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖5)。

圖5 冰片對MDA 含量的影響

6.冰片對H2O2損傷后CMECs 內(nèi)NADP + /NADPH 的影響：與對照組比較,H2O2損傷后CMECs內(nèi)NADP + /NADPH 顯著升高,約為對照組的6 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而冰片治療后,細胞內(nèi)NADP + /NADPH 明顯降低,較H2O2損傷組下降約52%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖6)。

圖6 冰片對NADP + /NADPH 的影響

7.冰片對H2O2損傷后CMECs 內(nèi)GSH 及GSSG含量的影響：與對照組比較,H2O2損傷組的CMECs內(nèi)GSH 含量顯著降低,約為對照組的42%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖7);GSSG 含量顯著升高,約為對照組的4.6 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖8);而冰片治療后,CMECs 內(nèi)GSH 含量較前明顯升高,較H2O2損傷組提高約48%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖7);GSSG 含量明顯降低,較H2O2損傷組降低約33%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖8)。

圖7 冰片對GSH 含量的影響

圖8 冰片對GSSG 含量的影響

8.冰片對H2O2損傷后CMECs 內(nèi)基因表達的影響：與對照組比較,H2O2損傷后CMECs 內(nèi)FACL4 mRNA 表達增加,約為對照組的2.75 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);冰片減少FACL4 mRNA 的表達,較H2O2損傷組下降約45%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖9)。 與對照組比較,H2O2損傷組GPX4 mRNA表達減少,約為對照組的0.4 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);冰片治療組GPX4 mRNA 表達增加,較H2O2損傷組增加約70%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖10)。

圖9 冰片對FACL4mRNA 表達的影響

圖10 冰片對GPX4mRNA 表達的影響

9.冰片對H2O2損傷后CMECs 內(nèi)蛋白表達的影響：FACL4 及GPX4 表達水平詳見圖11。 與對照組比較,H2O2損傷組FACL4 表達增加,約為對照組的3.5 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);冰片治療組FACL4 表達減少,較H2O2損傷組下降約40%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖12)。 與對照組比較,H2O2損傷組GPX4 表達減少,約為對照組的0.5 倍,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);冰片治療組GPX4 蛋白表達較H2O2損傷組增加約70%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05,圖13)。

圖11 各組相關(guān)蛋白的表達

圖12 FACL4 的相對表達水平

圖13 GPX4 的相對表達水平

討 論

冰片是麝香保心丸中有效成分之一,是一種小分子脂溶性單萜類物質(zhì),幾乎不溶于水,因此將冰片溶于DMSO 中來增加溶解度,但DMSO 本身具有一定的毒性不良反應(yīng),本實驗證明了體積分數(shù)為0.1%的DMSO 對細胞活性不會產(chǎn)生毒性不良反應(yīng),因此后續(xù)實驗中冰片均溶解于0.1% 的DMSO 中。 關(guān)于冰片的毒性及安全性的研究數(shù)據(jù)尚不充分,本實驗結(jié)果提示冰片濃度達到50μg/ml 時,CMECs 細胞活力出現(xiàn)下降,20μg/ml 與15μg/ml 的冰片對細胞活力的保護作用基本相同,因此后續(xù)實驗冰片的治療濃度選為15μg/ml。 H2O2作為常見的氧化劑,可通過增加細胞膜通透性引起細胞損傷。 有研究表明,適當濃度的H2O2引起細胞DNA 單鏈斷裂而損傷,但這種損傷并不會引起細胞死亡,可通過堿基互補配對修復損傷[8]。 因此適當濃度的H2O2可誘導細胞氧化應(yīng)激損傷同時保留部分細胞活力,本實驗選用400μmol/L的H2O2作為CMECs 細胞損傷濃度。

線粒體是生物體內(nèi)能量代謝的主要場所,呼吸鏈反應(yīng)是產(chǎn)生活性氧自由基ROS 的主要渠道[9]。 NADPH 氧化酶作為線粒體呼吸鏈電子轉(zhuǎn)運的主要催化酶之一,主要存在于心血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中[10]。當氧化應(yīng)激反應(yīng)引起心肌細胞缺血再灌注損傷時,NADPH 氧化酶催化生成大量ROS,大量ROS 攻擊細胞膜脂質(zhì)雙分子層,發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng),分解產(chǎn)生MDA,因此MDA 的含量可間接反映氧化損傷的嚴重程度,體現(xiàn)心肌損傷及心肌缺血的嚴重程度[11]。

LDH 是糖酵解過程中的一種關(guān)鍵酶,在人體心肌、骨骼肌、肝臟、腎臟等組織和器官中廣泛存在,當心肌細胞嚴重損傷時,LDH 釋放入血,LDH 的升高程度可反映心肌細胞損傷的嚴重程度,可作為急性心肌梗死的一個輔助檢查指標。

鐵死亡是一種依賴鐵和ROS 的死亡方式,形態(tài)學特征表現(xiàn)為細胞核形態(tài)不變,線粒體體積減小,膜密度增加,外膜破裂,特點是脂質(zhì)過氧化[12]。 谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)是鐵死亡核心調(diào)控子,是判斷鐵死亡的參考標志,GPX4 的作用機制為特異性催化谷胱甘肽,將有害的過氧化物轉(zhuǎn)化為無毒性的脂質(zhì),從而減輕氧化應(yīng)激損傷。 有研究表明,細胞內(nèi)還原型谷胱甘肽GSH 的缺乏導致GPX4 失活,進一步導致鐵死亡,加重氧化應(yīng)激損傷[13]。

FACL4 基因編碼脂肪酸輔酶A 連接酶4,FACL4基因在大腦等組織中高度表達,可編碼產(chǎn)生多不飽和脂肪酸,在細胞膜磷脂代謝和維持細胞膜穩(wěn)態(tài)中起著重要作用[14]。 有研究顯示,FACL4 在原發(fā)性肝癌中高表達[15]。 FACL4 抑制劑TriacsinC 可作用于線粒體,使線粒體跨膜電位下降,引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放,進而釋放caspase 活化物,激活caspase 途徑,誘導肝癌細胞調(diào)亡。 本實驗結(jié)果提示,在過氧化損傷的CMECs 中,FACL4 基因表達水平顯著升高,可能與氧化反應(yīng)損傷線粒體細胞膜有關(guān)。

綜上所述,本實驗的結(jié)果顯示,CMECs 發(fā)生氧化應(yīng)激損傷后,MDA 和LDH 含量明顯升高,細胞內(nèi)抗氧化劑NADPH 和GSH 的含量明顯降低,而冰片治療后,MDA 和LDH 含量降低,抗氧化劑含量較前升高,說明冰片可能通過增加NADPH、GSH 等抗氧化劑的活性,減輕細胞的氧化應(yīng)激損傷,維持細胞內(nèi)氧化還原平衡。另外,細胞氧化損傷后,FACL4 基因表達升高,GPX4 表達降低,冰片治療可減少FACL4 基因的合成與表達,增加GPX4 基因合成表達,保護線粒體功能,維持細胞膜穩(wěn)定,減輕氧化應(yīng)激損傷。 關(guān)于冰片影響基因合成與表達方面的具體機制有待于進一步研究。