戴盼盼 張 鵬 陳申國(guó) 施更生 林海升

牙周炎是發(fā)生在牙支持組織的由牙菌斑中的微生物所引起的慢性感染性疾病,是中國(guó)成人失牙的首位原因[1]。 大量臨床研究表明,糖尿病患者牙周炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及嚴(yán)重程度更高,因而糖尿病性牙周炎成為了牙周病預(yù)防及治療中的難點(diǎn)和重點(diǎn),探討兩者的共同致病因素及作用靶點(diǎn)是目前研究的關(guān)鍵[2,3]。 甲基乙二醛(methylglyoxal,MG)是葡萄糖代謝的有毒產(chǎn)物,在糖尿病患者的血漿以及牙周炎患者的齦溝液中高濃度存在,遠(yuǎn)高于正常人水平[4]。 親環(huán)蛋白D(cyclophilin D, CypD)作為線粒體膜通透轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial membrane transition pore, mPTP)的重要組成蛋白,其激活后導(dǎo)致mPTP 的開放,進(jìn)而影響線粒體功能,最終細(xì)胞凋亡[5]。 目前,關(guān)于CypD 在MG誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡中的作用鮮見報(bào)道。 因此,本研究擬構(gòu)建MG 誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡模型,探討CypD 在其中的作用。

材料與方法

1.材料：α-MEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、TUNEL試劑盒購(gòu)自瑞士Roche 公司;CypD 一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司;β-actin 一抗購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司;二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;環(huán)孢菌素A (CsA)購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司;四甲基羅丹明乙酯(TMRM)、線粒體綠色熒光探針(Mitogreen)購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及處理：小鼠MC3T3-E1 細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù),將細(xì)胞培養(yǎng)于α-MEM 細(xì)胞完全培養(yǎng)基(含100U/ml 青霉素G 和100ng/ml 鏈霉素),待細(xì)胞長(zhǎng)至70% ～80% 融合時(shí)棄舊培養(yǎng)基,0.25%胰蛋白酶消化,按1 ∶3 比例進(jìn)行接種傳代,培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 細(xì)胞處理：對(duì)照組：α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)24h;MG 組：半數(shù)抑制濃度的MG 培養(yǎng)24h;CsA 組：1μmol/L CsA 培養(yǎng)25h;CsA +MG 組：1μmol/L CsA 預(yù)培養(yǎng)1h,再加入半數(shù)抑制濃度的MG 培養(yǎng)24h。

3.細(xì)胞存活率檢測(cè)：采用MTT 法進(jìn)行檢測(cè)。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后,調(diào)整細(xì)胞密度至105個(gè)/毫升的濃度接種于96 孔板中,鋪好板后,置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng),24h 后按實(shí)驗(yàn)分組加藥。細(xì)胞處理后吸棄孔內(nèi)原培養(yǎng)基,換成無(wú)血清培養(yǎng)基,每孔加入20μl 5mg/ml 的MTT,37℃、5%CO2培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)4h;吸棄上清液后每孔加入150μl DMSO,避光低速震蕩10min,酶標(biāo)儀490nm 檢測(cè)A值。 細(xì)胞存活率(%) =(各實(shí)驗(yàn)組A值-調(diào)零孔A值)/(對(duì)照組A值-調(diào)零孔A值) ×l00%。

4.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：采用TUNEL 染色法進(jìn)行檢測(cè)。 將細(xì)胞爬片取出,用4% 多聚甲醛溶液室溫固定1h,2 ～8℃下用體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100 和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%檸檬酸鈉的配液靜置2min,50μl 反應(yīng)液37℃避光孵育1h,用含有DAPI 的封片劑封片,正置熒光顯微鏡觀察拍照,計(jì)數(shù)300 個(gè)細(xì)胞計(jì)算凋亡率。

5.蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Western blot 法檢測(cè),將蛋白裂解超聲后高速離心機(jī)4℃1200r/min 離心取上清液,BCA 法檢測(cè)蛋白濃度,加入上樣緩沖液,將蛋白煮沸變性后上樣, SDS-PAGE 電泳分離,蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,脫脂奶粉室溫封閉1h,加入含一抗的稀釋液中(CypD 1 ∶2000,β-actin 1 ∶2000),4℃過(guò)夜。洗膜后加入二抗室溫孵育1h,化學(xué)發(fā)光成像儀曝光,掃描圖像并用image J 軟件分析灰度。

6.線粒體膜電位的檢測(cè)：采用TMRM 染色法進(jìn)行檢測(cè)。 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞低密度鋪板于24 孔板中,處理后用TMRM(終濃度100nmol/L)和Mitogreen(終濃度100nmol/L)37℃培養(yǎng)箱避光孵育30min,漂洗細(xì)胞兩次后用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察拍照,其中TMRM 用綠色熒光激發(fā),Mitogreen 用藍(lán)色熒光激發(fā)。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析以及LSD-t檢驗(yàn),計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.MG 對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的影響：圖1 MTT 結(jié)果表明,采用不同濃度的MG(100、200、400、600、800μmol/L)處理成骨細(xì)胞,24h 后可見MG 明顯抑制成骨細(xì)胞增殖活性,細(xì)胞活性分別為96.54%、90.22%、80.74%、50.86%、4.81%,表明MG 濃度越高,抑制作用越明顯。 此外,600μmol/L 的MG 處理后細(xì)胞活性達(dá)到半數(shù)抑制率,故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以該濃度作為處理?xiàng)l件。

圖1 不同濃度MG 對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響

2.MG 對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響：TUNEL 染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,600μmol/L 的MG 處理后陽(yáng)性染色率明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖2)。

圖2 MG 對(duì)成骨細(xì)胞凋亡的影響(TUNEL 染色, ×200)

3.MG 對(duì)CypD 蛋白表達(dá)的影響：Western blot 法檢測(cè)結(jié)果所示,MG 組CypD 蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,圖3)。

圖3 MG 對(duì)CypD 蛋白表達(dá)的影響

4.CypD 蛋白抑制劑CsA 對(duì)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用：MTT 結(jié)果表明,與MG 組比較,CsA 預(yù)處理能夠顯著恢復(fù)MG 對(duì)成骨細(xì)胞增殖活性的抑制,并且其單獨(dú)處理對(duì)細(xì)胞活性無(wú)影響(圖4)。 此外,TUNEL 結(jié)果顯示,CsA +MG 組較MG 組顯著減少了細(xì)胞陽(yáng)性染色率(圖4 中B、C)。

圖4 CypD 蛋白抑制劑CsA 對(duì)細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用

5.CypD 蛋白抑制劑CsA 對(duì)CypD 蛋白表達(dá)的影響：Western blot 法檢測(cè)結(jié)果表明,與MG 組比較,CsA預(yù)處理減少了CypD 蛋白的表達(dá)(圖5)。

圖5 CsA 對(duì)CypD 蛋白表達(dá)的影響

6.MG 對(duì)成骨細(xì)胞線粒體膜電位的影響：與對(duì)照組比較,MG 組電勢(shì)測(cè)定熒光探針染料TMRM 染色強(qiáng)度降低,而CsA 預(yù)處理后熒光強(qiáng)度部分恢復(fù)(圖6)。

圖6 MG 對(duì)成骨細(xì)胞線粒體膜電位的影響(TMRM 染色結(jié)果, ×200)

討 論

牙周炎是一種由微生物引發(fā)的慢性多因素炎癥性疾病,其特征是牙周組織被破壞,臨床表現(xiàn)為附著喪失、牙周袋、牙齦出血和牙槽骨吸收,其患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸增加[6]。 研究發(fā)現(xiàn),牙周炎與多種全身性疾病有關(guān),包括心血管疾病、2 型糖尿病、呼吸系統(tǒng)疾病、慢性腎病和代謝綜合征,其中以糖尿病相關(guān)性牙周炎發(fā)病最為密切[7]。 據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界成人糖尿病患者數(shù)已高達(dá)4.25 億,糖尿病患者得牙周炎概率明顯高于正常人,并且發(fā)病更早,進(jìn)展更迅速,癥狀更嚴(yán)重[8]。 Merchant 等[9]研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期牙周維護(hù)改善了2 型糖尿病伴牙周炎患者的血糖控制。 因此,探討糖尿病病理?xiàng)l件下糖尿病與牙周炎的共同致病因素及其作用靶點(diǎn)是目前研究的重點(diǎn)。

MG 是葡萄糖代謝的有毒產(chǎn)物,主要由糖酵解中間體、3-磷酸甘油醛和磷酸二羥基丙酮的低水平降解形成[10]。 糖尿病中MG 的異常積累導(dǎo)致蛋白糖基化增加,形成晚期糖基化終產(chǎn)物,是糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)展的一個(gè)重要致病因素[11]。 此外,研究證實(shí),牙周炎齦溝液中福賽斯坦納菌分泌高濃度的MG,與牙周炎的病程進(jìn)展密切相關(guān)[4]。 Settem 等[12]研究發(fā)現(xiàn),牙周組織中MG 誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子,導(dǎo)致牙槽骨的病理性骨喪失。 Retamal 等[13]研究證實(shí),MG 在牙周炎中的發(fā)病機(jī)制可能與誘導(dǎo)牙齦成纖維細(xì)胞凋亡以及膠原蛋白的變性有關(guān)。 本研究選用的MG 半數(shù)抑制濃度為600μmol/L,遠(yuǎn)小于牙周炎齦溝液中23mmol/L 的濃度,實(shí)驗(yàn)具有臨床意義。 根據(jù)MTT 及TUNEL 染色結(jié)果可見,MG 抑制成骨細(xì)胞增殖活性,并且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,與既往研究結(jié)果相符[12]。

線粒體是細(xì)胞的動(dòng)力工廠,其損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量生成障礙,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào),最終發(fā)生病理性凋亡,并且已有研究證實(shí)線粒體功能障礙與糖尿病性牙周炎密切相關(guān)[14,15]。 CypD 作為mPTP 的重要組成蛋白,在維持mPTP 開放及線粒體功能中發(fā)揮著重要作用。 在損傷應(yīng)激刺激下,mPTP 開放造成線粒體內(nèi)部離子平衡紊亂、線粒體腫脹、ATP 水平下降、凋亡活性物質(zhì)釋放入胞質(zhì),最終促使細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 化學(xué)性抑制或基因敲除CypD 均可有效恢復(fù)線粒體功能障礙介導(dǎo)的細(xì)胞損傷[16]。 Chen 等[17]研究發(fā)現(xiàn),小鼠實(shí)驗(yàn)組牙周炎伴隨著牙槽骨CypD 表達(dá)增加。 He等[18]研究證實(shí),CypD 與地塞米松引起的牙齦損傷有關(guān),體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),對(duì)CypD 阻斷可以減少牙齦上皮細(xì)胞線粒體活性氧的形成,恢復(fù)線粒體功能,從而減少細(xì)胞凋亡。 而CypD 與糖尿病相關(guān)牙周炎中成骨細(xì)胞凋亡的關(guān)系目前鮮見報(bào)道。

本研究通過(guò)Western blot 法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),MG 導(dǎo)致成骨細(xì)胞CypD 蛋白表達(dá)增加,說(shuō)明CypD 很可能參與了MG 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。 因此,筆者采用其特異性抑制劑CsA 進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)CsA 在減少CypD 蛋白表達(dá)的同時(shí),顯著恢復(fù)了成骨細(xì)胞的增殖活性以及減少細(xì)胞凋亡,說(shuō)明CypD 與MG 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證CypD 的調(diào)控作用是否與線粒體功能有關(guān),筆者檢測(cè)了線粒體膜電位。 如圖6 所示,與MG 組比較,CsA 預(yù)處理可以緩解MG對(duì)線粒體膜電位的抑制作用,因此,筆者認(rèn)為,CypD是通過(guò)調(diào)控線粒體功能來(lái)介導(dǎo)MG 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究認(rèn)為MG 可能通過(guò)上調(diào)CypD表達(dá),抑制線粒體功能,進(jìn)而誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡,這將為防治糖尿病性牙周炎牙槽骨吸收提供新的靶點(diǎn)。